易封萍，馬 寧，朱建才

（上海應用技術(shù)大學香料香精技術(shù)與工程學院，上海 201418）

白酒是世界上最古老、消費最多的蒸餾酒之一，是中華民族的智慧結(jié)晶、傳承瑰寶[1]。白酒通常由高粱或小麥、大麥、玉米、大米和高粱的混合物制成。中國白酒不同的酒曲、發(fā)酵和蒸餾過程產(chǎn)生大量化合物。由于地域和釀造工藝的不同，中國白酒已發(fā)展到包括醬香、濃香、清香、米香、鳳香、特香、芝麻香、老白干香、豉香、馥郁香、藥香和兼香的12大香型[2]。醬香型白酒是中國最著名的白酒之一，傳統(tǒng)醬香型白酒的釀造過程分7個輪次取酒，每個輪次酒體風味各不相同。其中，3、4、5輪次酒是輪次酒中酒質(zhì)最優(yōu)的，在此階段酒醅中的醇醛酸酯含量達到相對平衡，呈協(xié)調(diào)醬香味[3]。由于醬香型白酒生產(chǎn)工藝的獨特性，賦予白酒獨特的醬香、焦香、烘烤香和果香，口感柔順、醇甜、持久[4-5]，深受廣大消費者的認可和青睞。

香氣是中國白酒的重要特征，是影響白酒質(zhì)量和消費者接受度最重要的感官成分之一[6]。白酒的主要成分是乙醇和水，占比約為98%，而2%的微量成分（酯類、醇類、醛類、酸類、吡嗪類、呋喃類和含硫化合物等物質(zhì)）是決定白酒風味、口感和風格的關鍵成分[7-9]。其中，揮發(fā)性含硫化合物是影響白酒風味的重要香氣活性化合物。含硫化合物具有極低的閾值和強烈的香氣強度而對白酒香氣具有重要貢獻。含硫化合物廣泛存在于白酒中，如醬香型白酒[1]、烤芝麻香型白酒[6]、老白干香型白酒[10]等。如Yan Yan等[1]在醬香型白酒中鑒定出甲硫醇、二甲基硫醚、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚等19種揮發(fā)性含硫化合物。Sha Sha等[6]在烤芝麻香型白酒中鑒定出S-硫代乙酸甲酯、2-糠硫醇、3-(甲硫基)丙酸乙酯等8 種含硫化合物，對烤芝麻香型白酒有潛在的重要作用。

為了鑒定特征香氣成分，氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）、香氣活性值（odor activity value，OAV）、香氣重組等研究方法應運而生，并大量應用于各種香型白酒、肉制品、奶酪制品、水果等物質(zhì)的特征香氣鑒定中[1,8,11-14]。然而這些方法并沒有考慮香氣成分之間的相互作用。但事實上香氣成分之間是存在復雜的協(xié)同、掩蓋、加成等作用。如果忽略了香氣成分之間的相互作用，會造成特征香氣鑒定時并不完全準確。因此，香氣之間的感官交互作用研究顯得更為重要，可以有效地驗證香氣成分對整體香氣的貢獻。目前，對習酒的研究主要集中在香氣成分的簡單鑒定[15-16]，對硫化物等特征香氣成分鑒定方面的研究較少。

本研究對醬香型習酒系列產(chǎn)品（習酒藍（Y1）、習酒印象貴州（Y2）、習酒銀質(zhì)（Y3））的特征風味成分進行研究。本研究利用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、氣相色譜-硫磷檢測器（gas chromatography-flame photometric detection，GC-FPD）對習酒中的香氣成分進行定性、定量分析；采用GC-O和OAV相結(jié)合的方法，鑒定出習酒特征香氣成分；應用香氣重組對特征香氣成分進行驗證。再利用S型曲線法對習酒中含硫化合物與酯類化合物之間的香氣協(xié)同作用進行研究。最后采用偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）法研究醬香型習酒中關鍵致香物質(zhì)與感官屬性之間的相關性。為推動醬香型習酒的發(fā)展提供理論依據(jù)和方法借鑒，同時為白酒風味特征的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香型習酒系列酒（習酒藍（Y1）、習酒印象貴州（Y2）、習酒銀質(zhì)（Y3）），乙醇體積分數(shù)均為53%，每瓶500 mL，均于2018年產(chǎn)自貴州茅臺酒廠習酒有限責任公司。所有酒樣貯存于4 ℃環(huán)境中。

氯化鈉、二氯甲烷、無水乙醇、無水硫酸鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；2-辛醇、二丙基二硫醚、乙酸乙酯、乙酸丙酯、丙酸乙酯、丙酸丙酯、2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、丁酸丁酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、己酸丙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、十四酸乙酯、十六酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乳酸乙酯、乳酸丁酯、乙酸芐酯、苯乙酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、乙酸苯乙酯、2-糠酸乙酯、乙酸糠酯、乙酰丙酸乙酯、丁二酸二乙酯、丙醇、丁醇、3-甲基丁醇、正戊醇、正庚醇、正辛醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基-1-己醇、苯甲醇、苯乙醇、乙酸、丙酸、2-甲基丙酸、丁酸、3-甲基丁酸、正戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、苯甲酸、苯乙酸、2-甲基丙醛、己醛、苯甲醛、2-乙?；秽?、5-甲基糠醛、5-甲基-2-乙?；秽?、糠醇、糠醛、2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮、3-辛酮、2-十一酮、3-羥基-2-丁酮、苯乙酮、2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、3-甲基噻吩、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、丙硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇、二甲基三硫醚、2-噻吩甲醛、4-甲基-5-乙烯基噻唑、3-巰基-1-己醇、苯并噻唑、γ-丁內(nèi)酯、γ-庚內(nèi)酯、γ-壬內(nèi)酯、香蘭素、2-乙?；量?、乙酸-3-(甲硫基)丙酯 美國Adamas試劑有限公司；苯乙醛、2-正丁基呋喃、2-丁醇、2-甲基丙醇、反-4-癸烯酸乙酯 百靈威科技有限公司；2-乙基-6-甲基吡嗪 美國Achemblock公司；乙醛、2,5-二甲基噻吩、3-巰基-3-甲基-1-丁醇、3-巰基己基乙酸酯、C7～C30正構(gòu)烷烴標準品 Sigma-Aldrich（上海）有限公司。所有標準品純度均在98%以上。

1.2 儀器與設備

GC7890A-MS5975 GC-MS聯(lián)用儀、FPD、HPInnowax極性柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、DB-5非極性柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；ODP-2嗅聞儀 德國Gerstel公司；MultiVap-10多通道平行濃縮儀 北京萊伯泰科儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 液液萃取

分別將3種醬香型習酒樣品（50 mL）用去離子水稀釋至體積分數(shù)10%，再向其中加入氯化鈉固體顆粒至飽和，將該飽和溶液倒入分液漏斗中。向分液漏斗溶液中加入1 mL的2-辛醇（400 mg/L），用二氯甲烷分別萃取該溶液3 次（20、20、10 mL），同時將萃取出的溶液用100 mL圓底燒瓶收集。萃取完成后，在圓底燒瓶中加入無水硫酸鈉至燒瓶1/3處，靜置過夜。最后，用氮吹儀將萃取物濃縮至200 μL并貯存于-20 ℃冰箱中，直接進樣1 μL。

1.3.2 GC-MS參數(shù)設置

GC條件：HP-Innowax極性柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）和DB-5非極性柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流模式，載氣為氦氣（99.999%），流速為1 mL/min。升溫程序：初始溫度40 ℃并保持6 min，然后以3 ℃/min升溫至100 ℃，最后以5 ℃/min升溫至230 ℃，并保留10 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；MS傳輸線溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍30～450 u。

1.3.3 FPD參數(shù)設置

采用7890A型GC儀和5380 FPD進行含硫化合物的測定。其中2 根色譜柱和升溫程序參考1.3.2節(jié)。進樣口溫度和FPD溫度分別為250 ℃和200 ℃，光電倍增管電壓為500 V。氫氣流量為20 mL/min。載氣為氮氣，流量為1.0 mL/min。

1.3.4 定性定量分析

通過對照質(zhì)譜庫（NIST11.L）、自建庫、標準品保留時間、保留指數(shù)和香氣描述（http://www.thegoodscentscompany.com）等信息對醬香型習酒中香氣成分進行定性。通過標準曲線法對醬香型習酒中的香氣成分進行定量分析。根據(jù)構(gòu)建的香氣成分外標定量曲線計算香氣化合物的含量。配制體積分數(shù)10%乙醇溶液作為標準曲線模型溶液，加入適當濃度（一般高于半定量濃度10～20 倍）待測物標準品，再進行梯度稀釋，配制成標準化合物溶液，分析條件與酒樣的分析條件相同。質(zhì)譜采用選擇性離子檢測：每個物質(zhì)選擇一個定量離子。內(nèi)標的定量離子質(zhì)荷比選為45。在待測組分的標準曲線中，橫坐標x代表濃度比（香氣成分濃度/內(nèi)標濃度，Cx/Ci），縱坐標y代表峰面積比（香氣成分峰面積/內(nèi)標峰面積，Ax/Ai）。所有實驗分別重復3 次。

1.3.5 GC-O條件

采用7890A型GC儀，配有ODP-2嗅覺檢測器端口析。此系統(tǒng)能夠同時獲得氫火焰離子化檢測器信號和嗅探口檢測到的每種化合物的香氣特征。GC流出物在氫火焰離子化檢測器和嗅探口中按1∶1比例進行分離。載氣為氮氣，流速為2 mL/min。采用HP-Innowax極性柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）。升溫程序與GC-MS參數(shù)設置一致，進樣口溫度250 ℃，采用不分流進樣模式，解吸時間3 min。潮濕的空氣以50 mL/min流速進入嗅探口。

選取13 名（7 女6 男，23～33 歲）有嗅聞經(jīng)驗的人員組成感官評價小組，13 名感官評價員在感官分析之前都需要經(jīng)過培訓，以便熟悉各種氣味描述。13 名小組成員快速準確的記錄揮發(fā)性香氣化合物從嗅探口中感受到流出物的開始和結(jié)束時間，并記錄流出物的香氣特征和強度值。其中強度值用“0～10”分進行評價，“0 分”為無氣味、“5 分”為中等強度、“10 分”為極端強度。每個實驗重復3 次，最后取平均值即為流出物的香氣強度。

1.3.6 感官分析

根據(jù)相關研究報道的方法[17]，由13 名有嗅聞經(jīng)驗的感官評價員（6 名男性和7 名女性，年齡在23～33 歲）組成感官評價小組，對醬香型習酒樣品的香氣輪廓進行定量描述性感官分析。所選的感官評價員具有良好的氣味感知能力和感官評價經(jīng)驗。感官評價在25 ℃室溫條件下進行，對酒樣進行多次重復感官品評，盡可能多地描述出每個酒樣的感官屬性，經(jīng)過反復討論和篩選，確定主要的香氣屬性為“烘烤香”“果香”“甜香”“醬香”“酸香”“花香”和“硫化物氣息”7個香韻。7個香韻的感官描述和參比樣根據(jù)范文來[18]、Guo Xiangyang[19]等以及本課題組之前的研究[14,20]確定?！昂婵鞠恪钡母泄倜枋鰹轭愃坪婵竟任镱?、堅果類的香氣特征，參比樣為1 mg/L 2,5-二甲基吡嗪的10%乙醇溶液；“甜香”的感官描述為類似糖果樣香氣，參比樣是1 mg/Lβ-大馬仕酮的10%乙醇溶液；“果香”的感官描述為類似水果香氣，參比樣為1 mg/L丁酸乙酯、己酸乙酯的10%乙醇溶液；“醬香”的感官描述為類似傳統(tǒng)醬制品的香氣特征，參比樣為1 mg/L 3-(甲硫基)丙醛的10%乙醇溶液；“花香”的感官描述為類似于植物花朵香氣特征，參比樣為1 mg/L苯乙醇的10%乙醇溶液；“酸香”的感官描述為似醋的、汗臭的特征香氣，參比樣為食用陳醋；“硫化物氣息”的感官描述為類似大蒜、洋蔥的特征香氣，參比樣為1 mg/L二甲基三硫醚的10%乙醇溶液。感官實驗采用10 點打分制（0～10 分），其中“0”代表沒有嗅聞到該香氣，“5”代表中等強度，“10”代表香氣強度很強。結(jié)果取13個感官評價員打分的平均值。所有感官評價實驗重復3 次。

1.3.7 氣閾值檢測及OAV

以Czerny等[21]的方法為基礎，香氣化合物的嗅覺閾值通過3 點選配法在體積分數(shù)53%乙醇溶液中檢測到。在測試開始之前，告知小組成員每種香氣化合物的香氣特征并給予標準溶液感受其香氣特征。在實驗中，小組成員對每種香氣化合物進行10 次3 點選配法測試，以2為稀釋倍數(shù)，小組成員從最高濃度開始嗅聞。在3個樣品瓶中有一個含有待測物組分，2個對照樣品，如果小組成員可以在3個樣品中識別出含有香氣化合物的樣品，則測試下一個低濃度的樣品，以此類推直到不能正確辨別為止。所有實驗重復3 次。通過計算感官小組嗅聞到的正確識別概率p，進一步校正，校正公式為P=（3×p-1）/2（其中P為正確識別概率的校正值，p為實際測得的正確識別概率值），繪制以香氣化合物的質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標，以正確識別概率的校正值P為縱坐標的曲線。將上述10 個數(shù)據(jù)點，應用S型曲線P=1/（1+e（-（X-C）/D））進行擬合。當縱坐標P=0.5時，對應的橫坐標為溶液閾值[22]。Sigma Plot 12.5（SYSTAT，London，UK）軟件用于圖形解析，方差分析用于非線性回歸。

每個香氣化合物對整體的貢獻通過OAV進行評估，OAV是在乙醇溶液中香氣化合物的質(zhì)量濃度與其嗅覺閾值的比率。OAV＞1，表示該物質(zhì)對總體香氣有貢獻，OAV＜1，表示該物質(zhì)對總體香氣無實質(zhì)性貢獻，一般來說，OAV越大則說明該物質(zhì)對總體香氣貢獻越大。

1.3.8 醬香型習酒香氣重組

通過香氣重組進一步確認香氣強度法和OAV法篩選出的關鍵香氣化合物（OAV≥1）對于醬香型習酒整體香氣有重要貢獻。分別以Y1、Y2、Y3為研究對象，基質(zhì)為53%乙醇溶液，把篩選出的關鍵香氣化合物按其在習酒中的實際濃度重組習酒模型溶液。重組液與酒樣相似性描述與感官分析一樣，采用10 點打分制，感官數(shù)據(jù)通過SPSS 20.0（SPSS Inc., Chicago, IL）進行單因素方差分析。

1.3.9 含硫化合物與酯類之間的協(xié)同作用

感官小組利用三點選配法在白酒基質(zhì)中對單一香氣化合物和二元混合物的嗅覺閾值進行檢測（參考1.3.7節(jié)）。二元混合物按照習酒中的定量濃度進行混合。Feller加和模型用于評估香氣化合物之間的感官交互作用。二元混合物的檢測概率P(AB)定義如下：P(AB)=P(A)+P(B)-P(A)P(B)，其中，P(A)、P(B)分別為對應濃度下香氣化合物A與B的檢測概率，最后二元混合物相互作用通過實測概率與理論概率的比得到。如果混合物的實測閾值概率低于理論閾值概率，則發(fā)生掩蓋作用；若混合物的實測閾值概率高于理論閾值概率，則發(fā)生加成或協(xié)同作用；若混合物的實測閾值概率等于理論閾值概率，則發(fā)生折中作用。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計分析軟件對不同醬香型習酒中含量、香氣強度值及感官的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA）；采用TBtools軟件（Dr Chengjie Chen,Guangzhou, China）[23]繪制習酒系列酒芳香化合物種類及含量差異熱圖；采用Sigma Plot 12.5（SYSTAT，London，UK）分析酯類化合物與含硫化合物之間的感官交互作用；PLSR分析采用Unscrambler 9.7軟件（CAMO ASA, Oslo, Norway）對3種習酒樣品和3個重組酒樣與關鍵香氣化合物、感官屬性進行多元統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 液液萃取-GC-O鑒定醬香型習酒特征香氣成分

如表1所示，通過香氣描述、保留指數(shù)、標準品等3種方法綜合定性分析，在3種醬香型習酒中分別鑒定出62、59、62 種香氣成分。通過計算香氣強度評價各香氣活性物質(zhì)對香氣的貢獻程度，不同習酒樣品之間的香氣強度值存在差異，香氣強度值范圍為0.9～9.2。在習酒藍（Y1）中己酸乙酯具有最高的香氣強度值（8.9），而十二酸乙酯呈現(xiàn)最小的香氣強度值（0.9）；在習酒印象貴州（Y2）中，己酸乙酯具有最高的香氣強度值（9.1），而戊醇（0.9）和2-糠酸乙酯（0.9）同時呈現(xiàn)較小的香氣強度值；在習酒銀質(zhì)（Y3）中，己酸乙酯具有最高的香氣強度值（9.2），而十二酸乙酯呈現(xiàn)最低的香氣強度值（0.9）。結(jié)果表明，在3個習酒樣品中，己酸乙酯都具有最強的香氣強度值，呈現(xiàn)出果香、甜香，對醬香型習酒的香氣具有重要貢獻。丁酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、苯乙酸乙酯、2-正丁基呋喃、丁酸、3-羥基-2-丁酮也具有相對較高的香氣強度值，是酒樣中重要的香氣貢獻成分，酯類主要提供“果香、花香”氣息，丁酸提供“酸香”氣息，2-正丁基呋喃提供“焦甜香”氣息，3-羥基-2-丁酮提供“白脫”氣息。

從表1也可以看出，丙硫醇（香氣強度值5～5.5）、2-甲基-3-呋喃硫醇（香氣強度值4.5～5.5）、二甲基三硫醚（香氣強度值2.8～3）、3-巰基-1-己醇（香氣強度值3.7～4）等含硫化合物，同樣具有相對較高的香氣強度值，對白酒香氣也具有重要貢獻。其中二甲基三硫醚廣泛存在于中國各種香型的白酒、日本清酒中[6,10,24]，具有“爛白菜、硫化物”的香氣特征。2-甲基-3-呋喃硫醇（香氣強度值4.5～5.5）由于其較低的嗅覺閾值已被鑒定為老白干香型白酒[10]和葡萄酒[25]中的關鍵香氣化合物。除上述成分外，還檢測出6 種未知香氣成分，其保留指數(shù)分別為1 055、1 233、1 270、1 616、1 721、1 886，分別具有“豆腥味”“焦甜烘烤”“香蕉果皮”“青香、果香”“烘烤香、堅果”“醬咸菜、硫化物”等香氣特征。這些未知物的香氣強度值范圍為1.8～3.8，說明這些未知物對醬香型習酒香氣具有一定貢獻。

經(jīng)GC-O嗅聞分析，共鑒定出19種酯類化合物，是習酒中種類最多的香氣物質(zhì)。酯類物質(zhì)不僅影響白酒的風味，而且也是衡量白酒質(zhì)量的重要指標。目前研究報道認為酯的形成途徑有3種[26-27]，一是在2 種酶（?；o酶A合成酶和醇乙酰轉(zhuǎn)移酶）的作用下，相關微生物在白酒的釀造過程中代謝形成；二是在酒曲及脂肪酶催化作用下由酸和醇反應生成相應酯類物質(zhì)；三是通過單純的有機化學反應合成酯，主要在白酒發(fā)酵的后期以及貯存過程中，游離的酸醇分子通過化學反應合成相應的酯類物質(zhì)。其中，乙酯主要是酵母、絲狀真菌等代謝形成的產(chǎn)物，或在發(fā)酵過程中，脂肪酸酯化反應而形成[28]。根據(jù)表1，丁酸乙酯（強烈的菠蘿香）、2-甲基丙酸乙酯（菠蘿、朗姆酒樣香氣）、3-甲基丁酸乙酯（果香）、己酸乙酯（果香、窖香）、辛酸乙酯（菠蘿、梨、花香）、苯乙酸乙酯（花香、蜂蜜香）、丙酸乙酯（香蕉香）具有較高的香氣強度值（香氣強度值≥5），這些酯類物質(zhì)在醬香型白酒中也曾被報道具有較高的香氣強度值或香氣稀釋因子值[29]，對習酒的整體香氣輪廓具有重要貢獻。

表1 醬香型習酒香氣成分GC-O嗅聞結(jié)果Table 1 GC-O analysis results of three kinds of soy sauce aroma type Xi Baijiu

脂肪酸通過阻礙酯的水解，促進白酒中香氣的平衡，同時，脂肪酸對芳香酯的產(chǎn)量和強度有顯著影響。酸類物質(zhì)主要由細菌產(chǎn)生，白酒中的其他微生物如酵母、霉菌也會產(chǎn)生少量的酸類物質(zhì)[30]。乙酸、丙酸、丁酸、2-甲基丙酸、3-甲基丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸是構(gòu)成白酒酸香韻的主要脂肪酸。乙酸和丙酸貢獻醋香，而丁酸、2-甲基丙酸、3-甲基丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸貢獻出乳酪酸香、汗臭和窖泥臭，尤其是這些酸類物質(zhì)含量過高時，產(chǎn)生的汗臭、腐臭等不愉悅氣味對白酒的整體香氣會產(chǎn)生不利影響。

醇類物質(zhì)是習酒中發(fā)現(xiàn)的另外一類重要香氣活性化合物。根據(jù)GC-O分析，共檢測出8個醇類物質(zhì)，主要產(chǎn)生青香、酒香、果香和花香。這些醇類物質(zhì)主要是白酒發(fā)酵過程中，酵母菌在好氧條件下由糖類形成，或在厭氧條件下由氨基酸形成，或由酵母菌通過相應的醛的化學還原生成[31]。丁醇（熟香蕉氣息）、3-甲基丁醇（發(fā)酵香、果香、酒香）、苯乙醇（玫瑰花香、蜂蜜香）具有相對較高的香氣強度值（香氣強度值≥3.5），對醬香型習酒的整體香氣具有重要貢獻。

2-正丁基呋喃、糠醛、2-乙?；秽?-甲基糠醛被認為是習酒中獨特的香氣。這些香氣化合物是在焦糖化和美拉德反應等非酶褐變反應中作為高活性中間體的3-脫氧基呋喃裂解或環(huán)化產(chǎn)生[32]。2-正丁基呋喃（焦甜香）和糠醛（烘烤香、花生香氣）具有較高的香氣強度值（香氣強度值≥4.8），而5-甲基糠醛（焦甜香、堅果香）和2-乙?；秽ㄌ鹣恪怨悖┚哂邢鄬^低的香氣強度值（香氣強度值≤2.8）。通過GC-O嗅聞，共檢測出4個吡嗪類化合物。吡嗪可以通過糖和氨基酸殘基之間的美拉德反應或微生物代謝的環(huán)境溫度反應形成[33]。吡嗪類化合物主要為各種香型的中國白酒提供獨特的烘焙、肉、堅果、泥土和爆米花般的香氣，是醬香型白酒中最重要的香氣成分。

2.2 GC-MS、GC-FPD鑒定醬香型習酒的香氣成分

如表2所示，在3種醬香型習酒中，分別鑒定出99、96、98 種香氣化合物，其中應用GC-FPD各鑒定出12 種含硫化合物。酯類、醇類、醛類、酸類和呋喃類化合物相對于其他類別的揮發(fā)性香氣成分，是相當大類組分。乙酸乙酯（79 859～108 981 μg/L）、丙酸乙酯（611 836～755 277 μg/L）、乙酸丙酯（118 116～153 529 μg/L）、丁酸乙酯（114 154～119 832 μg/L）、己酸乙酯（95 091～110 161 μg/L）、苯乙酸乙酯（36 922～37 190 μg/L）、2-甲基丙醇（119 079～164 358 μg/L）、丁醇（52 416～101 002 μg/L）、3-甲基丁醇（88 628～97 005 μg/L）、苯乙醇（108 418～111 509 μg/L）、乙酸（246 256～360 816 μg/L）、丙酸（21 464～65 063 μg/L）、丁酸（68 356～76 296 μg/L）、糠醇（14 077～26 711 μg/L）、糠醛（144 677～168 755 μg/L）、3-羥基-2-丁酮（23 227～30 197 μg/L）在習酒樣品中呈現(xiàn)出較高的質(zhì)量濃度。而硫化物丙硫醇（2.852 8～2.914 4 μg/L）、2,5-二甲基噻吩（0.226 2～0.238 7 μg/L）、3-甲基噻吩（0.593 6 μg/L）、2-甲基-3-呋喃硫醇（0.198 8～0.408 5 μg/L）、二甲基三硫醚（0.820 1～1.842 μg/L）、甲基烯丙基三硫醚（0.005 4～0.013 7 μg/L）、乙酸-3-(甲硫基)丙酯（0.644 6～0.895 2 μg/L）、3-巰基-3-甲基-1-丁醇（0.004 6～0.005 5 μg/L）、3-巰基己基乙酸酯（0.074 7～0.109 μg/L）、2-噻吩甲醛（1.950 1～1.964 2 μg/L）、4-甲基-5-乙烯基噻唑（0.004 2～0.047 μg/L）、3-巰基-1-己醇（2.420 7～3.643 6 μg/L）、苯并噻唑（5.518 3～5.557 8 μg/L）具有較低的質(zhì)量濃度。

表2 3種醬香型習酒香氣成分定量標準曲線及平均含量Table 2 Quantitative standard curves and mean contents of volatile compounds in three kinds of soy sauce aroma type Xi Baijiu

續(xù)表2

續(xù)表2

衡量習酒樣品中揮發(fā)性香氣物質(zhì)對整體香氣的貢獻不僅依賴于香氣物質(zhì)的濃度而且依賴于嗅覺閾值。OAV評估所有定量香氣化合物對習酒整體香氣的貢獻。一般情況下，OAV大于1的香氣化合物被認為對樣品的香氣有貢獻[34]。由表3可知，共有49 個香氣化合物的OAV大于1，其中，己酸乙酯（1 720～1 992）、丁酸乙酯（1 401～1 523）、3-甲基丁酸乙酯（835～966）、2-正丁基呋喃（464～719）、辛酸乙酯（218～327）、2-甲基丙酸乙酯（146～342）、2-甲基丁酸乙酯（107～320）、3-羥基-2-丁酮（90～117）、2-甲基-3-呋喃硫醇（33～72）、丙硫醇（25～26）、己醛（28～33）、苯乙酸乙酯（90～91）、丁酸（71～79）等香氣化合物具有較高的數(shù)值。因此，這些香氣成分對醬香型習酒的香氣具有重要貢獻。在這些成分中，2-甲基-3-呋喃硫醇、3-巰基己基乙酸酯的濃度較低，但OAV相對較高，原因是該成分具有極低的閾值。

表3 3種醬香型習酒香氣成分的OAVTable 3 OAVs of volatile compounds in three kinds of soy sauce aroma type Xi Baijiu

2-甲基呋喃硫醇、丙硫醇、3-巰基己基乙酸酯、3-巰基-1-己醇等含硫成分具有較高的OAV，說明這些痕量硫化物對醬香型習酒的香氣具有重要貢獻。這些成分是通過GC-FPD鑒定出來而不是GC-MS，這說明單一儀器鑒定香氣成分存在不足。這些不足主要從兩方面解釋，一是在掃描模式下，MS的靈敏度較低，質(zhì)譜檢測器對微量含硫成分的檢測能力較差，很難有效地鑒定微量含硫化合物；二是缺乏含硫香氣成分的離子信息，選擇性離子檢測器也有很大的局限性。而GC-FPD可以改善含硫化合物的檢測，由于它具有專屬性，可以消除其他香氣化合物的干擾，其定量結(jié)果更加準確，使含硫化合物的OAV也更加準確可靠。

目前，已經(jīng)有很多利用GC-FPD檢測白酒[9]、啤酒[35-36]、水果[37]中的含硫化合物，構(gòu)建了相對完整的含硫化合物定性、定量方法。其他非硫化合物采用了常規(guī)的MS檢測器。這些研究均借助含硫檢測器的專一性對微量含硫化合物進行分析[36]。因此，應該綜合應用多種檢測器，如FPD、脈沖式火焰光度檢測器、氮磷檢測器特定檢測器，才能更加全面、準確地鑒定白酒等復雜體系中的特征香氣成分。

一般情況下，具有較高香氣強度值的大多數(shù)揮發(fā)性香氣化合物同時也具有較高的OAV[38]，2個方法可以相互驗證。然而，也有少部分揮發(fā)性香氣化合物盡管香氣強度值很高，但卻有很低的OAV，或者相反[39]。OAV實驗中的氣味閾值大多在乙醇溶液中測定，而香氣強度法的實驗條件是以空氣為介質(zhì)，通過不同感官評價人員進行嗅聞，會存在一定的人為誤差，因此會出現(xiàn)香氣強度值和OAV不一致的情況[14,31,38,40]。那些具有低香氣強度值和高OAV的化合物也被認為是重要的貢獻者。在本研究中大多數(shù)結(jié)果一致。在后續(xù)研究中，將進一步采用遺漏、添加等實驗方法研究芳香化合物的重要性。

為了直觀感知3個樣品中關鍵香氣化合物的濃度差異及樣品之間的差異，根據(jù)表2和表3的數(shù)據(jù)生成熱圖（圖1）以確定習酒樣品中關鍵香氣化合物的聚類。從圖1可以看出，顏色編碼是基于從紅色到藍色的等級設計，相對含量從高到低遞減，使樣本之間可以進行區(qū)分。這3個樣品之間稍有差異，主要是因為白酒的生產(chǎn)工藝和環(huán)境條件不同。Y1中酯類香氣含量最高，Y2中醇與酸含量最高，其他物質(zhì)的含量區(qū)分不明顯。

圖1 醬香型習酒中關鍵揮發(fā)性風味化合物含量熱圖Fig. 1 Heatmap for volatile compounds in three kinds of soy sauce aroma type Xi Baijiu

2.3 醬香型習酒香韻結(jié)構(gòu)分析

感官評價小組對3種醬香型習酒香韻進行評價，將其分為焦香、果香、甜香、酸香、醬香、硫化物氣息和花香7個感官屬性，分析結(jié)果見圖2。方差分析顯示，在不同樣本之間，“烘烤香”和“甜香”的感官屬性差異極顯著（P＜0.01），其次是“果香”“硫化物氣息”“醬香”“酸香”和“花香”差異顯著（P＜0.05），即說明每個樣品的香氣強度各不同。由圖2可以看出，習酒印象貴州具有最強“醬香”“甜香”和“硫化物氣息”的香韻強度值，而“花香”的香韻強度值最低。習酒藍樣品具有最強的“果香”“酸香”和“烘烤香”香韻強度值。習酒銀質(zhì)的7個香韻強度值均比另外2個酒樣低。

圖2 3種醬香型習酒感官分析圖Fig. 2 Sensory analysis results of three kinds of soy sauce aroma type Xi Baijiu

在3個習酒樣品中“果香”的香韻強度值整體評分較高?！肮恪毕沩嵤橇暰普w香氣最基本的組成部分，是衡量習酒香氣品質(zhì)的重要指標。構(gòu)成“果香”香韻的香氣化合物主要是酯類化合物。根據(jù)GC-O和OAV結(jié)果可知，己酸乙酯、丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、辛酸乙酯、丙酸乙酯等表現(xiàn)出相對較高的香氣強度值和OAV，即這些化合物對醬香型習酒的“果香”香韻具有重要貢獻。在所有習酒樣品中，“酸香”香韻的得分普遍較低，通常酸類化合物構(gòu)成了“酸香”香韻，酸類化合物具有維持白酒中酯類香氣、平衡酒味、協(xié)調(diào)香氣的作用，這些化合物含量與香氣品質(zhì)呈一定的相關性。當高濃度時，這些成分呈現(xiàn)出難聞的汗臭、窖泥臭等香氣，并降低了習酒樣品的香氣品質(zhì)；而當?shù)蜐舛葧r，這些成分呈現(xiàn)出令人愉悅、舒適的香氣。根據(jù)GC-O和OAV的結(jié)果，與“硫化物氣息”密切相關的香氣成分分別為丙硫醇和二甲基三硫醚。從感官結(jié)果看，該香韻的總體打分值相對較高，分別為5.6、6.4和5.3。這說明“硫化物氣息”香韻對醬香型習酒總體香氣具有相對重要的作用?！搬u香”香韻是醬香型習酒中的特征香韻，3個樣品酒的“醬香”香韻強度打分較高，但是白酒中呈“醬香”風味的化合物至今還未明確[37]，可能與吡嗪類、硫化物、呋喃類、酚類化合物及某些高沸點酸和低沸點的酯類物質(zhì)有關，也可能是這些物質(zhì)復合呈香。

2.4 醬香型習酒香氣重組驗證關鍵香氣化合物

通過感官描述性分析對3種習酒樣品和3個重組酒樣進行分析，結(jié)果表明（圖3），重組模型酒YR1的香氣輪廓與習酒藍（Y1）樣品中果香、醬香、酸香、花香、硫化物氣息香韻得分基本一致，整體香氣輪廓相似，僅烘烤香韻和甜香韻有顯著性差異；重組模型酒YR2的香氣輪廓與習酒印象貴州（Y2）樣品中果香、醬香、酸香、花香香韻得分基本一致，而烘烤香、甜香和硫化物香韻有顯著性差異；重組模型YR3的香氣輪廓與習酒銀質(zhì)（Y3）樣品中果香、醬香、酸香、花香香韻得分基本一致，硫化物氣息、烘烤香和甜香香韻與原酒樣有顯著性差異。通過分析比較可得，產(chǎn)生這些差異的主要原因是呈現(xiàn)這些香韻的香氣化合物種類和含量都不及原酒樣中的豐富，篩選后香氣很容易因為種類和含量的差別造成香氣感官不足。根據(jù)重組實驗驗證了通過OAV和香氣強度法篩選出的40 種關鍵香氣化合物是醬香型習酒的關鍵致香成分。

圖3 3個習酒樣品與相應重組酒模型的香氣輪廓圖Fig. 3 Aroma profiles of three kinds of Xi Baijiu and corresponding aroma recombination models

2.5 S型曲線法驗證習酒中關鍵含硫化合物與酯類化合物之間相互作用

根據(jù)OAV和GC-O的分析結(jié)果表明，含硫化合物和酯類化合物是習酒中重要的香氣物質(zhì)，但它們之間的相互作用尚不清楚。在3個習酒樣品中，Y2中的含硫化合物含量最大。如表1和表3所示，丙硫醇、二甲基三硫醚、2-甲基-3-呋喃硫醇、3-巰基己酸乙酯和3-巰基-1-己醇具有較高的香氣強度值和OAV，表明這些化合物是習酒香氣的重要貢獻者。同時，6 種酯（乙酸乙酯、乙酸丙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和苯乙酸乙酯）的OAV均大于1。為了反映代表性，根據(jù)OAV高（己酸乙酯、丁酸乙酯）、中（苯乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯）和低（乙酸乙酯）的水平選擇6 種酯類香氣化合物。因此，選擇Y2中的5 種含硫化合物作為研究對象，考察它們與6 種酯類化合物的相互作用。

由6 種酯和5 種含硫化合物組成30 個二元混合物，每種化合物按其在Y2樣品中的實際質(zhì)量濃度混合（表4）。獲取的實驗閾值與Feller加和模型計算得到的理論閾值進行比較，結(jié)果如圖4所示，丙硫醇+苯乙酸乙酯和2-甲基-3-呋喃硫醇+丙酸乙酯2 組混合物的實際氣味閾值與理論氣味閾值之比分別為0.40和0.39。2 組都表明，當實際氣味閾值與理論氣味閾值之比小于0.5時，出現(xiàn)了協(xié)同作用。丙硫醇+丁酸乙酯和3-巰基己基乙酸酯+乙酸丙酯2 組混合物的實際氣味閾值與理論氣味閾值比值分別為0.86和0.66，介于0.5和1之間，表明這2 組之間存在加成作用。丙硫醇+乙酸丙酯和二甲基三硫醚+乙酸乙酯2 組混合物的實際氣味閾值與理論氣味閾值之比分別為1.98和1.47，大于1，則表明2 組之間存在掩蓋作用。

圖4 醬香型習酒模擬溶液中二元混合物的正確檢測概率Fig. 4 Proportion of correct detection of binary mixtures in soy sauce aroma type Xi Baijiu model solution

表4 醬香型習酒中含硫化合物與酯類化合物的相互作用Table 4 Interaction between sulfur compounds and ester compounds in soy sauce aroma type Xi Baijiu

以上研究表明，習酒中含硫化合物含量較低，但對習酒的整體香氣有重要影響。含硫化合物可以增強或掩蓋習酒中酯類的香氣。接下來，將進一步研究硫化物與其他芳香族化合物之間的相互作用。這些研究將為提高習酒的香氣質(zhì)量提供理論依據(jù)。

續(xù)表4

2.6 樣本與感官屬性、關鍵香氣化合物的相關性分析

為進一步研究3種醬香型習酒和3個重組溶液之間的感官屬性與關鍵香氣化合物之間的關聯(lián)程度，采用PLSR方法建立模型。如圖5所示，PLSR提供了一個兩因素模型圖，解釋了83%的X變量（關鍵香氣化合物濃度）和61%的Y變量（樣本與感官香韻打分），很好地解釋了它們之間相關。由圖5可知，3個酒樣之間存在一定差異，而酒樣與其對應的重組液之間幾乎沒有太大差異，從而也證明了所篩選的關鍵香氣化合物是構(gòu)成白酒的重要致香成分。習酒藍和重組藍與化合物2-正丁基呋喃（4）、丁酸（9）、丁醇（13）、丙硫醇（17）、糠醇（21）、丙酸（28）、乙酸苯乙酯（32）、3-甲基丁酸（33）、壬酸（40）及烘烤香、酸香、果香香韻表現(xiàn)出較好的相關性；習酒印象貴州和重組印象貴州與化合物丁酸乙酯（2）、2-甲基丙酸（16）、3-巰基己基乙酸酯（19）、十六酸乙酯（22）、2-甲基丙醇（24）、3-甲基丁醇（25）、2,3,5-三甲基吡嗪（31）、2-乙基-6-甲基吡嗪（35）、二甲基三硫醚（36）、乙酸（37）及甜香、硫化物氣息、醬香香韻相關；習酒銀質(zhì)和重組銀質(zhì)與化合物己酸乙酯（1）、3-甲基丁酸乙酯（3）、乙酸異戊酯（14）、乙醛（23）、糠醛（29）具有相關性，然而與任何香韻無顯著相關性，這與感官評價結(jié)果中的感官打分具有很好的一致性（表4）。進一步考察感官屬性與特征香氣化合物之間的相關性，發(fā)現(xiàn)花香與辛酸乙酯（5）、2-甲基丙酸乙酯（6）、戊酸乙酯（11）、丙酸乙酯（12）、乙酸丙酯（15）、苯乙醛（18）、乙酸乙酯（34）具有較好的相關性。

圖5 醬香型白酒感官屬性、白酒樣品與重組樣品和特征香氣成分的PLSR相關性分析載荷圖Fig. 5 Loading plot of PLSR correlation analysis between sensory attributes and characteristic aroma components of soy sauce aroma Baijiu and aroma recombination models

3 結(jié) 論

通過對3種醬香型習酒進行GC-MS、GC-FPD研究，分別鑒定出87、84、86 種非含硫香氣成分和12 種含硫化合物。在OAV實驗，共檢測出49種OAV不小于1的香氣化合物，其中，己酸乙酯（OAV：1 720～1 992）、丁酸乙酯（OAV：1 401～1 523）、辛酸乙酯（OAV：218～327）、3-甲基丁酸乙酯（OAV：835～966）、2-正丁基呋喃（OAV：464～719）、2-甲基丙酸乙酯（OAV：146～342）、3-羥基-2-丁酮（OAV：90～117）、丁酸（OAV：71～79）、2-甲基-3-呋喃硫醇（OAV：33～72）、丁醇（OAV：19～37）、苯乙酸乙酯（OAV：90～91）、己醛（OAV：29～33）、2-甲基丙酸（OAV：13～33）、苯乙醛（OAV：16～35）、糠醇（OAV：7～13）等具有較高的OAV，說明這些成分是醬香型習酒中主要的特征香氣成分。通過香氣重組實驗進一步確認具有高OAV的香氣化合物對醬香型習酒整體香氣有重要貢獻。PLSR驗證了3個酒樣之間存在一定差異性，而酒樣與其對應的重組液之間具有較強的相關性，從而驗證了所篩選的關鍵香氣化合物是構(gòu)成習酒的重要致香成分。在此基礎上，利用Feller加和模型研究Y2酒樣中5 種含硫化合物和6 種酯類化合物之間的感官交互作用。結(jié)果表明，丙硫醇、二甲基三硫醚、2-甲基-3-呋喃硫醇、3-巰基己基乙酸酯、3-巰基-1-己醇均增強己酸乙酯的香氣，而對其他5個酯類化合物則有增強也有掩蓋的作用。實驗數(shù)據(jù)部分解釋了香氣物質(zhì)之間的作用機理，有助于通過定向操作提高醬香型習酒的香氣質(zhì)量。