丁玉峰，馬艷莉,2,*，李素萍，席曉麗，孫劍鋒，劉亞瓊，牟建樓

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000；2.南陽理工學院 河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點實驗室，河南 南陽 473000）

葡萄（Vitis viniferaL.）為葡萄科葡萄屬木質(zhì)藤本植物，是世界上栽培面積最大、產(chǎn)量第2的水果，廣泛分布在溫帶至亞熱帶地區(qū)，遍及亞洲、歐洲和美洲，據(jù)國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)，2018年我國葡萄年產(chǎn)1 366.68萬 t，因其較高的營養(yǎng)特性和附加值深受消費者歡迎。葡萄中含有豐富的營養(yǎng)成分，葡萄漿果中含約10%～30%的糖、維生素、類胡蘿卜素、礦物質(zhì)、鈣、鉀、磷、鐵、維生素、氨基酸和多酚類化合物等。葡萄中的類胡蘿卜素主要是β-胡蘿卜素和葉黃素，類胡蘿卜素是天然色素，負責葡萄的紅色、橙色和黃色色調(diào)，多酚是植物的次生代謝產(chǎn)物，在果肉、果皮和種子中均有分布，對葡萄的顏色和味道發(fā)揮著重要作用，是潛在的抗氧化分子，能夠清除自由基、調(diào)節(jié)各種信號通路[1]。葡萄除了豐富的營養(yǎng)特性，也因其口感酸甜、多汁和濃郁的風味受到消費者的青睞[2-3]。

葡萄酵素是以葡萄為原料，利用微生物發(fā)酵制得的具有營養(yǎng)和保健作用的產(chǎn)品。在微生物作用下，葡萄基質(zhì)中的糖類、維生素和花色苷等營養(yǎng)成分轉化成小分子活性物質(zhì)。酚類化合物的轉化也發(fā)生在食品發(fā)酵過程中，Morais等[4]研究乳酸菌對火龍果發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)的影響；Garbetta等[5]研究副干酪乳桿菌對朝鮮薊多酚的影響；Khan等[6]研究植物乳桿菌和釀酒酵母共發(fā)酵對糙米發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)的影響。然而，目前市場上酵素產(chǎn)品多以自然發(fā)酵制得，存在菌株混雜不可靠的缺點，易產(chǎn)生食品安全風險大、產(chǎn)品指標穩(wěn)定性差、發(fā)酵周期長等問題[7-8]。因此采用接種發(fā)酵的方式研究微生物對多酚的影響十分必要；在酶作用下，微生物能夠釋放與基質(zhì)中其他成分相關的酚類化合物，如糖類，使生物活性更強的配位體形式可能從相應的糖苷中釋放[9-10]。

酚類化合物的生物轉化也發(fā)生在宿主體內(nèi)，事實上多酚的健康效應在很大程度上取決于其在宿主中的生物利用度，這些化合物從食物基質(zhì)中釋放，并在胃腸道消化過程中被吸收；此外，當部分多酚類物質(zhì)在小腸中吸收不良時，會以不變的形式到達大腸，在大腸中多酚會被腸道微生物轉化形成更活躍、更易吸收的代謝物，其結構不同于母體化合物[11-13]，因此，這種情況下富含多酚食物的有益作用歸因于微生物衍生的酚類代謝物，而不是母體酚類物質(zhì)的作用。

本實驗評估接種發(fā)酵對葡萄酵素發(fā)酵過程中發(fā)酵特性、總酚和總黃酮含量的影響，并對其酚類物質(zhì)進行鑒定；利用體外消化模型對酚類物質(zhì)的生物利用度進行研究；評估葡萄酵素發(fā)酵過程及腸道代謝物的抗氧化活性，旨在探討接種發(fā)酵對多酚的釋放及抗氧化能力的影響，為開發(fā)功能型葡萄酵素提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌種

夏黑葡萄購自河南省南陽市某大型超市，產(chǎn)地河南省南陽市社旗縣。

釀酒酵母31145由河南省工業(yè)微生物菌種保藏中心提供；巴氏醋桿菌CGMCC 1.41、植物乳桿菌ACCC 11095由北京生物保藏中心提供。

紅糖 市售；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、福林-酚、沒食子酸（均為分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；二氫楊梅素、楊梅素、槲皮素、山柰酚、柚皮素、花旗松素、圣草酚、芹菜素、香橙素、木犀草素、沒食子酸、兒茶素、香草酸、阿魏酸、苯甲酸、水楊酸（色譜純，純度≥98%） 美國Sigma公司；豬膽鹽、胃蛋白酶（3 000 U/g）、胰酶（250 U/mg）、α-淀粉酶（4 000 U/g） 北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 菌種培養(yǎng)基

乳酸菌通用培養(yǎng)基（MRS）：蛋白胨1%（質(zhì)量分數(shù)，下同）、牛肉浸膏0.5%、葡萄糖2%、酵母浸粉0.4%、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.02%、檸檬酸三胺0.2%、硫酸錳0.005%、吐溫80 0.1%（固體培養(yǎng)基在此基礎上加入1.5%～2%的瓊脂粉），于121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）：酵母浸膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%（固體培養(yǎng)基在此基礎上加入1.5%～2%的瓊脂粉），于121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min。

許氏醋酸菌種子培養(yǎng)基：1%葡萄糖、1%酵母膏，121 ℃滅菌20 min，使用前按體積分數(shù)3%加入無水乙醇。

1.2 儀器與設備

Neofuge 15R高速冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司；SPX生化培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司；UV752N紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；QL-861渦旋機 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；1260高效液相色譜-7890氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酵素的制備

取20 μL保藏在甘油管中的不同菌株，在相應的固體培養(yǎng)基上活化，待平板上長出單菌落，挑取一環(huán)于相應的液體培養(yǎng)基中。乳酸菌培養(yǎng)溫度37 ℃，搖床轉速200 r/min，培養(yǎng)36～72 h；酵母菌培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉速200 r/min，培養(yǎng)24 h；醋酸菌培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉速200 r/min，培養(yǎng)72 h。

挑選完好無破損的葡萄洗凈、晾干、打漿過濾，用紅糖調(diào)整糖度為18 °Brix，加入75 mg/mL的果膠酶酶解40 min后進行滅菌（60 ℃滅菌30 min），冷卻，接入體積分數(shù)5%的酵母菌，發(fā)酵6 d，于第6天接入5%的醋酸菌繼續(xù)發(fā)酵21 d，過濾除菌，于第27天接入體積分數(shù)3%的乳酸菌，繼續(xù)發(fā)酵14 d，共發(fā)酵41 d，每隔一定時間取樣[14-15]。樣品按發(fā)酵時間進行編號（如D34表示發(fā)酵第34天樣品）；編號XH表示模擬胃腸道消化后的樣品。

1.3.2 發(fā)酵特性的測定

還原糖含量的測定采用3,5-二硝基水楊酸法[16]，利用酸度計測定發(fā)酵過程中樣品的pH值，總酸含量的測定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，結果以乳酸質(zhì)量濃度計。乙醇體積分數(shù)的測定采用陳學澤[17]的方法并稍作改動，氣相色譜檢測條件：VF-WAXms色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：60 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至70 ℃，保持6 min，以5 ℃/min升至100 ℃；進樣口溫度200 ℃；氫火焰離子化檢測器溫度220 ℃；分流比5∶1，氫氣流速40 mL/min，空氣流速400 mL/min，載氣（N2）流速30 mL/min，進樣量1 μL。

1.3.3 活菌數(shù)的測定

發(fā)酵過程中乳酸菌活細胞數(shù)采用平板計數(shù)的方法，參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》操作。

1.3.4 總酚和總黃酮含量的測定

總酚含量：測定采用福林-酚法[18]，取0.1 mL稀釋到合適倍數(shù)的發(fā)酵上清液，加入6 mL蒸餾水，再加入0.5 mL福林-酚，充分混勻，快速加入1.5 mL 7.5 g/100 mL Na2CO3溶液，混合后用蒸餾水定容。將溶液在20 ℃放置2 h，然后采用紫外-可見分光光度計在765 nm波長處測定各溶液的吸光度。以沒食子酸溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為y＝0.001 0x+0.005 4（R2＝0.999 2）。

總黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[19]，取發(fā)酵液上清液1 mL加入10 mL容量瓶中，加入0.5 mL 5 g/100 mL NaNO2溶液，混勻，室溫下靜置6 min，然后加入0.5 mL 10% Al(NO3)3溶液，充分混合并在室溫下保持6 min。然后，加入4 mL 4 g/100 mL NaOH溶液，混合放置15 min，最后蒸餾水定容。采用紫外-可見分光光度計在510 nm波長處測定溶液吸光度，以蘆丁溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為y＝0.001 0x+0.005 4（R2＝0.999 3）。

1.3.5β-葡萄糖苷酶活力的測定

取0.1 mL發(fā)酵液與0.2 mL 35 mmol/L對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，p-NPG）溶液（由pH 5.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液配制），混勻，50 ℃保溫10 min，加入2 mL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應并顯色，于400 nm波長處測定吸光度。以添加等量加熱失活的酶液作為空白。酶活力單位（U）定義為pH 5.0、50 ℃反應條件下，1 min水解p-NPG產(chǎn)生1 μmol 對硝基苯酚所需要的酶量[20]。

1.3.6 葡萄酵素中酚酸含量的測定

取20 mL發(fā)酵上清液與20 mL乙酸乙酯混勻，萃取3 次，回收上清液，將回收液置于50 ℃旋轉蒸發(fā)儀上去除有機溶劑，將蒸干后的固體復溶于4 mL甲醇中，過0.45 μm濾膜，于-20 ℃保存待測[21]。高效液相色譜檢測條件：色譜柱Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A體積分數(shù)2%的乙酸溶液，流動相B乙腈；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長280 nm。

1.3.7 葡萄酵素中類黃酮含量的測定

采用Padilha等[22]的方法，取發(fā)酵上清液5 mL，稱質(zhì)量，冷凍干燥濃縮，將濃縮后的物質(zhì)復溶于1 mL甲醇中，過0.45 μm濾膜，待測。

高效液相色譜檢測條件：色譜柱ZORBAX-SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：體積分數(shù)0.1%甲酸溶液-甲醇（1∶1，V/V）；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；檢測波長320 nm。

1.3.8 體外模擬消化分析葡萄酵素酚類物質(zhì)的生物利用度

采用體外唾液和胃腸消化法評價葡萄酵素酚類物質(zhì)的生物利用度。體外模擬消化過程參照Gawlik-Dziki等[23]的方法，5 mL發(fā)酵上清液與15 mL的唾液淀粉酶溶液（0.2 U/mL）混合，置于緩沖溶液（含2.38 g/L Na2HPO4、0.19 g/L KH2PO4、8 g/L NaCl，pH 6.75）中?；旌先芤褐糜?7 ℃水浴中振蕩10 min，隨后用5 mol/L HCl溶液調(diào)整pH值至1.2，然后在pH 1.2 0.03 mol/L NaCl溶液中加入15 mL模擬胃液（含0.32%胃蛋白酶），37 ℃振蕩孵育120 min后，加入0.1 mol/L NaHCO3溶液調(diào)整pH值至6，停止胃消化。隨后加入15 mL腸消化液（含0.05 g胰酶、0.3 g膽汁提取物、0.1mol/L NaHCO3）、2.5 mL 0.12 mol/L NaCl溶液和2.5 mL 5 mmol/L KCl溶液。將混合溶液在37 ℃搖動60 min，最后得到的混合溶液在4 ℃、5 000×g離心10 min，收集上清液用于測定酚類物質(zhì)生物有效性。多酚生物利用度表示為消化后與消化前樣品中酚類物質(zhì)含量的比值。

1.3.9 抗氧化能力的測定

稱取12.5 mg DPPH溶解于甲醇中，定容到100 mL，使用時再稀釋5 倍，現(xiàn)配現(xiàn)用，取0.1 mL稀釋到合適倍數(shù)的發(fā)酵上清液加入3.9 mL DPPH-甲醇溶液中，避光反應20 min，在517 nm波長處測定吸光度[24]。以Trolox濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為y＝-0.000 5x-0.003 6（R2＝0.999 5）。根據(jù)標準曲線方程，計算得出樣品的Trolox當量抗氧化能力（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）值。DPPH自由基清除能力以TEAC值表示，單位μmol/L。

取5 mL 7 mmol/L ABTS溶液，加入88 μL 140 mmol/L過硫酸鉀-水溶液，配制ABTS工作液，靜置避光反應24 h，使用前用無水乙醇稀釋到A734nm為（0.70±0.02）。取0.1 mL稀釋到合適倍數(shù)的發(fā)酵上清液加入3.9 mL ABTS工作液，避光反應8 min，在734 nm波長處測定吸光度[20]。以Trolox濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為y＝-0.000 7x+0.009 0（R2＝0.999 9）。根據(jù)標準曲線方程，計算得出樣品TEAC值。ABTS陽離子自由基清除能力以TEAC值表示，單位μmol/L。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 葡萄酵素發(fā)酵過程中的發(fā)酵特性

由圖1A可知，接種酵母菌后，酵母菌利用葡萄糖生成乙醇，發(fā)酵0～6 d，還原糖質(zhì)量濃度由31.91 g/L下降到0.46 g/L，乙醇體積分數(shù)由0%迅速增加至7.66%。接種醋酸菌后，醋酸菌利用乙醇生成乙酸，乙醇體積分數(shù)由7.66%下降至發(fā)酵27 d的0.47%，在之后的發(fā)酵過程中乙醇體積分數(shù)和還原糖質(zhì)量濃度基本保持不變，無顯著差異。由圖1B可知，葡萄酵素發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH值呈下降趨勢，總酸質(zhì)量濃度呈升高趨勢。在發(fā)酵前6 d，pH值由3.77下降至3.67，總酸質(zhì)量濃度由4.16 g/L升高至6.31 g/L，接種醋酸菌后，發(fā)酵6～20 d，pH值和總酸質(zhì)量濃度變化不明顯，主要是由于醋酸菌啟動比較緩慢，在發(fā)酵20～27 d，醋酸菌利用乙醇分解成乙酸，pH值迅速降低為3.12，總酸質(zhì)量濃度達到最高值，為19.33 g/L，接種乳酸菌后pH值保持在3.19左右，總酸保持在19.09 g/L左右，變化差異不顯著。陳小偉等[25]研究草莓酵素自然發(fā)酵過程中總糖、總酸含量和pH值的變化表明，發(fā)酵初期酵母菌等微生物大量繁殖，糖類物質(zhì)用于微生物的增殖和合成代謝，總糖含量顯著下降，與此同時大量的次級代謝產(chǎn)物（乳酸和醋酸等有機酸）生成，總酸含量顯著增加，隨后pH值較大程度影響益生菌的繁殖以及代謝，總酸含量有輕微下降趨勢，總糖耗盡，含量接近0.40 g/mL，發(fā)酵后期微生物代謝緩慢，溶液pH值變化不顯著，以上結果與本研究中觀察的現(xiàn)象基本一致。

圖1 葡萄酵素發(fā)酵過程中還原糖含量、乙醇體積分數(shù)（A）、pH值和總酸含量（B）的變化Fig. 1 Changes in reducing sugar and ethanol contents (A), pH and total acid content (B) during the fermentation of grape jiaosu

2.2 葡萄酵素發(fā)酵過程及體外模擬胃腸道消化后乳酸菌活菌數(shù)的變化

乳酸菌因其對維持人體腸道菌群平衡、提高免疫力具有重要作用而被廣泛研究，此外，作為酵素產(chǎn)品的優(yōu)勢種群，其對最終產(chǎn)品的品質(zhì)也發(fā)揮重要作用。因此，本研究對葡萄酵素發(fā)酵過程中乳酸菌活菌數(shù)的動態(tài)變化進行研究。如圖2所示，初始乳酸菌數(shù)（D0）為8.27（lg（CFU/mL）），接入乳酸菌后7 d（即發(fā)酵34 d），乳酸菌總數(shù)下降至6.85（lg（CFU/mL）），這主要是因為發(fā)酵液經(jīng)醋酸菌發(fā)酵后，pH值較低為3.12，低pH值的環(huán)境對乳酸菌生長有一定影響，待發(fā)酵結束后（D41），乳酸菌總數(shù)達到7.53（lg（CFU/mL）），該結果與發(fā)酵液中pH值和總酸含量的變化都體現(xiàn)出乳酸菌的代謝活性。益生菌在通過胃腸道直至結腸的消化過程中能夠保持一定的存活能力，在本研究中，經(jīng)過體外消化后，乳酸菌活菌數(shù)為6.27（lg（CFU/mL）），較發(fā)酵液顯著降低（P＜0.05），主要是由于胃腸道消化液pH值較低，乳酸菌受到外界環(huán)境脅迫細胞失活，尤其是由胃液到腸液的pH值變化，這與Valero-Cases等[26]報道的益生菌發(fā)酵石榴汁經(jīng)體外消化后的活菌數(shù)變化相似。

圖2 葡萄酵素發(fā)酵過程及體外模擬胃腸道消化后乳酸菌活菌數(shù)的變化Fig. 2 Changes in viable bacterial count of grape jiaosu during fermentation and after in vitro simulated gastrointestinal digestion

2.3 葡萄酵素發(fā)酵過程及體外模擬胃腸道消化后總酚和總黃酮含量的變化

由圖3可知，葡萄酵素發(fā)酵過程中總酚、總黃酮質(zhì)量濃度呈波動上升變化，發(fā)酵結束后較未發(fā)酵時分別增加1.16 倍和0.83 倍。在酵母菌發(fā)酵（0～6 d）期間，總酚質(zhì)量濃度呈上升趨勢；接種醋酸菌（第6天）后總酚質(zhì)量濃度先降低后升高，這主要是由于pH值及微生物產(chǎn)生的酶系作用；接種乳酸菌發(fā)酵過程（27～41 d）中，總酚質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，但發(fā)酵結束后總酚質(zhì)量濃度達到最高，顯著高于其他樣品（P＜0.05），這表明微生物的相互作用會促進酚類物質(zhì)的生成。發(fā)酵過程中總黃酮質(zhì)量濃度呈波動上升的趨勢，發(fā)酵前20 d，總黃酮質(zhì)量濃度在129.18～137.97 mg/L之間，無顯著差異（P＞0.05），當醋酸菌發(fā)酵結束后，第27天時總黃酮質(zhì)量濃度顯著升高至147.36 mg/L，接種乳酸菌發(fā)酵后，總黃酮質(zhì)量濃度先略降低，后大幅升高至251.91 mg/L。經(jīng)過體外模擬消化后總酚和總黃酮含量均顯著下降（P＜0.05），這與Bao Tao等[27]的研究結果一致。體外模擬消化后總酚含量的下降可能與消化液pH值的變化有關，特別是從胃液pH 1.2到腸液pH 7.4的變化會導致酚類物質(zhì)結構的變化。

圖3 葡萄酵素發(fā)酵過程及體外模擬胃腸道消化后總酚及總黃酮含量的變化Fig. 3 Changes in total phenol and flavonoid contents of grape jiaosu during fermentation and after in vitro simulated gastrointestinal digestion

2.4 葡萄酵素發(fā)酵過程中及體外模擬胃腸道消化后β-葡萄糖苷酶活力的變化

植物中的酚類物質(zhì)通常與細胞壁中的纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)、有機酸結合形成共價化合物[28]，而微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酶系可以破壞細胞壁纖維成分的致密結構或者破壞多酚物質(zhì)與其他物質(zhì)之間交聯(lián)的共價鍵，從而促進酚類物質(zhì)的釋放和轉化，β-葡萄糖苷酶被認為是裂解交聯(lián)鍵的一類重要的酶。為闡明葡萄酵素發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)含量與β-葡萄糖苷酶活力的關系，對發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶活力進行測定，結果如圖4所示。葡萄酵素發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶活力的變化趨勢與總酚含量的變化趨勢基本保持一致，發(fā)酵0～6 d逐漸升高，接種醋酸菌（第6天）后呈先下降后上升的趨勢，接種乳酸菌發(fā)酵14 d（即發(fā)酵27～41 d）達到最大值，為266.57 μU/mL，這也進一步說明酚類物質(zhì)含量的變化與微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的水解酶系有關。閻欲曉等[29]研究黑曲霉發(fā)酵甘蔗葉中酚類物質(zhì)與β-葡萄糖苷酶活力的變化，表明酚類物質(zhì)的釋放與β-葡萄糖苷酶活力存在顯著相關性。

圖4 葡萄酵素發(fā)酵過程及體外模擬胃腸道消化后β-葡萄糖苷酶活力的變化Fig. 4 Changes in β-glucosidase activity of grape jiaosu during fermentation and after in vitro simulated gastrointestinal digestion

2.5 葡萄酵素發(fā)酵過程及體外模擬胃腸道消化后酚類化合物含量的變化

為進一步考察葡萄酵素發(fā)酵過程中不同酚類組分的變化，對發(fā)酵過程中酚酸和類黃酮進行跟蹤監(jiān)測，圖5為10 種類黃酮和7 種酚酸物質(zhì)標準品的高效液相色譜圖。在未發(fā)酵的葡萄汁（D0樣品）中檢測到6 種酚酸，分別為沒食子酸、兒茶素、香草酸、阿魏酸、苯甲酸和水楊酸，發(fā)酵結束后，樣品中各酚酸含量均顯著升高（P＜0.05），沒食子酸、香草酸和兒茶素含量較未發(fā)酵葡萄汁分別增加了6.17、4.18 倍和1.65 倍。發(fā)酵過程及體外消化后樣品中總酚酸質(zhì)量濃度為21.80～95.82 mg/L。在發(fā)酵過程中，沒食子酸、香草酸、阿魏酸、苯甲酸這4 種酚酸的含量均隨著發(fā)酵時間的延長呈波動上升的趨勢，并于發(fā)酵第41天達到最高值，這可能是由于微生物產(chǎn)生的酶系作用導致細胞壁結構降解，使酚酸類物質(zhì)從細胞壁上解離釋放。而兒茶素和水楊酸含量在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；發(fā)酵第3天，兒茶素含量較未發(fā)酵的葡萄汁（D0樣品）增加了約11.36 倍，占此時總酚酸含量的68.07%；發(fā)酵第13天，水楊酸含量較D0樣品增加了約13.04 倍，這也是導致此時總酚酸含量顯著高于其他樣品的原因（P＜0.05）。隨著發(fā)酵的進行，兒茶素和水楊酸含量呈現(xiàn)不同程度的降低，這可能是由于某些酚類化合物可以作為微生物代謝的底物。Campanella等[30]報道葡萄渣經(jīng)植物乳桿菌12A、PU1，副干酪乳桿菌14A和短雙歧桿菌15A發(fā)酵后，酚類化合物含量下降。

圖5 10 種類黃酮（A）和7 種酚酸物質(zhì)（B）標準品的高效液相色譜圖Fig. 5 High performance liquid chromatograms of mixed standard of ten flavonoids (A) and mixed standard of seven monophenols (B)

本研究鑒定出5 種類黃酮，總類黃酮質(zhì)量濃度為0.68～3.96 mg/L，其中D0樣品中僅檢測到楊梅素（0.68 mg/L）。楊梅素存在于所有發(fā)酵樣品中，是主要的類黃酮，發(fā)酵結束時占總類黃酮含量的45.35%；隨著發(fā)酵時間的延長，楊梅素含量呈先升高后降低的趨勢，并于發(fā)酵第6天時達到最大值，為2.46 mg/L。槲皮素在發(fā)酵前3 d未檢測到，在第6天時檢測到質(zhì)量濃度為1.14 mg/L，之后槲皮素含量呈上升趨勢，第27天時上升至1.92 mg/L，隨后逐漸下降。柚皮素僅在發(fā)酵第3天時檢測到，木犀草素在發(fā)酵完成（第41天）后檢測到，且均以微量存在。山柰酚在D0樣品中未檢出，但是在接種酵母菌期間，含量增加，但接種醋酸菌后含量逐漸降低直至發(fā)酵結束后檢測不出。

總的來說，發(fā)酵過程中酚類的變化可能是由于菌株中特定酶的作用，它們能夠分解植物細胞壁中的化學成分，水解酯鍵從而釋放酚類化合物[31-32]。而葡萄糖苷酶水解酚類化合物結構中糖苷鍵則是酚類化合物釋放過程中的第1步，這種酶活性可以解釋葡萄酵素發(fā)酵過程中酚類組分含量的上升。而隨著發(fā)酵的進行酚類物質(zhì)含量的下降，這歸因于pH值不斷降低以及酚類組分作為發(fā)酵微生物的代謝底物被消耗[33]。

2.6 葡萄酵素酚類物質(zhì)的生物有效性

酚類物質(zhì)通過消化液中的酶作用從食物基質(zhì)中釋放，被認為具有生物有效性。如表1所示，經(jīng)過體外模擬消化后，除水楊酸其他5 種酚酸均具有生物有效性，生物利用度為39.11%～57.77%。對于類黃酮，僅楊梅素和槲皮素具有較好的生物有效性，生物利用度分別為35.78%和42.34%。多酚的生物利用度是高度可變的，主要取決于其結構和共軛形式，因此多酚的生物利用度會受到植物組織內(nèi)含量差異、細胞壁結構的變化、細胞中糖苷位置及酚類化合物在食品基質(zhì)中的結合因素等的影響。本實驗結果與Gowd等[34]報道的楊梅多酚的生物利用度結果相似。酚類化合物的吸收取決于其物理化學特性，大部分酚類化合物屬于單體，而一些酚類化合物單體和二聚體能夠直接被小腸吸收，因此大部分酚酸具有生物有效性[35]。葡萄經(jīng)過微生物發(fā)酵，其抗氧化能力雖然低于葡萄汁，但是部分酚類物質(zhì)含量增加。葡萄酵素酚類物質(zhì)發(fā)揮其生物有效性，一方面，攝入的多酚經(jīng)過結腸微生物群代謝，多酚復雜結構中的低分子質(zhì)量部分被破壞、吸收并作用于靶器官發(fā)揮生物活性功能[36-37]；另一方面，未被吸收的酚類化合物也可能被微生物轉化為更有活性的形式[38]。本研究在XH樣品中檢測到大量乳酸菌，當酚類物質(zhì)到達結腸，其被微生物酯酶水解，發(fā)生轉化，可能對腸道細菌產(chǎn)生正向調(diào)節(jié)[39]。一項關于富含酚類物質(zhì)的蘋果皮的研究表明，在蘋果皮多酚作用下乳酸菌菌株的黏附性增強，表明這些化合物可能促進了有益微生物或原生腸道微生物群的黏附[40]。

表1 葡萄酵素發(fā)酵過程及體外模擬胃腸道消化后酚類物質(zhì)組成及含量的變化Table 1 Changes in phenol composition of grape jiaosu during fermentation and after in vitro simulated gastrointestinal digestion

2.7 葡萄酵素發(fā)酵過程及體外模擬胃腸道消化后抗氧化活性的變化

為進一步考察葡萄酵素發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化，對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力進行表征。如圖6所示，DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力的TEAC值在未發(fā)酵葡萄汁（D0樣品）中分別為364.13、887.14 μmol/L，發(fā)酵13 d均達到最高，分別為566.80、2 374.29 μmol/L，發(fā)酵27 d又逐漸分別下降至437.47、1 155.71 μmol/L，接種乳酸菌發(fā)酵期間（27～34 d），自由基清除能力與第27天時相比無顯著差異，發(fā)酵41 d分別上升至551.47、1 616.67 μmol/L，經(jīng)體外模擬胃腸道消化后，DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力的TEAC值分別為184.80、583.33 μmol/L。總的來說，發(fā)酵結束后葡萄酵素的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力相比未發(fā)酵葡萄汁分別提高了51.45%、82.23%，但是經(jīng)體外模擬消化后，由于酚類物質(zhì)含量降低，抗氧化活性也發(fā)生了不同程度的降低。

圖6 葡萄酵素發(fā)酵過程及體外模擬胃腸道消化后DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力的變化Fig. 6 Changes in DPPH and ABTS cation radical scavenging capacity of grape jiaosu during fermentation and after in vitro simulated gastrointestinal digestion

雖然發(fā)酵過程中，第13天時總酚含量低于第41天，但是抗氧化能力卻高于第41天，這主要是因為酚類物質(zhì)的抗氧化能力取決于酚類化合物的化學結構、芳香環(huán)的羥基數(shù)目、羥基位置以及羥基結構糖基化，由細菌發(fā)酵引起的酚類化合物結構變化可能與觀察到的抗氧化活性增強有關[41]。與本結果一致，一些研究結果也表明，細菌發(fā)酵后酚類物質(zhì)含量的降低和抗氧化活性的提高之間成反比[42-43]。

3 結 論

酵母菌、醋酸菌、乳酸菌依次接種發(fā)酵提高了發(fā)酵液中總酚和總黃酮含量，發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶活力與總酚含量的變化趨勢基本一致，實驗乳酸菌能在葡萄酵素及體外模擬消化環(huán)境中存活；與未發(fā)酵的葡萄汁相比，接種發(fā)酵顯著增加了沒食子酸、兒茶素、香草酸、阿魏酸、苯甲酸和水楊酸6 種酚酸的含量，其中沒食子酸、香草酸含量較葡萄汁增加了6.17 倍和4.18 倍；接種發(fā)酵促進了一些類黃酮物質(zhì)的水解，楊梅素和槲皮素的含量相比未接種時顯著提高；體外模擬消化實驗表明除水楊酸，其余5 種酚酸均具有生物有效性，對于類黃酮，楊梅素和槲皮素具有較好的生物有效性；接種發(fā)酵提高了葡萄酵素的抗氧化能力。這些研究結果表明，接種發(fā)酵不僅可以潛在地提高葡萄酵素多酚物質(zhì)的含量，還可以作為提高抗氧化活性的加工方法，這為開發(fā)功能型葡萄酵素產(chǎn)品奠定了基礎。