王 藏，馬小藝，田小鵬，祖航天，丁延帥，呂明生，王淑軍,*

（1.江蘇海洋大學 海洋資源與環(huán)境重點實驗室，海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇海洋大學 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005）

磷脂酶是能特異性水解磷脂的酶的統(tǒng)稱，分布于動物、植物和微生物中。廣泛應用于醫(yī)藥、油脂精煉、磷脂改性、食品加工等領域[1-5]。另外，磷脂酶在許多生理過程中起重要作用，如信號轉導、磷脂代謝、細胞骨架組織等[6-7]。磷脂酶根據(jù)作用于底物的位置不同可以分為磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D[8-14]。

磷脂酶B（又稱溶血磷脂酶，EC.3.1.1.5）能夠水解sn-1和sn-2的?；?，釋放出溶血磷脂和兩個脂肪酸；同時，還具有溶血磷脂酶和轉?；富盍15]。研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酶B在人體和動物的表皮細胞[9,16]、細菌[17-19]和真菌[20-21]中大量存在。已有磷脂酶B基因克隆表達的相關研究[22-23]。磷脂酶B在油脂精煉的脫膠上起關鍵性作用，可以把非水合磷脂轉化為相應的水合形式，通過離心進行分離和去除[22]。與傳統(tǒng)脫膠方法相比，減少了化學藥品的消耗，降低損耗[15]。在高附加值磷脂衍生物的生產(chǎn)方面亦起著重要作用[1]。甘油磷脂酰膽堿作為體內天然存在的較少的水溶性磷脂代謝產(chǎn)物，可延緩記憶力衰退，治療腦部中風與腦部損傷患者，故常用于食品保健中，而使用磷脂酶水解磷脂制備甘油磷脂酰膽堿，得率高于其他方法[24]。李蔚筠等[25]探索華支睪吸蟲分泌排泄蛋白磷脂酶B（Clonorchis sinensisphospholipase B，CsPLB）與乙肝病毒X蛋白（hepatitis B virus，HBx）共同作用對HepG2肝癌細胞株增殖、凋亡的影響，研究發(fā)現(xiàn)rCsPLB與HBx共同作用可促進HepG2細胞的增殖和凋亡。此外，磷脂酶B還可以加快受損皮膚的修復，引起了化妝品行業(yè)的注意[15]。磷脂酶B在食品添加劑、醫(yī)藥和化妝品等領域的市場需求大[24,26]。

海洋的微生物種類繁多，因特殊的地理環(huán)境，微生物的特性與陸生微生物有較大差異，是篩選新型產(chǎn)酶菌株以及獲得獨特磷脂酶B的重要來源[27-28]。本研究從黃海49 m深處采集泥樣，篩選產(chǎn)磷脂酶B活性高的微生物菌株，進行菌株鑒定、生長特性、發(fā)酵條件以及酶學性質研究，擬為該菌株及其酶的進一步應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

取自黃海49 m深處采集的底泥樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：蛋黃卵磷脂1 g/L、陳海水、pH值自然；分離培養(yǎng)基：蛋黃卵磷脂2 g/L、瓊脂20 g/L、陳海水、pH值自然；發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L、葡萄糖10 g/L、陳海水、pH值自然；種子液培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、陳海水、pH值自然；硼砂卵黃固體平板：硼酸10.9 g/L、硼砂1.9 g/L、瓊脂粉20 g/L、蛋黃20 g/L、pH 7.2～7.4。

1.1.3 試劑

磷脂酰膽堿標準物質、磷脂酸標準物質、溶血磷脂酰膽堿標準物質、1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿 美國Aladdin公司；軟脂酸標準物質、油酸標準物質國家標準物質中心；蛋黃卵磷脂 生工生物工程（上海）股份有限公司；GF254硅膠薄層板 青島海洋化工廠分廠；蛋白胨、瓊脂粉等均為生化試劑。

1.2 儀器與設備

SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅公司；Innova 44R恒溫搖床、Centrifuge 5424R型離心機 德國Eppendorf公司；Multiskan GO全波長酶標儀 美國Thermo Scientific公司；7890A型氣相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)酶菌株富集與分離純化

取1 g海泥接入50 mL富集培養(yǎng)基中，180 r/min、30 ℃搖瓶富集培養(yǎng)24 h，將富集培養(yǎng)液梯度稀釋10-1～10-7后涂布到分離培養(yǎng)基上，挑選帶有透明圈的菌落，進一步純化后保藏。

1.3.2 產(chǎn)酶菌株形態(tài)特征及鑒定

菌株平板劃線培養(yǎng)后，觀察菌落形態(tài)，進行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色、鞭毛染色、生物掃描電鏡觀察。對菌株進行生理生化實驗。將菌株培養(yǎng)12 h，提取DNA（杭州寶賽DNA試劑盒），使用細菌16S rDNA通用引物進行基因擴增，通用引物為：上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。系統(tǒng)發(fā)育樹的構建：通過軟件DNAMNA和MEGA對序列進行分析，用Neighbor-joining構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.3 產(chǎn)酶菌株生長條件優(yōu)化

在種子培養(yǎng)基的基礎上，研究不同碳源、氮源、溫度、pH值、NaCl對菌株生長的影響。碳源質量濃度為10 g/L（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、馬鈴薯淀粉、玉米粉、大麥粉、米糠、麩皮、糊精）；氮源的質量濃度為10 g/L（胰蛋白胨、魚粉蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、花生粉、羽毛粉、干酪素、尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉）；溫度分別設置為20～45 ℃；配制pH值分別為5～11的培養(yǎng)基；NaCl質量濃度設置為0～100 g/L。培養(yǎng)條件為180 r/min、25 ℃培養(yǎng)24 h，檢測菌液OD600nm。

1.3.4 粗酶液的制備

將產(chǎn)酶菌株接種到種子培養(yǎng)基中，180 r/min培養(yǎng)，裝液量20%，25 ℃培養(yǎng)9 h，將種子液以2%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min、30 ℃培養(yǎng)48 h后，將發(fā)酵液7 104×g離心20 min，取上清液，4 ℃保藏備用。

1.3.5 磷脂酶活力測定

根據(jù)代書玲等[29]的方法，采用硼砂卵黃平板牛津杯法測定酶活力。將用緩沖液稀釋5 倍的粗酶液加入放置在硼砂卵黃平板上的牛津杯中，37 ℃溫育24 h，測定暈圈的直徑判斷酶活力。根據(jù)吉得寧[30]的方法，加以改進，測定粗酶液中的磷脂酶活力與脂肪酶活力。

1.3.6 菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化

在發(fā)酵培養(yǎng)基上，研究不同的碳源、氮源、溫度、pH值、NaCl、接種量、發(fā)酵時間對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。質量濃度為10 g/L的碳源（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、馬鈴薯淀粉、蛋黃卵磷脂、米糠、麩皮、糊精）替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖制備培養(yǎng)基；用質量濃度為10 g/L氮源（胰蛋白胨、魚粉蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、羽毛粉、花生粉、干酪素、尿素、硫酸銨）替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母粉配制培養(yǎng)基，并配制不同質量濃度最佳碳氮源（5～40 g/L）進行優(yōu)化；配制pH值分別為6～9.5的發(fā)酵培養(yǎng)基；溫度分別設置為15～45 ℃；NaCl質量濃度設置為10～100 g/L；接種量設置為0.5%～4%。發(fā)酵時間設為從12 h起每隔6 h取樣1 次。在30 ℃搖床培養(yǎng)48 h后，7 104×g離心20 min，測定上清液中粗酶液活力。

1.3.7 菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取對產(chǎn)酶影響較大的因素（麩皮、魚粉蛋白胨、溫度、pH值），采用4因素3水平設計正交試驗優(yōu)化產(chǎn)酶條件。試驗因素與水平設計見表1。

表1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Independent variables and levels used in orthogonal array design for medium formulation optimization

1.3.8 水解產(chǎn)物薄層層析（thin layer chromatography，TLC）和氣相色譜分析

將0.25 mL 5 mg/mL卵磷脂溶液加入1 mL粗酶液，30 ℃恒溫搖床200 r/min，孵育12 h，加入0.5 mL 50 mmol/L乙二胺四乙酸溶液和5 mL三氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）混合液，劇烈振蕩后靜置分層，取出有機相真空蒸發(fā)得到的白色殘留物，加0.2 mL三氯甲烷-甲醇（1∶1，V/V）混合液溶解后，進行薄層層析。展開劑為氯仿-甲醇-乙酸（40∶15∶6，V/V）用碘熏蒸顯色[31]。

采用0.25 mL 5 mg/mL 1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿溶液與1 mL粗酶液，30 ℃恒溫搖床200 r/min，孵育12 h。將水解產(chǎn)物與軟脂酸、油酸標準物質分別進行脂肪酸甲酯化。步驟如下：取水解產(chǎn)物1 mL，軟脂酸、油酸各2 mg分別放置于具塞試管中，加入1 mL 1%氫氧化鈉-甲醇溶液，振蕩混勻，充1 min氮氣。75 ℃水浴皂化15 min，冷卻至室溫。加入2 mL 5%鹽酸-甲醇溶液，振蕩混勻，充1 min氮氣。75 ℃水浴15 min進行甲酯化，冷卻至室溫。加入2 mL正己烷萃取。將待測液裝入進樣瓶，氣相色譜檢測。色譜條件：DB-1毛細管色譜柱（30 m×0.530 mm，3 μm），載氣為N2，進樣量1 μL，流速2.5 mL/min，分流比15∶1，進樣口溫度250 ℃，柱溫從170 ℃以5 ℃/min上升至250 ℃，保持28 min，檢測器溫度250 ℃。

1.3.9 磷脂酶性質分析

根據(jù)硼砂卵黃平板牛津杯法，測定磷脂酶的最適作用溫度、最適作用pH值、金屬離子對酶活力影響、有機溶劑對酶活力影響。設置溫度為30～60 ℃；用乙酸鈉緩沖液、磷酸鈉緩沖液和Tris-鹽酸緩沖液將硼砂卵黃固體平板的pH值調至4～9。將Ca2+、Ni2+、Co2+、Mg2+、Mn2+、Si2+、Zn2+、Ba2+、Fe3+、K+、Cu2+等離子鹽按1 mmol/L濃度添加到硼砂卵黃固體平板中；將有機溶劑與酶液、緩沖液按1∶2∶7的比例混合。取100 μL的待測液置于等距放置在硼砂卵黃平板上的牛津杯中，45 ℃溫育，檢測酶活力。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗采用3個平行樣，對結果計算平均值，并進行標準差分析。差異顯著性分析采自SPSS中的S-N-K（S）。

2 結果與分析

2.1 磷脂酶產(chǎn)生菌的篩選與鑒定

經(jīng)多輪篩選，共獲得11 株菌，選擇透明圈最大的菌株HL9，如圖1A所示，菌株呈圓形，表面光滑，邊緣整齊，呈乳白色，菌落周圍出現(xiàn)較大的透明暈圈。革蘭氏陰性菌，無莢膜，無芽孢，無鞭毛，掃描電鏡顯示該菌為短桿菌（圖1B）。16S rDNA的序列全長為1 401 bp，用Neighbor-joining構建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，菌株HL9與假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）相似度達到99%。如表2所示，該菌株不能利用大部分糖醇，精氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、氧化酶、苯丙氨酸呈陽性。

表2 菌株HL9的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain HL9

圖1 菌株HL9菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of strain HL9

圖2 菌株HL9系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain HL9

2.2 菌株HL9生長條件優(yōu)化

2.2.1 不同碳源、氮源對生長的影響

如圖3所示，菌株適應多種碳源，最終選擇米糠作為最適碳源；菌株在有機氮源條件下生長較好，在無機氮源中生長較差，最終選擇酵母粉作為最適氮源。

圖3 碳源（A）和氮源（B）對菌株生長的影響Fig. 3 Effects of carbon source (A) and nitrogen source (B) on the growth of strain HL9

2.2.2 溫度、pH值及NaCl質量濃度對生長的影響

如圖4A所示，菌株在20～35 ℃范圍內生長穩(wěn)定，25 ℃時生長最好，45 ℃幾乎不生長。如圖4B所示，菌株在pH 6～9范圍內生長良好，在pH 5.5和pH 10條件下，菌株無法生長。如圖4C所示，在無NaCl條件下菌株不能生長，在NaCl質量濃度為30 g/L時，菌株生長最好。該菌在較高鹽度（100 g/L）條件下，依然生長良好，值得關注。竇旖君等[32]篩選的假交替單胞菌屬亦在較高質量濃度下生長良好。

圖4 溫度（A）、pH值（B）及NaCl質量濃度（C）對菌株生長的影響Fig. 4 Effects of temperature (A), pH (B) and NaCl concentration (C)on the growth of strain HL9

2.3 菌株HL9產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1 碳源及添加量對產(chǎn)酶的影響

如圖5所示，麩皮和葡萄糖促進產(chǎn)酶的能力較強，選用麩皮為產(chǎn)酶碳源，10 g/L麩皮產(chǎn)酶效果最好。

圖5 碳源種類（A）和碳源添加量（B）對菌株產(chǎn)酶的影響Fig. 5 Effects of carbon source type (A) and concentration (B) on enzyme-producing capacity of strain HL9

2.3.2 氮源及添加量對產(chǎn)酶的影響

如圖6A所示，魚粉蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉和羽毛粉等產(chǎn)酶效果良好，最終選用魚粉蛋白胨為發(fā)酵培養(yǎng)基氮源。如圖6B所示，5 g/L魚粉蛋白胨產(chǎn)酶效果最好。隨著添加量的增加，產(chǎn)酶效果逐漸減弱。

圖6 氮源種類（A）和氮源添加量（B）對菌株產(chǎn)酶的影響Fig. 6 Effects of nitrogen source type (A) and concentration (B) on enzyme-producing capacity of strain HL9

2.3.3 溫度、pH值及NaCl質量濃度對產(chǎn)酶的影響

如圖7A所示，15～25 ℃產(chǎn)酶效果一直呈上升趨勢，在25 ℃時達到最高，隨后開始降低，在40 ℃時不產(chǎn)酶，故選用25 ℃為發(fā)酵產(chǎn)酶溫度。如圖7B所示，菌株在pH 7～9范圍內產(chǎn)酶能力穩(wěn)定，在pH 8時產(chǎn)酶效果最好，最終選用pH 8配制發(fā)酵培養(yǎng)基。圖7C結果表明，在NaCl質量濃度為20 g/L時產(chǎn)酶最好，在NaCl質量濃度范圍為30～80 g/L時相對酶活力亦可達到95%。質量濃度高于90 g/L時不利于產(chǎn)酶。

圖7 溫度（A）、pH值（B）及NaCl質量濃度（C）對菌株產(chǎn)酶的影響Fig. 7 Effects of temperature (A), pH (B) and NaCl concentration (C)on enzyme-producing capacity of strain HL9

2.3.4 接種量和發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

圖8結果表明，在接種量為2%時產(chǎn)酶最好；在發(fā)酵48 h產(chǎn)酶達到最高，隨后逐漸下降。

圖8 接種量（A）和發(fā)酵時間（B）對菌株產(chǎn)酶的影響Fig. 8 Effects of inoculum amount (A) and fermentation time (B) on enzyme-producing capacity of strain HL9

2.4 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗結果

表4 正交試驗方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal array design results

正交試驗結果與方差分析見表3、4。4個因素對產(chǎn)酶影響不顯著（P＞0.05），發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)組合為A2B1C3D3，即培養(yǎng)基中加入10 g/L麩皮、5 g/L魚粉蛋白胨，pH 8.5，培養(yǎng)溫度30 ℃。4因素的影響均為不顯著，表明該菌在發(fā)酵產(chǎn)酶中適應性較好。

表3 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗設計與結果Table 3 Orthogonal array design with experimental results for optimization of medium formulation

2.5 水解產(chǎn)物分析

為了判斷該磷脂酶的水解產(chǎn)物，選用TLC檢測。由圖9可見，水解產(chǎn)物中有溶血磷脂酰膽堿，也有脂肪酸，尚難以判斷水解的是sn-1?；€是sn-2?；?。為了進一步判斷該磷脂酶為A1、A2或B型。運用氣相色譜進行定性分析，水解產(chǎn)物中分別含有軟脂酸和油酸。結果表明，該磷脂酶可以同時水解sn-1?；蛃n-2酰基，篩選的磷脂酶為磷脂酶B。在水解產(chǎn)物中，油酸占70.67%，軟脂酸占29.33%。表明該磷脂酶B以水解sn-2?；鶠橹鳌＝?jīng)滴定法檢測，該磷脂酶B的發(fā)酵液酶活力為1.2 U/mL，發(fā)酵液沒有檢測到脂肪酶活力。

圖9 水解產(chǎn)物分析Fig. 9 TLC analysis of hydrolysates

2.6 菌株HL9磷脂酶B的性質

2.6.1 溫度、pH值對酶活力的影響

如圖10A所示，溫度對酶的活力影響較大，在30～50 ℃時酶活力可以保持80%以上，45 ℃是該酶最適作用溫度。如圖10B所示，在pH 4～7.5范圍內隨著pH值的升高酶活力也隨之增加，在pH 7.5時達到最高，隨后酶活力開始下降。在pH 7～8之間時，酶活力較穩(wěn)定。Jiang Fangyan等[33]研究發(fā)現(xiàn)重組熒光假單胞菌磷脂酶B的最適作用溫度僅為30 ℃，最適作用pH值為6。本研究篩選的磷脂酶B具有較高的作用溫度，并適用于堿性條件。

圖10 溫度（A）和pH值（B）對酶活力的影響Fig. 10 Effects of temperature (A) and pH (B) on the activity of phospholipase B

2.6.2 金屬離子對酶的作用

如表5所示，Ca2+、Co2+、Mn2+、Si2+、Zn2+、Ba2+對酶活力有促進作用，Ni2+、Mg2+、Fe3+、K+對酶活力影響較小，而Cu2+對酶活力有較大的抑制作用。

表5 金屬離子對酶穩(wěn)定性的影響Table 5 Effects of metal ions on the stability of phospholipase B

2.6.3 有機溶劑對酶的作用

如表6所示，該酶對有機溶劑耐受性好，酶活力均能保持在80%以上。有利于該酶水解溶于有機相中的脂質。

表6 有機溶劑對酶穩(wěn)定性的影響Table 6 Effects of organic solvents on the stability of phospholipase B

3 結 論

本研究從黃海海泥中篩選出1 株產(chǎn)磷脂酶B的假交替單胞菌屬菌株HL9。對該菌株的生長特性和產(chǎn)酶特性進行了研究。水解產(chǎn)物的氣相色譜與TLC結果表明，菌株HL9產(chǎn)的是磷脂酶B，并以水解sn-2?；鶠橹鳎a(chǎn)物中油酸占70%。磷脂酶B活力為1.2 U/mL，無脂肪酶活力。酶的最適作用溫度和pH值分別為45 ℃和7.5。有機溶劑對酶活力影響較小。研究結果表明該酶具有獨特的酶學性質，為進一步研究酶的結構與功能打下了基礎。該酶在食品和醫(yī)藥等領域中具有較好的應用潛力。