胡益 黃鈞濤 施云斌 沈毅

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）包括口腔、口咽、下咽和喉的惡性腫瘤。全球每年有超過830 000人被診斷患有HN‐SCC，超過430 000例患者死于這種疾病[1-2]。手術(shù)、放療和化療的多模式治療策略是治療HNSCC最常用的臨床手段[2]。近年來，隨著免疫抑制劑以及分子靶向藥物研究的深入，復(fù)發(fā)性及轉(zhuǎn)移性HNSCC的治療策略變得更加多樣化和復(fù)雜化。為了輔助診斷、制定個性化的治療方案，開發(fā)新的生物標(biāo)志物以準(zhǔn)確預(yù)測HN‐SCC患者的預(yù)后至關(guān)重要。研究報道，通過觸發(fā)包括未折疊蛋白（unfolded protein response,UPR）反應(yīng)在內(nèi)的一系列適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)，癌細(xì)胞可以適應(yīng)營養(yǎng)、氧氣缺乏相關(guān)的微環(huán)境限制，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白穩(wěn)態(tài)[3-4]。未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行糖基化，其中糖蛋白上的聚糖鏈通過天冬酰胺的酰胺基與多肽鏈共價相連形成的N-糖基化參與蛋白質(zhì)折疊和質(zhì)量控制，為精確指導(dǎo)蛋白質(zhì)底物折疊和質(zhì)量控制系統(tǒng)提供模板，因此，N-糖基化被認(rèn)為與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸密切相關(guān)[5-6]。另外，研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)低糖基化是激發(fā)UPR反應(yīng)的途徑之一，而寡糖組裝徑路的缺陷或寡糖轉(zhuǎn)移酶亞基的突變是誘發(fā)UPR反應(yīng)的重要因素。寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物非催化亞基（oligosaccha‐ride transferase complex non-catalytic subunit,OSTC）可與寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的催化亞基（STT3a）相結(jié)合組成寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（oligosaccharide transferase，OST）[7-8]。近年來，較多的研究強調(diào)了OST亞基基因突變引起的人類疾病，包括其在多種腫瘤中的異常表達，進而誘導(dǎo)腫瘤增長、凋亡、遷移、侵襲等行為[5,9-10]。然而，OSTC在HNSCC中的表達及其與疾病的病理特征、預(yù)后的關(guān)系尚不明確。本文通過數(shù)據(jù)挖掘分析OSTC對HNSCC預(yù)后及免疫治療的影響，以期為后續(xù)研究OSTC基因在HNSCC發(fā)生、發(fā)展中的作用提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 OSTC在HNSCC中的表達情況及與患者預(yù)后的關(guān)系分析 使用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫（http：//timer.cistrome.org）分析OSTC在不同腫瘤中的表達情況，對TCGA數(shù)據(jù)庫中TCGA-HNSC隊列的504例腫瘤樣品及44例正常癌旁組織樣品進行差異分析，分析其OSTC的表達差異。根據(jù)OSTC表達量的中位數(shù)，將TCGA-HNSC隊列的腫瘤樣品分為高表達組和低表達組，采用Survival和Survminer R軟件包進行Kaplan-Meier分析，評估OSTC高表達組、低表達組在總體預(yù)后及無進展生存期的差異。

1.2 OSTC表達量與HNSCC患者臨床特征的關(guān)系分析 分析OSTC高表達組、低表達組的臨床特征（包括年齡、性別、腫瘤分級、臨床分期、T分期、N分期）差異，并繪制熱圖及箱式圖。

1.3 構(gòu)建預(yù)后預(yù)測列線圖 采用單因素聯(lián)合多因素Cox預(yù)后分析臨床病理特征及OSTC表達量對預(yù)后的影響。當(dāng)某項因素在兩種分析中均P＜0.05時，可以認(rèn)為該特征是預(yù)后的獨立影響因素，隨后以此構(gòu)建預(yù)后預(yù)測列線圖。采用校準(zhǔn)曲線分析1、3、5年生存的預(yù)測可靠性。

1.4 生物學(xué)功能分析 使用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）算法，通過它們在生物學(xué)功能和信號通路富集差異來識別并揭示HNSCC患者中OSTC高表達組、低表達組信號通路的差異,分析確定OSTC參與的生物學(xué)過程及功能。

1.5 免疫微環(huán)境分析 通過CIBERSORT算法對腫瘤免疫細(xì)胞浸潤情況進行量化，采用Spearman秩相關(guān)分析免疫細(xì)胞浸潤與OSTC表達的關(guān)系，分析OSTC與免疫檢查點基因表達量的相關(guān)性，使用estimate包對腫瘤樣品免疫微環(huán)境打分，并分析其在不同表達組間免疫微環(huán)境的差異。此外，分析OSTC表達量與免疫檢查點基因表達的相關(guān)性，預(yù)測其免疫治療效果。

1.6 免疫治療及化療療效預(yù)測 通過分析TCIA數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)評估OSTC高表達組、低表達組使用的程序性死亡受體 1（programmed cell death protein 1，PD-1）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4,CTLA-4）治療的療效差異，采用免疫表型評分（immunophenoscore，IPS）評估。使用 pRRophetic包計算4種HNSCC常用化療藥（順鉑、紫杉醇、多西他賽、吉西他濱）的藥物50%抑制濃度（half maximal in‐hibitory concentration，IC50），評估高表達組、低表達組對化療藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 OSTC在HNSCC中的表達情況及與患者預(yù)后的關(guān)系 TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫顯示OSTC在HNSCC、浸潤性乳腺癌、膀胱移行細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、肺腺癌等多種腫瘤組織中表達值明顯高于正常組織，見圖1a（插頁）。TCGA數(shù)據(jù)庫中TCGA-HNSC隊列的504例HNSCC腫瘤樣品及44例正常癌旁組織樣品差異分析結(jié)果顯示OSTC在HNSCC中表達水平明顯升高（P＜0.05），見圖1b（插頁）。對OSTC高表達組、低表達組進行Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示，OSTC表達水平與HNSCC患者的總生存時間（overall survival，OS）及無進展生存時間（progression free survival,PFS）均明顯相關(guān)（均P＜0.05），低表達組預(yù)后更好，見圖1c-d（插頁）。

圖1 OSTC基因表達與臨床相關(guān)性分析（a:OSTC基因在所有主要腫瘤與相應(yīng)正常組織的差異表達情況；b：OSTC基因在HNSCC與相應(yīng)正常組織的差異表達情況；c:OSTC表達水平與HNSCC患者OS的關(guān)系；d:OSTC表達水平與HNSCC患者PFS的關(guān)系）

2.2 OSTC表達量與HNSCC患者臨床特征的關(guān)系 對HNSCC樣本的臨床病理特征進行亞組分析，結(jié)果顯示，OSTC的表達量與HNSCC患者腫瘤分級、臨床分期、T分期、N分期明顯相關(guān)（均P＜0.05），而與年齡、性別無明顯相關(guān)性（均P＞0.05），見圖2。

圖2 不同臨床特征分組的HNSCC患者OSTC表達水平（a:OSTC表達與臨床特征差異熱圖；b、c、d、e、f、g：分別為不同年齡、性別、腫瘤分級、臨床分期、T分期、N分期的患者OSTC表達差異分析箱式圖）

2.3 預(yù)后預(yù)測列線圖 單因素Cox及多因素Cox分析表明，OSTC基因表達量HR值分別為1.549（95%CI：1.180～2.033）和 1.444（95%CI：1.093～1.907），具有較好的預(yù)測效能。此外，HNSCC患者的年齡和N分期也可認(rèn)為是影響最終預(yù)后的獨立預(yù)后因素，隨后以此3項特征構(gòu)建預(yù)后預(yù)測列線圖。通過校準(zhǔn)曲線分別分析1、3、5年的預(yù)測可靠性，提示預(yù)測結(jié)果與實際觀察結(jié)果具有一致性。見圖3。

圖3 預(yù)后預(yù)測列線圖（a:單因素Cox分析；b:多因素Cox分析；c:預(yù)后預(yù)測列線圖;d：校準(zhǔn)曲線）

2.4 OSTC基因生物學(xué)功能富集分析結(jié)果 OSTC低表達組主要富集在基于免疫受體體細(xì)胞重組的適應(yīng)性免疫反應(yīng)、B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、B細(xì)胞受體信號通路、補體激活、循環(huán)免疫介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)等，提示低表達與免疫治療密切相關(guān)；而基于KEGG的信號通路富集分析提示OSTC高表達組主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)通路、focal adhesion信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等通路上，低表達組主要富集在嗅覺傳導(dǎo)通路及免疫缺陷信號通路。

2.5 免疫微環(huán)境分析結(jié)果 OSTC表達量與漿細(xì)胞、活化CD4+記憶T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和Tregs細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)，上述免疫細(xì)胞在低表達組富集更多。OSTC與細(xì)胞程序性死亡蛋白1（programmed cell death pro‐tein 1,PDCD1）、CD244、CD27表達量呈負(fù)相關(guān)。低表達組免疫評分更高，而高表達組細(xì)胞外基質(zhì)評分更高，兩組整體ESTIMATE評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4（插頁）。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，或可認(rèn)為OSTC低表達患者可能對免疫治療更敏感。

圖4 免疫微環(huán)境分析（a:免疫細(xì)胞浸潤比較;b：OSTC表達量與免疫細(xì)胞的相關(guān)性；c:OSTC表達量與免疫檢查點基因的相關(guān)性；d:高表達組、低表達組間免疫評分、細(xì)胞外基質(zhì)評分、ESTIMATE評分的比較）

2.6 OSTC表達與免疫治療及化療療效預(yù)測分析 通過分析TCIA數(shù)據(jù)庫中IPS，OSTC低表達組PD-1、CT‐LA4+PD-1的IPS更高，且均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），對于CTLA4治療，兩組IPS比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示低表達組對PD-1和CTLA4+PD-1治療更為敏感。順鉑、紫杉醇在OSTC高表達組的IC50值較低，提示高表達組患者可能對順鉑、紫杉醇化療具有較高的藥物敏感性。然而，多西他賽及吉西他濱在兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖5。

圖5 OSTC表達與免疫治療及化療療效分析（a：PD-1、CTLA4療效比較；b:4種化療藥物療效比較）

3 討論

HNSCC由于確診晚、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移、治療抵抗等特性，患者5年生存率較低。目前，大多數(shù)HNSCC患者的基本治療仍然以手術(shù)、放化療為主。然而，常用化療藥物如西妥昔單抗由于耐藥性僅顯示出中等療效[2]。最新的派姆單抗的免疫療法通過阻斷PD-1/程序性死亡配體-1（programmed death ligand 1，PD-L1）信號通路來激活T淋巴細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞生長，為晚期、轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性HNSCC患者帶來新的希望[11-13]。目前，基于對HNSCC免疫生物學(xué)的理解，研發(fā)新的生物標(biāo)志物來改善HNSCC患者的臨床管理，包括更好的預(yù)后評估和疾病監(jiān)測將是開發(fā)更有效、毒性更小、特異性更高的靶向治療的關(guān)鍵。

N-連接糖基化是真核細(xì)胞中重要的蛋白質(zhì)修飾。研究發(fā)現(xiàn)，與鄰近正常組織相比，腫瘤組織中通常表現(xiàn)出廣泛的糖基化改變。寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物通過催化預(yù)組裝的寡糖從脂聯(lián)寡糖供體轉(zhuǎn)移到糖基化受體位點（通常為N-X-T/S，其中X≠P）或新合成蛋白質(zhì)序列子的天冬酰胺殘基上[3]。目前已知的OST復(fù)合物由12個亞基組成，其中多個亞基被證明在腫瘤發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著不同的作用[14-15]。Takahashi等[16]發(fā)現(xiàn)核糖體結(jié)合蛋白2（ribophorin2，RPN2）可以通過失活糖原合酶激酶-3b來穩(wěn)定突變體p53，RPN2的過表達可促進乳腺癌的生長。同樣，Ding等[17]發(fā)現(xiàn)核糖體結(jié)合蛋白1敲低可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲。Shibatani等[18]通過藍原生聚丙烯酰胺凝膠電泳解離核糖體相關(guān)膜蛋白后，首次證實了OSTC為OST復(fù)合物的新亞基。而后，Xie等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-1307通過鈣網(wǎng)蛋白（cal‐reticulin,CALR）-OSTC-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊途徑引起細(xì)胞周期蛋白失衡，進而導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，最終誘發(fā)腫瘤。另外通過CALR-OSTC-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊途徑，miR-1307可影響癌蛋白和蛋白激酶（H-ras、PKM2和PLK1）的活性，從而促進肝癌的增殖發(fā)展，同時驗證試驗明確CALR敲低和過量OSTC都消除了miR-1307在肝癌中的致癌功能。

本研究首先通過TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫分析癌組織與相應(yīng)的正常組織中OSTC基因的表達量，發(fā)現(xiàn)OSTC在多種癌組織中均有表達上調(diào)的現(xiàn)象。筆者重點關(guān)注到OSTC在HNSCC組織中表達異常。進一步通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中HNSCC的臨床病理參數(shù)OSTC表達水平與HNSCC患者的OS及PFS的關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)OSTC高表達導(dǎo)致了HNSCC患者更差的預(yù)后。臨床病理特征亞組比較表明，除年齡、性別亞組（可能由低病例樣本引起）外，其余亞組與腫瘤預(yù)后均有相關(guān)性。基于上述結(jié)果，筆者認(rèn)為這種新的預(yù)后預(yù)測列線圖具有較高的預(yù)測價值。

CD8+T細(xì)胞作為獲得性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵參與者，可通過PD-1/PD-L1免疫抑制軸消除腫瘤細(xì)胞、破壞免疫耐受并增強免疫治療反應(yīng)[20]。Hanna等[21]發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞高浸潤對于頭頸癌患者抗PD-1/PD-L1治療更有效。Nguyen等[22]發(fā)現(xiàn)OS和無復(fù)發(fā)生存期與較高表達的CD4+和CD8+呈正相關(guān)。通過研究免疫細(xì)胞浸潤情況及相關(guān)分析，本研究發(fā)現(xiàn)OSTC低表達組表現(xiàn)出更多的免疫細(xì)胞浸潤，尤其是CD8+T細(xì)胞，且OSTC表達量與CD8+、活化CD4+記憶T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，認(rèn)為OSTC的表達量可能可預(yù)測HNSCC免疫治療效果。GSEA分析也提示OSTC低表達組主要富集在免疫受體細(xì)胞重組等多條體液免疫反應(yīng)相關(guān)性通路，另外，通過分析TCIA數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)對PD-1和CTLA4的療效比較也支持了OSTC低表達組表現(xiàn)出更好的免疫治療反應(yīng)。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，OSTC的低表達可能增強HNSCC患者對免疫治療的反應(yīng)，可作為預(yù)測免疫治療效果的一種潛在生物學(xué)標(biāo)志。免疫治療效果較差的OSTC高表達組則表現(xiàn)出對順鉑、紫杉醇化療藥物的高敏感性，對于免疫效果治療不佳的患者提供了其他治療思路。

本研究尚有不足，盡管通過數(shù)據(jù)挖掘分析探究了OSTC作為一種HNSCC發(fā)病驅(qū)動基因的可能性，但尚缺乏相關(guān)實驗數(shù)據(jù)支撐。因此仍需進一步實驗設(shè)計以全面評估OSTC表達與HNSCC患者臨床病理特征之間的關(guān)系。

綜上所述，OSTC有望成為HNSCC免疫治療的一個新的生物標(biāo)志物，為后續(xù)HNSCC的預(yù)后評估和疾病診治提供重要的參考價值。