曹偉超，張賓樂，Omedi Jacob OJOBI，黃 璟，陳 誠(chéng)，鄒奇波，黃衛(wèi)寧,*，李 寧，高鐵成

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.張家港福吉佳食品股份有限公司暨江南大學(xué)福臨門烘焙研究所，江蘇 無(wú)錫 214122；3.廣州焙樂道食品有限公司，廣東 廣州 511400）

烘焙食品是世界主流食品[1]，其中面包類產(chǎn)品是常見的主食食品之一。隨著人們消費(fèi)水平的升級(jí)，傳統(tǒng)白面包已經(jīng)無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。近年來(lái)，以植物蛋白及膳食纖維為代表的天然植物基配料已成為烘焙食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。黑豆是一種優(yōu)質(zhì)的植物性蛋白源，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%，并且具有合理的氨基酸組成模式[2]。麥麩含有豐富的膳食纖維，作為一種成本低廉的功能性成分，麥麩具有極大的資源優(yōu)勢(shì)[3]。

然而，黑豆蛋白不同于小麥蛋白，因此無(wú)法形成具有黏彈特性的面筋網(wǎng)絡(luò)；麥麩通過物理及化學(xué)兩種途徑破壞面團(tuán)的穩(wěn)定性[4]，兩者均會(huì)導(dǎo)致面包品質(zhì)嚴(yán)重劣化。另一方面，黑豆及麥麩中的植酸含量較高，植酸會(huì)與蛋白質(zhì)相結(jié)合進(jìn)而降低蛋白質(zhì)的生物利用率[5]。這些因素都極大限制著黑豆及麥麩在面包中的應(yīng)用。酸面團(tuán)發(fā)酵技術(shù)是一種傳統(tǒng)的生物技術(shù)，它能夠改善面包的營(yíng)養(yǎng)及感官品質(zhì)[6]。Messia等[7]應(yīng)用一株短乳桿菌預(yù)發(fā)酵麥麩以降低麥麩對(duì)面筋網(wǎng)絡(luò)的破壞作用。在Xu Yan等[8]的研究中，乳酸菌發(fā)酵使蠶豆蛋白的流變學(xué)特性得到明顯改善。本課題組已定向篩選出數(shù)株乳酸菌并用于降解豆類中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。盡管已有研究[9-10]將各類傳統(tǒng)作物應(yīng)用于酸面團(tuán)體系，但以兼顧高蛋白及高纖維優(yōu)勢(shì)的復(fù)配植物基原料作為發(fā)酵基質(zhì)的研究仍鮮見報(bào)道。

本研究擬將黑豆及麥麩的高蛋白、高纖維優(yōu)勢(shì)與酸面團(tuán)發(fā)酵技術(shù)相結(jié)合，在兩種配料總體替代率為面粉質(zhì)量15%的基礎(chǔ)上，利用兩株不同功能特性的乳酸菌作為發(fā)酵劑制作高纖維黑豆酸面團(tuán)面包。探究發(fā)酵處理對(duì)植酸、黑豆蛋白及麥麩纖維的影響，分析面筋的水合情況，比較面包面團(tuán)的物性及微觀結(jié)構(gòu)差異，同時(shí)對(duì)面包的營(yíng)養(yǎng)及感官品質(zhì)進(jìn)行評(píng)估，旨在開發(fā)利用黑豆、麥麩資源，提高面包的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，為復(fù)配植物基酸面團(tuán)發(fā)酵技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆粉 阜新佳麥糧品有限公司；90型面包粉河北參花面粉有限公司；麥麩粉 山東禾谷食品有限公司；高產(chǎn)植酸酶乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）L-19篩選自自然發(fā)酵黑豆粉；產(chǎn)β-葡萄糖苷酶戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）J-28篩選自酒曲；胃蛋白酶（3 000～3 500 U/mg）、胰蛋白酶（4 000 U/mg） 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；α-淀粉酶（40 000 U/g）、淀粉葡萄糖苷酶（98 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；OCT冷凍切片包埋劑（SAKURA 4583型） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5K5SS型和面機(jī)、SPC-40SP型醒發(fā)箱、SM-503型烤箱新麥機(jī)械（無(wú)錫）有限公司；FE20型pH計(jì) 梅特勒儀器（上海）有限公司；2515型高效液相色譜儀（配置2489紫外檢測(cè)器） 美國(guó)Waters公司；TU-1810型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Mixolab混合實(shí)驗(yàn)儀、F3流變發(fā)酵儀 法國(guó)肖邦技術(shù)有限公司；拉伸儀 德國(guó)Brabender公司；MesoMR23-060V-I型低場(chǎng)核磁共振（low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR）分析儀 蘇州紐邁分析儀器有限公司；CT3型質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 酸面團(tuán)的制備

取乳酸片球菌L-19及戊糖片球菌J-28菌懸液各100 μL分別接種至5 mL MRS培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)16 h，8 000 r/min離心5 min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌泥2 次。將菌泥重懸于無(wú)菌水，分別接種至黑豆麥麩復(fù)配基質(zhì)（黑豆粉與麥麩粉質(zhì)量比為5∶4，面團(tuán)得率（DY）為300%，DY/%=（m水+m粉）/m粉×100，每100 g酸面團(tuán)接種10 mL MRS培養(yǎng)液中獲得的菌泥量），30 ℃培養(yǎng)24 h，制得酸面團(tuán)。

1.3.2 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取10 g不同發(fā)酵時(shí)間的酸面團(tuán)（每隔2 h取樣1 次），加入90 mL去離子水混合均勻，梯度稀釋后取100 μL涂布于MRS瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.3 酸面團(tuán)pH值及可滴定酸（total titratable acid，TTA）的測(cè)定

參照馬子琳等[11]的方法進(jìn)行。取10 g不同發(fā)酵時(shí)間酸面團(tuán)于錐形瓶中，加入90 mL去離子水，磁力攪拌30 min，靜置10 min后測(cè)定樣品溶液pH值。然后用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至樣品溶液pH值達(dá)到8.6，TTA含量以消耗的NaOH溶液體積（mL）表示。

1.3.4 有機(jī)酸的測(cè)定

取5 g酸面團(tuán)樣品與20 mL 0.01 mol/L KH2PO4混勻，10 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm有機(jī)系濾膜待測(cè)。色譜柱：Aqueous C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：10 mmol/L KH2PO4（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.6）；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。分別配制質(zhì)量濃度為0.25、0.5、0.75、1.00、1.25 mg/mL的乳酸及乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的乳酸及乙酸含量。

1.3.5 生物酶活性的測(cè)定

1.3.5.1 植酸酶活性

參照GB/T 18634—2009《飼用植酸酶活性的測(cè)定 分光光度法》并作修改。取5 g酸面團(tuán)樣品，加入20 mL 0.25 mol/L乙酸鈉緩沖液（調(diào)節(jié)pH值與酸面團(tuán)相同），磁力攪拌15 min，6 000 r/min離心5 min，保留上清液待測(cè)。取0.2 mL待測(cè)液與1.8 mL乙酸鈉緩沖液混勻，37 ℃預(yù)熱5 min，加入4 mL 7.5 mmol/L植酸鈉溶液，37 ℃酶解30 min，加入4 mL終止及顯色液（30%硝酸溶液、100 g/L鉬酸銨溶液、2.35 g/L偏釩酸銨溶液按2∶1∶1體積比混合，現(xiàn)配現(xiàn)用），測(cè)定415 nm波長(zhǎng)處吸光度，以磷酸二氫鉀作為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。植酸酶活性定義為在37 ℃條件下，每分鐘釋放1 μmol無(wú)機(jī)磷為一個(gè)酶活力單位，以U表示。

1.3.5.2β-葡萄糖苷酶活性

參照楊文丹[4]的方法并作修改。將5 g酸面團(tuán)樣品與5 mL 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液（調(diào)節(jié)pH值與酸面團(tuán)相同）振蕩提取30 min，10 000 r/min離心12 min，保留上清液待測(cè)。取0.4 mL待測(cè)液與3.6 mL乙酸鈉緩沖液混合并于40 ℃預(yù)熱5 min，加入0.2 mL 20 mmol/L對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液，40 ℃酶解10 min，加入1 mL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測(cè)定400 nm波長(zhǎng)處吸光度，以對(duì)硝基苯酚作為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。β-葡萄糖苷酶活性定義為在40 ℃條件下，每分鐘釋放1 nmol/mL對(duì)硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位，以U表示。

1.3.6 植酸含量的測(cè)定

參照羅昆等[12]的方法進(jìn)行。

1.3.7 膳食纖維含量的測(cè)定

參照GB 5009.88—2014《食品中膳食纖維的測(cè)定》及Go?i等[13]的方法并作修改。取0.3 g酸面團(tuán)樣品，加入10 mL 0.08 mol/L HCl-KCl緩沖液（pH 1.5）與0.2 mL 0.3 mg/mL胃蛋白酶溶液，40 ℃水浴1 h。用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5并加入1 mL 5 mg/mL胰蛋白酶溶液，37 ℃水浴振蕩6 h。加入10 mL 0.1 mol/L Tris-馬來(lái)酸緩沖液（pH 6.9）與1 mL 120 mg/mLα-淀粉酶溶液，37 ℃水浴16 h，3 000×g離心15 min，將沉淀用5 mL去離子水洗滌2 次，然后于105 ℃干燥過夜，冷卻稱質(zhì)量，即為不可溶性膳食纖維含量。同時(shí)，將離心得到的上清液與洗滌液混合，加入10 mL 0.2 mol/L乙酸鈉緩沖液（pH 4.75）與0.1 mL 2 mg/mL淀粉葡萄糖苷酶溶液，60 ℃水浴振蕩45 min，過濾得到濾液，并按濾液體積加入4 倍體積預(yù)熱至60 ℃體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，室溫下沉淀1 h，抽濾，濾渣于105 ℃干燥過夜，冷卻稱質(zhì)量，即為可溶性膳食纖維含量?？偵攀忱w維含量為不可溶性膳食纖維含量與可溶性膳食纖維含量之和。

1.3.8 面包面團(tuán)的物性分析

1.3.8.1 熱機(jī)械學(xué)性質(zhì)

參照王鳳等[14]的方法，采用Mixolab混合實(shí)驗(yàn)儀測(cè)定面團(tuán)的熱機(jī)械學(xué)性質(zhì)。根據(jù)Chopin+協(xié)議，設(shè)置復(fù)配原料的水分含量，并按照達(dá)到最佳稠度時(shí)的扭矩為1.1 N·m的要求加入相應(yīng)質(zhì)量的原料粉及水。測(cè)定參數(shù)為：初始溫度30 ℃，保溫8 min，然后以4 ℃/min的速率升溫至90 ℃，保溫8 min后，再以4 ℃/min的速率降溫至50 ℃，攪拌速率保持80 r/min。

1.3.8.2 拉伸特性

參照GB/T 14615—2019《糧油檢驗(yàn) 小麥粉面團(tuán)流變學(xué)特性測(cè)試 拉伸儀法》，采用拉伸儀測(cè)定面團(tuán)的拉伸特性。取150 g攪拌完成的面團(tuán)放入揉團(tuán)器中揉圓，然后小心取出面團(tuán)后再放入搓條輥中搓成條柱狀，將其置于拉伸儀的醒發(fā)室中醒發(fā)1 h，取出面團(tuán)，置于測(cè)力系統(tǒng)的托架上進(jìn)行測(cè)試。

1.3.8.3 發(fā)酵流變特性

采用流變發(fā)酵儀進(jìn)行測(cè)定。取250 g攪拌完成的面團(tuán)放入可移動(dòng)發(fā)酵籃，鋪平后加上2 000 g砝碼，然后置于預(yù)熱至38 ℃的發(fā)酵流變儀中測(cè)試，測(cè)試時(shí)間為3 h。

1.3.9 LF-NMR測(cè)定面團(tuán)中的水分分布

準(zhǔn)確稱取5 g面團(tuán)樣品，用聚四氟乙烯保鮮膜包裹后置于專用25 mm核磁管中，采用CPMG脈沖序列測(cè)定自旋-自旋弛豫時(shí)間（T2）。樣品采集參數(shù)：接收機(jī)帶寬100 kHz，回波個(gè)數(shù)10 000，180°間隔時(shí)間0.250 ms，重復(fù)時(shí)間2 000 ms，前置放大增益1，重復(fù)次數(shù)32。經(jīng)LF-NMR分析軟件反演得T2曲線，設(shè)置迭代次數(shù)為100 000。應(yīng)用磁共振成像儀拍攝面團(tuán)中質(zhì)子密度的偽彩圖像。

1.3.10 激光共聚焦顯微觀察面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)

取5 mm×5 mm×5 mm大小的面團(tuán)，用冷凍包埋劑將其固定于冷凍切片機(jī)專用托盤，-80 ℃冷凍1 h。將凍結(jié)后的樣品切成10 mm薄片并置于載玻片上，用羅丹明B（1.3×10-5g/mL）染色1 min，去離子水洗滌后用激光共聚焦顯微鏡觀察面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)，放大倍數(shù)為200 倍。

1.3.11 面包的制作

按照表1所示面包配方，將小麥粉、黑豆粉、麥麩粉、即發(fā)干酵母倒入攪拌缸，加入預(yù)先與水混勻的糖、鹽和酸面團(tuán)，慢打3 min、快打1 min，將黃油裹入面團(tuán)中慢打3 min，接著快打至面團(tuán)可拉出透明薄膜，38 ℃、相對(duì)濕度85%下醒發(fā)2 h，上火170 ℃、下火220 ℃烘烤16 min，室溫下冷卻2 h后進(jìn)行參數(shù)測(cè)定。小麥面包、黑豆麥麩面包、L-19酸面團(tuán)面包、J-28酸面團(tuán)面包依次記作WB、BBB、L-19SB、J-28SB。

表1 面包配方Table 1 Formulations of bread

1.3.12 面包的比容、質(zhì)構(gòu)及芯囊結(jié)構(gòu)分析

比容：將烘焙出爐的面包于室溫下冷卻2 h，采用油菜籽替代法測(cè)定面包體積。面包比容按式（1）計(jì)算：

質(zhì)構(gòu)：將烘焙出爐的面包于室溫下冷卻2 h，用面包切片機(jī)將面包切成厚度10 mm的薄片，取位于面包最中間的兩片進(jìn)行疊放，然后使用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定參數(shù)：探頭型號(hào)P/36，測(cè)試前速率1.0 mm/s，測(cè)試速率3.0 mm/s，測(cè)試后速率3.0 mm/s，壓縮形變量50%，感應(yīng)力5 g，2 次壓縮時(shí)間間隔1 s。

芯囊結(jié)構(gòu)分析：使用掃描儀對(duì)面包芯囊的切面進(jìn)行掃描，再應(yīng)用Image J軟件處理得到面包芯囊的二值化模式圖及相關(guān)參數(shù)。氣孔稠密度以單位面積中的氣孔數(shù)表示；氣孔表面積分?jǐn)?shù)以氣孔面積占切面總面積的百分比表示。

1.3.13 面包營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

1.3.13.1 游離氨基酸

取1 g面包芯囊的凍干樣品，加入25 mL 5 g/100 mL三氯乙酸溶液超聲（80 Hz）提取20 min，10 000 r/min離心30 min，上清液過0.22 μm濾膜。色譜柱：ODS Hypersil色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：V（醋酸鈉）∶V（甲醇）∶V（乙腈）=1∶2∶2；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫40 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm。

1.3.13.2 蛋白質(zhì)含量

取1 g面包芯囊的凍干樣品，加入10 mL去離子水，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.5并振蕩提取40 min，8 000 r/min離心10 min，保留上清液。將沉淀重懸于5 mL去離子水并重復(fù)提取2 次，混合所有上清液。用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH值至4.5，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀并重懸于5 mL去離子水，調(diào)節(jié)pH值至7.0即為待測(cè)液。采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定待測(cè)液中的蛋白質(zhì)含量。

1.3.13.3 體外蛋白消化率

參照羅昆等[12]的方法并作修改。取1 g面包芯囊的凍干樣品，加入15 mL 20 mg/mL胃蛋白酶溶液（0.5 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至1.5），37 ℃振蕩1 h。用0.2 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)節(jié)至7.0，加入15 mL 5 mg/mL胰蛋白酶溶液，37 ℃振蕩1 h。加入5 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，混勻靜置1 h，10 000 r/min離心15 min保留上清液，采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量，體外蛋白消化率按照式（2）計(jì)算：

1.3.13.4 膳食纖維含量

按照1.3.7節(jié)方法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013與Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制，通過SPSS 16.0軟件進(jìn)行顯著性和方差分析，顯著性水平為P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中菌株生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，兩株乳酸菌在短暫停滯后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，表明兩株菌對(duì)黑豆麥麩基質(zhì)均具有較強(qiáng)的適應(yīng)性。L-19經(jīng)10 h對(duì)數(shù)增長(zhǎng)后趨于穩(wěn)定，菌落數(shù)達(dá)10（lg（CFU/g））左右，而J-28在發(fā)酵6 h即進(jìn)入穩(wěn)定期，菌落總數(shù)維持在9.5（lg（CFU/g））左右。該結(jié)果說明J-28具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力，能夠迅速成為酸面團(tuán)體系中的優(yōu)勢(shì)菌群，但發(fā)酵后期的環(huán)境更有利于L-19生長(zhǎng)。在本實(shí)驗(yàn)中，兩株乳酸菌生長(zhǎng)至24 h仍未出現(xiàn)衰亡現(xiàn)象，具有較長(zhǎng)的生長(zhǎng)穩(wěn)定期，表明黑豆麥麩能夠?yàn)槠渖L(zhǎng)提供充分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。穩(wěn)定期是微生物充分積累代謝產(chǎn)物的階段，較長(zhǎng)的穩(wěn)定期有利于菌株作用于發(fā)酵基質(zhì)[15]。

圖1 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中菌株生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curves of the strains during fermentation of sourdough

2.2 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中pH值、TTA及有機(jī)酸的變化

乳酸菌的酸化作用是酸面團(tuán)配料發(fā)揮功能特性的基礎(chǔ)，研究體系的酸化過程具有重要意義。由圖2a可知，兩種酸面團(tuán)均在發(fā)酵前10 h內(nèi)迅速酸化，隨后pH值趨于平緩，在發(fā)酵18 h達(dá)到穩(wěn)定。pH值的降低是乳酸菌釋放多種有機(jī)酸的作用結(jié)果[16]，但代謝物的積累也會(huì)通過反饋調(diào)節(jié)減緩酸化過程。在發(fā)酵終點(diǎn)，兩種酸面團(tuán)的pH值相近，但J-28酸面團(tuán)的TTA含量顯著高于L-19酸面團(tuán)（P＜0.05），這主要源于兩株菌的有機(jī)酸代謝差異。圖2b表明L-19在發(fā)酵過程中以合成乳酸為主，而J-28除了合成乳酸外還產(chǎn)生大量乙酸，相比乳酸，乙酸的緩沖范圍更廣，因此滴定時(shí)消耗更多的堿液[17]。有機(jī)酸的形成及pH值的變化會(huì)影響體系中的生物酶活性，與最終產(chǎn)品的品質(zhì)密切相關(guān)[6]。Koistinen等[18]研究認(rèn)為，酸化能力強(qiáng)的乳酸菌更適用于粗加工作物發(fā)酵。

圖2 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中pH值、TTA和有機(jī)酸含量的變化Fig. 2 Changes in pH, TTA and organic acid content of sourdough during fermentation

2.3 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶及植酸酶活性的變化

由圖3可知，在發(fā)酵初期，L-19酸面團(tuán)中的植酸酶活力逐漸增強(qiáng)，直至第12小時(shí)植酸酶活力出現(xiàn)躍變，并持續(xù)上升至發(fā)酵結(jié)束。酸面團(tuán)體系中的植酸酶可分為兩種，一種是天然存在于植物中的內(nèi)源性植酸酶，另一種是菌株生長(zhǎng)代謝過程中合成的微生物酶，Kozlowska等[19]發(fā)現(xiàn)外源性微生物植酸酶的活力顯著高于植物性植酸酶。因此，發(fā)酵第12小時(shí)植酸酶活力的躍變可能主要源自L-19進(jìn)入穩(wěn)定期后大量分泌微生物植酸酶。J-28酸面團(tuán)中的β-葡萄糖苷酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，β-葡萄糖苷酶活力在發(fā)酵第8小時(shí)達(dá)到最高，隨后迅速下降，最終恢復(fù)至發(fā)酵前的水平。β-葡萄糖苷酶的最適pH值在5.0～6.0之間[20]，因此發(fā)酵后期過度酸化反而會(huì)抑制其活性，該結(jié)果與體系的pH值變化一致。

圖3 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶及植酸酶活性的變化Fig. 3 Changes in β-glucosidase and phytase activity of sourdough during fermentation

2.4 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中植酸及膳食纖維含量的變化

基于兩株乳酸菌的產(chǎn)酶特性，本實(shí)驗(yàn)著重分析酸面團(tuán)發(fā)酵過程中植酸及膳食纖維含量的變化（表2）。經(jīng)過24 h發(fā)酵后，L-19酸面團(tuán)及J-28酸面團(tuán)中的植酸含量分別較發(fā)酵前降低了81.08%、59.79%，表明乳酸菌能夠有效降解植酸，其中L-19的作用更為顯著，該結(jié)果與預(yù)期相符，這是由于L-19具有定向降解植酸的功能特性。在發(fā)酵過程中，不溶性膳食纖維逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄裕瑑煞N酸面團(tuán)中的可溶性膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)由發(fā)酵前的1.66%分別提高至發(fā)酵24 h的2.03%、2.83%。乳酸菌發(fā)酵能夠激活麥麩中的多種天然纖維酶，其中內(nèi)切葡聚糖酶可將難溶性長(zhǎng)鏈纖維分子降解為可溶性小分子[4]，而β-葡萄糖苷酶的作用是進(jìn)一步水解寡糖以消除次級(jí)產(chǎn)物對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶的抑制，是纖維素降解過程中重要的限速酶[4]。本實(shí)驗(yàn)中高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的J-28表現(xiàn)出更高的纖維降解率，這與成奕瑾等[21]的研究結(jié)果一致。

表2 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中植酸及膳食纖維含量Table 2 Changes in contents of phytic acid and dietary fiber of sourdough during fermentation

2.5 面包面團(tuán)的熱機(jī)械學(xué)性質(zhì)、拉伸及發(fā)酵流變特性

由表3可知，與WB相比，添加黑豆及麥麩提高了面團(tuán)吸水率，延長(zhǎng)面團(tuán)形成時(shí)間。這是因?yàn)楹诙沟鞍准胞滬熇w維都具有高吸水性的特點(diǎn)，兩者對(duì)水分的競(jìng)爭(zhēng)會(huì)干擾面筋網(wǎng)絡(luò)的形成。相比WB，BBB的弱化度顯著增大（P＜0.05），表明黑豆及麥麩不利于面團(tuán)穩(wěn)定，而乳酸菌發(fā)酵能夠在一定程度上緩解該現(xiàn)象。Park等[22]發(fā)現(xiàn)高負(fù)電性的植酸會(huì)干擾麥谷蛋白交聯(lián)，實(shí)驗(yàn)中乳酸菌對(duì)植酸的高度降解有利于降低其干擾作用。此外，不溶性膳食纖維向可溶性膳食纖維的轉(zhuǎn)化也有助于提高面團(tuán)強(qiáng)度[7]。最大拉伸比反映面團(tuán)彈性與延展性之間的平衡，L-19SB的最大拉伸比與WB最為接近，表明兩者具有相似的黏彈特性。與BBB相比，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，面團(tuán)中的CO2生成量顯著上升，這是因?yàn)榘l(fā)酵過程中淀粉、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分水解為小分子，利于酵母代謝產(chǎn)氣[6]。

表3 面包面團(tuán)的熱機(jī)械學(xué)性質(zhì)、拉伸及發(fā)酵流變特性Table 3 Thermomechanical, tensile and fermentation rheological characteristics of bread doughs

2.6 面包面團(tuán)中的水分分布

為進(jìn)一步探究黑豆及麥麩對(duì)面筋水合的影響，采用LF-NMR及其成像技術(shù)分析面團(tuán)中的水分分布。圖4是典型的T2曲線，T21、T22和T23分別代表結(jié)合水、不易流動(dòng)水及自由水[23]。相比WB，BBB的T22峰向右偏移，表明水分子流動(dòng)性增強(qiáng)。這可能是因?yàn)楹诙辜胞滬熤饕揽客鈬H水基團(tuán)吸附水分子，而面筋蛋白能與水分子發(fā)生溶劑化作用，促使大量水分子進(jìn)入膠體內(nèi)部[24]，對(duì)水分子的束縛力更強(qiáng)。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，質(zhì)子峰偏移幅度變小，部分自由水向不易流動(dòng)水轉(zhuǎn)變，表明面團(tuán)組分與水分子結(jié)合地更加緊密。核磁共振成像的質(zhì)子信號(hào)能夠直觀地反映面筋的水合程度，信號(hào)強(qiáng)度高的紅色區(qū)域越多，代表水分子的流動(dòng)性越強(qiáng)[25]，相應(yīng)面筋的水合程度越低。由圖5可知，WB中的水分分布均勻，水分流動(dòng)性弱。相反，BBB的面筋水合不完全，存在大面積自由水，而黑豆及麥麩的發(fā)酵降解有利于面筋充分水合。

圖4 面團(tuán)的T2曲線Fig. 4 T2 time curves of doughs

圖5 面團(tuán)中的水分分布Fig. 5 Water distribution of doughs

2.7 面包面團(tuán)的微觀結(jié)構(gòu)

由圖6可知，WB中的面筋結(jié)構(gòu)分支度高、分布均勻，整體呈現(xiàn)為致密、連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。相比WB，BBB的面筋網(wǎng)絡(luò)中存在較大的間隙，呈現(xiàn)松散、不規(guī)則的片狀分布，表明黑豆及麥麩的添加會(huì)破壞面筋網(wǎng)絡(luò)的完整性。豆類蛋白在攪打過程中會(huì)與醇溶蛋白及麥谷蛋白形成“醇溶蛋白-豆類蛋白-麥谷蛋白”復(fù)合體，而這種復(fù)合體會(huì)損害面筋的功能特性[24]。此外，麥麩顆粒不僅會(huì)直接刺破面筋薄膜，還會(huì)通過阿魏酸與面筋蛋白交聯(lián)，從而阻礙面筋網(wǎng)絡(luò)的形成[4]。Perez等[26]在添加大豆蛋白的面團(tuán)中同樣觀察到片狀聚合物，這些聚合物源于大豆蛋白與面筋蛋白間形成的交聯(lián)，不利于形成完整的面筋網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，面筋的斷裂結(jié)構(gòu)基本消失，間隙區(qū)域明顯減少，這可能是因?yàn)楹诙沟鞍捉到鉃樾》肿与幕虬被?，因此與面筋蛋白的相互作用減弱，形成黑豆蛋白-面筋蛋白聚合物的概率降低。同時(shí)，大分子纖維的降解也有利于面筋網(wǎng)絡(luò)的形成[4]。連續(xù)、完整的面筋網(wǎng)絡(luò)賦予面團(tuán)獨(dú)特的黏彈特性，該結(jié)果與面團(tuán)的物性分析一致。

圖6 面包面團(tuán)激光共聚焦微觀結(jié)構(gòu)圖Fig. 6 Laser scanning confocal microscopy images of doughs

2.8 面包的比容、質(zhì)構(gòu)及芯囊結(jié)構(gòu)分析

由表4可知，相比BBB，L-19SB與J-28SB的比容分別提高4.96%和9.22%，面包芯囊硬度分別降低12.61%和16.8%，表明酸面團(tuán)面包更加蓬松、柔軟。面包的比容取決于面團(tuán)中CO2體積及面團(tuán)自身的流變特性[27]，乳酸菌發(fā)酵有利于CO2積累，提高面團(tuán)延展性，確保面團(tuán)在烘焙過程中充分膨脹。氣孔稠密度及其面積分?jǐn)?shù)反映面包芯囊組織的細(xì)膩性及蓬松性。相比WB，BBB的氣孔稠密度及面積分?jǐn)?shù)顯著下降，宏觀表現(xiàn)為粗糙、松散的組織結(jié)構(gòu)，相反，酸面團(tuán)面包中無(wú)規(guī)則大孔洞較少，氣孔相對(duì)細(xì)膩均一，內(nèi)部組織更為致密（圖7）。該現(xiàn)象與面筋微觀結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果相似。

表4 面包的比容、質(zhì)構(gòu)及芯囊結(jié)構(gòu)Table 4 Specific volume, texture and crumb structure of breads

圖7 面包芯囊的組織結(jié)構(gòu)Fig. 7 Structure of bread crumbs

2.9 面包中的游離氨基酸含量

蛋白質(zhì)的水解是酸面團(tuán)發(fā)酵過程中最重要的技術(shù)特征，黑豆蛋白的水解對(duì)于游離氨基酸的釋放具有重要意義。由圖8可知，L-19SB及J-28SB中的總游離氨基酸含量分別為BBB的1.61 倍和1.22 倍，必需氨基酸的增幅更為顯著，分別為2.84 倍和2.11 倍。該結(jié)果說明乳酸菌發(fā)酵不僅能夠有效富集游離氨基酸，同時(shí)優(yōu)化了面包中的氨基酸組成模式。在4 種面包中，WB的賴氨酸含量最低，僅為2.99 mg/g，添加黑豆及麥麩的面包其賴氨酸含量增加至8.39 mg/g。經(jīng)發(fā)酵后，兩種酸面團(tuán)面包的賴氨酸含量分別達(dá)到14.17 mg/g和10.12 mg/g。賴氨酸是谷類作物的第1限制性氨基酸[28]，實(shí)驗(yàn)表明黑豆麥麩酸面團(tuán)的添加能夠彌補(bǔ)普通小麥面包中賴氨酸不足的劣勢(shì)。在本實(shí)驗(yàn)中，酪氨酸、絲氨酸及精氨酸的含量在發(fā)酵后出現(xiàn)不同程度的降低，這可能是菌株生長(zhǎng)代謝過程中消耗所致。

圖8 面包中的游離氨基酸含量Fig. 8 Contents of free amino acids in breads

2.10 面包的蛋白質(zhì)、膳食纖維含量及體外蛋白消化率

由表5可知，L-19SB和J-28SB兩種酸面團(tuán)面包的總膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于6%，滿足歐盟營(yíng)養(yǎng)與健康法規(guī)中關(guān)于高膳食纖維食品的定義。在蛋白質(zhì)方面，BBB的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)14.24%，相比WB提高了22.54%。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，兩種酸面團(tuán)面包的蛋白質(zhì)含量略有降低，但與發(fā)酵前無(wú)顯著差異，表明發(fā)酵處理對(duì)蛋白損耗的影響較小。體外蛋白消化率是評(píng)價(jià)食品營(yíng)養(yǎng)特性的關(guān)鍵指標(biāo)，與蛋白質(zhì)含量相結(jié)合能夠更全面地表征蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[29]。相比BBB，兩種酸面團(tuán)面包的體外蛋白消化率顯著提高，表明乳酸菌發(fā)酵能夠降低植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用。此外，發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的部分水解使其對(duì)消化酶更加敏感[30]，因此易于消化吸收。

表5 面包的蛋白質(zhì)、膳食纖維含量及體外蛋白消化率Table 5 Protein and dietary fiber contents and in vitro protein digestibility of breads %

3 結(jié) 論

研究表明，利用功能性乳酸菌L-19及J-28作為發(fā)酵劑制作的黑豆麥麩酸面團(tuán)有利于改善面包的營(yíng)養(yǎng)及感官品質(zhì)。在黑豆麥麩基質(zhì)中，乳酸菌L-19及J-28生長(zhǎng)良好，酸化能力強(qiáng)，兩者表現(xiàn)出不同的產(chǎn)酶特性。經(jīng)發(fā)酵后，黑豆麥麩中的植酸得到有效降解，難溶性膳食纖維向可溶性轉(zhuǎn)變。黑豆及麥麩不利于面團(tuán)的形成及穩(wěn)定，并且破壞面團(tuán)彈性與延展性之間的平衡，而乳酸菌發(fā)酵能夠降低黑豆麥麩產(chǎn)生的不利影響，賦予面團(tuán)良好的流變特性。LF-NMR分析及激光共聚焦觀察的結(jié)果表明，黑豆蛋白及麥麩纖維改變面團(tuán)中的水分分布，干擾面筋水合，導(dǎo)致面筋蛋白無(wú)法形成連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在感官方面，兩種酸面團(tuán)面包蓬松、柔軟，芯囊組織細(xì)膩、均一。營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)表明，黑豆麥麩面包具有高纖維、高蛋白特征，乳酸菌發(fā)酵能夠進(jìn)一步優(yōu)化面包的氨基酸組成模式，提高體外蛋白消化率。