趙 越，陳民良，陳雪嵐,*，熊勇華

（1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330096；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

吐溫（Tween）是指一類聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，簡(jiǎn)稱聚山梨酯，作為表面活性劑，其分子中既含有親水基團(tuán)又含有親油基團(tuán)，為兩親性物質(zhì)[1-2]。根據(jù)脂肪酸鏈的不同，Tween分為Tween 20、Tween 40、Tween 60和Tween 80，其中Tween 40（聚氧乙烯山梨醇酐棕櫚酸酯）和Tween 80（聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯）由于能顯著提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量，常作為發(fā)酵促進(jìn)劑用于發(fā)酵工程[3-5]。例如，Matsushima等[6]利用谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）重組菌進(jìn)行發(fā)酵，在培養(yǎng)基中添加Tween 40時(shí)，1,5-戊二胺產(chǎn)量提高到原來的2 倍；Zotta等[7]發(fā)現(xiàn)，Tween 80對(duì)干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）N87發(fā)酵所得芳香化合物產(chǎn)量有貢獻(xiàn)。由此可見，Tween的添加有利于微生物發(fā)酵生產(chǎn)。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)分別探究Tween 40、Tween 80及Tween 80結(jié)合油酸對(duì)本課題組構(gòu)建的鈍齒棒桿菌（Corynebacterium crenatum）CCM01產(chǎn)精氨酸的影響。

FarR是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GntR家族中的一員[8-9]，該家族共同特征是N端氨基酸序列以螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的空間構(gòu)象形成DNA結(jié)合域，C端為配體結(jié)合功能域[10-11]。FarR作為大腸桿菌中脂肪酸響應(yīng)蛋白，當(dāng)其C末端配體結(jié)合功能域與環(huán)境中的長(zhǎng)鏈脂肪酸結(jié)合時(shí)，會(huì)導(dǎo)致FarR的空間構(gòu)象發(fā)生變化，而使其從DNA操縱子區(qū)域上解離，從而釋放下游基因[12-13]。在棒桿菌屬中，關(guān)于farR的研究文獻(xiàn)很少。其中，H?n?ler等[14]采用DNA微陣列技術(shù)比較了C. glutamicum的farR敲除株與野生株在轉(zhuǎn)錄水平上的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，farR敲除株中L-精氨酸合成途徑中的相關(guān)基因argJ、argB、argD和argF出現(xiàn)明顯上調(diào)；Lee等[15]通過染色質(zhì)免疫共沉淀方法發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)arR捕捉argB基因上游的調(diào)控區(qū)域量最高，并結(jié)合凝膠遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其與L-精氨酸合成途徑的阻遏蛋白ArgR（CCM01的ArgR發(fā)生了致死突變）在argB基因上游的調(diào)控區(qū)域存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，表明FarR在精氨酸合成途徑中扮演了負(fù)調(diào)控的角色。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究Tween的添加對(duì)farR轉(zhuǎn)錄的影響及其對(duì)精氨酸合成途徑的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用出發(fā)菌株為本課題組構(gòu)建的C. crenatumMT NAGK M4 ΔproBΔNcgl1221ΔdtsR1（以下簡(jiǎn)稱CCM01）。

實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）試劑盒SYBR?Premix EXTaqTMII (Tli RNaseH Plus)、DNA Maker、限制性內(nèi)切酶日本TaKaRa公司；DNA純化回收試劑盒 北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；TRIzol?Reagent提取試劑盒 美國(guó)Invitrogen公司；2×Taq(Pfu) Mix、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；Tween 40、Tween 80、油酸 天津永大化學(xué)試劑有限公司；EnzyChromTM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）/NADPH試劑盒美國(guó)BioAssay Systems公司；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Prism 7900HT real-time PCR儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司；JS-2000凝膠成像系統(tǒng) 上海培清科技有限公司；TC-96梯度PCR儀 杭州博日科技有限公司；TGL-20高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司；ZWY-2102C恒溫?fù)u床 上海智誠(chéng)科技有限公司；MicroPluserTM電轉(zhuǎn)儀 美國(guó)伯樂儀器有限公司；BG-XM 496酶標(biāo)儀 青島弘海環(huán)保設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 精氨酸發(fā)酵及Tween質(zhì)量濃度的優(yōu)化

挑取CCM01單菌落接種至5 mL LBG培養(yǎng)液（10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母膏、10 g/L氯化鈉、10 g/L葡萄糖），30 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h；取3～30 mL種子培養(yǎng)基（30 g/L葡萄糖、20 g/L硫酸銨、0.5 g/L磷酸二氫鉀、0.5 g/L硫酸鎂、20 g/L玉米漿、1.5 g/L尿素，用10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0），30 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h后，接種量按初始菌株密度達(dá)到OD562nm為0.2接種到25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基（120 g/L葡萄糖、45 g/L硫酸銨、0.05 g/L磷酸二氫鉀、0.5 g/L硫酸鎂、25 g/L玉米漿，用10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0）中，繼續(xù)于30 ℃、200 r/min發(fā)酵36 h后，向其中分別添加梯度質(zhì)量濃度（0、5、10、15、20 mg/mL）的Tween 40和Tween 80，然后優(yōu)化Tween 80（15 mg/mL）和油酸混合添加的物質(zhì)的量比（1∶0、1∶0.05、1∶0.075、1∶0.1和1∶0.2），共發(fā)酵120 h，取樣檢測(cè)生理指標(biāo)，每組做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

以上培養(yǎng)基滅菌條件均為121 ℃滅菌20 min，其中葡萄糖采用過濾除菌。

1.3.2 菌體生長(zhǎng)量測(cè)定

取200 μL菌液至酶標(biāo)板微孔中，于562 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液OD562nm，按OD562nm＝1即為0.375 g/L換算后計(jì)算發(fā)酵液中菌體細(xì)胞質(zhì)量濃度[16]。

1.3.3L-精氨酸含量測(cè)定

采用改良的坂口試劑法[17]，取發(fā)酵120 h發(fā)酵液，5 000 r/min離心后用純水稀釋適當(dāng)倍數(shù)至250 μL，加入1 mL 0.375 mol/L NaOH溶液及250 μL坂口試劑混勻，30 ℃水浴20 min，于520 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定溶液OD520nm。菌體細(xì)胞產(chǎn)精氨酸率以L-精氨酸含量與菌體細(xì)胞質(zhì)量比值表示。

1.3.4 發(fā)酵液葡萄糖消耗量的測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定發(fā)酵液中剩余的葡萄糖含量[18]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期發(fā)酵液，用超純水稀釋適當(dāng)倍數(shù)至體積為1 mL，加入750 μL DNS試劑，沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫，再稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，于540 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定溶液OD540nm。

根據(jù)發(fā)酵液中殘?zhí)橇坑?jì)算葡萄糖消耗量，糖轉(zhuǎn)化率以葡萄糖消耗量與L-精氨酸含量比值表示。

1.3.5 胞內(nèi)NADPH水平測(cè)定

按照試劑盒說明書測(cè)定胞內(nèi)NADP+/NADPH水平。取2 份1 mL發(fā)酵對(duì)數(shù)期菌液，5 000 r/min離心收集菌體，洗滌2 次后，1 份加入100 μL NADP+提取液，另1 份加入100 μL NADPH提取液，60 ℃水浴5 min后冰水中冷卻；再分別加入20 μL Assay Buffer和100 μL的Extraction Buffer，混勻后，12 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)定NADP+/NADPH水平。NADP+/NADPH反應(yīng)體系為：20 μL Assay Buffer、1 μL Enzyme Mix、10 μL葡萄糖及14 μL噻唑藍(lán)，總體積85 μL，混勻后，于562 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定0～30 min內(nèi)樣品溶液的OD值變化速率（ΔOD562nm/min）[19]。NADP+、NADPH水平以每克菌體細(xì)胞中所含NADP+、NADPH物質(zhì)的量表示，單位為μmol/g。

1.3.6 real-time PCR檢測(cè)L-精氨酸合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄

1.3.6.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)C. crenatum的基因（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/17277）設(shè)計(jì)用于real-time PCR的引物（表1），引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物及其序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.6.2 細(xì)菌總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

取發(fā)酵對(duì)數(shù)中后期菌液2 mL，5 000 r/min離心，收集菌體；按TRIzol?Reagent提取試劑盒說明書提取細(xì)菌總RNA。以經(jīng)過DNAase I處理的總RNA為模板，按SYBR?Premix EXTaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

以16S rRNA及ropB為內(nèi)參，按SYBR?Premix EXTaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書進(jìn)行real-time PCR。反應(yīng)體系（20 μL）：2×SYBR?Premix EXTaqTMII 10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，無(wú)菌水6 μL。real-time PCR反應(yīng)程序：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，循環(huán)40 次。采用2-ΔΔCt方法[20]定量分析各基因表達(dá)水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同脂肪酸鏈Tween對(duì)CCM01產(chǎn)L-精氨酸代謝的影響

2.1.1 添加Tween 40對(duì)CCM01產(chǎn)L-精氨酸代謝的影響

本實(shí)驗(yàn)以CCM01為出發(fā)菌株，在發(fā)酵對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期（36 h）添加不同質(zhì)量濃度Tween 40，探究其對(duì)CCM01菌株產(chǎn)L-精氨酸的生理代謝影響。如圖1所示，添加10 mg/mL Tween 40時(shí)，菌體細(xì)胞質(zhì)量濃度、L-精氨酸產(chǎn)量、葡萄糖消耗量均達(dá)到最高，表明此質(zhì)量濃度下Tween 40對(duì)菌株生長(zhǎng)及其產(chǎn)L-精氨酸代謝有一定的促進(jìn)作用。添加10 mg/mL Tween 40時(shí)，細(xì)胞質(zhì)量濃度較CCM01組提高了7.33%，L-精氨酸產(chǎn)量提高了11.98%（表2）。Tween 40質(zhì)量濃度進(jìn)一步提高則會(huì)對(duì)菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用，同時(shí)顯著降低L-精氨酸產(chǎn)量及葡萄糖消耗量，這可能是由于Tween 40質(zhì)量濃度過高對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，不利于CCM01菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和運(yùn)輸。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，DtsR1未缺失時(shí)，CCM01菌株發(fā)酵產(chǎn)L-精氨酸的最佳Tween 40添加量為5 mg/mL[21]。本實(shí)驗(yàn)中Tween 40的最佳添加量與其相比提高了1 倍，表明DtsR1的缺失使菌株更能耐受Tween 40。同時(shí)L-精氨酸產(chǎn)量在此條件下也達(dá)到最大，推測(cè)此時(shí)菌株可能產(chǎn)生了更多的NADPH供給L-精氨酸合成，因此監(jiān)測(cè)添加10 mg/mL Tween 40時(shí)胞內(nèi)NADPH水平。如表3所示，添加10 mg/mL Tween 40時(shí)胞內(nèi)NADPH水平達(dá)到（18.93±0.80）μmol/g，較CCM01組提高了42.01%；相應(yīng)的NADP+水平隨著NADPH水平的顯著升高而發(fā)生顯著下降，添加10 mg/mL Tween 40時(shí)胞內(nèi)NADP+水平較CCM01組下降了18.30%。說明Tween 40的添加促進(jìn)CCM01高產(chǎn)L-精氨酸可能與胞內(nèi)NADPH水平提高有關(guān)。

圖1 添加不同質(zhì)量濃度Tween 40對(duì)CCM01產(chǎn)L-精氨酸代謝的影響Fig. 1 Effects of Tween 40 on the metabolism of CCM01 for L-Arg production

表2 不同發(fā)酵條件下CCM01產(chǎn)L-精氨酸代謝參數(shù)Table 2 Metabolic parameters for L-Arg production in CCM01 under different fermentation conditions

表3 不同發(fā)酵條件下CCM01胞內(nèi)NADPH/NADP＋水平Table 3 Intracellular NADP+ and NADPH concentrations in CCM01 under different fermentation conditions

2.1.2 Tween 80和油酸添加對(duì)CCM01產(chǎn)L-精氨酸代謝的影響

高質(zhì)量濃度Tween 40的添加會(huì)誘導(dǎo)CCM01菌株生成更多的NADPH，從而為L(zhǎng)-精氨酸的合成提供更多的還原力[22]。前期工作發(fā)現(xiàn)，Tween 80的添加也可誘導(dǎo)NADPH的生成[19]，文獻(xiàn)[23-27]報(bào)道其也可作為碳源供給菌株生長(zhǎng)。因此，本課題組探究Tween 80對(duì)CCM01產(chǎn)L-精氨酸代謝的影響。如圖2所示，隨著Tween 80質(zhì)量濃度的增加，菌株細(xì)胞質(zhì)量濃度也隨之升高，Tween 80質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)達(dá)到9.33 g/L，與0 mg/mL相比，顯著增加了26.59%，但Tween 80質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)L-精氨酸產(chǎn)量最高，達(dá)到（38.10±1.34）g/L，與0 mg/mL和添加10 mg/mL Tween 40相比，分別提高了21.11%和8.15%，此時(shí)糖轉(zhuǎn)化率也達(dá)到最大（0.40±0.01）（表2），這表明Tween 80的添加對(duì)CCM01產(chǎn)L-精氨酸代謝的促進(jìn)作用優(yōu)于Tween 40。如表3所示，Tween 80質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)胞內(nèi)NADPH水平達(dá)到（26.94±1.78）μmol/g，較CCM01+10 mg/mL Tween 40組增加了42.31%，NADPH水平的進(jìn)一步提升可為L(zhǎng)-精氨酸的合成提供更多的還原力，這也證明添加Tween 80效果優(yōu)于Tween 40。

圖2 添加不同質(zhì)量濃度Tween 80添加對(duì)CCM01產(chǎn)L-精氨酸代謝的影響Fig. 2 Effect of Tween 80 on the metabolism of CCM01 for L-Arg production

圖3 Tween 80與油酸混合添加對(duì)CCM01產(chǎn)L-精氨酸代謝的影響Fig. 3 Effect of Tween 80 combined with oleic acid on the metabolism of CCM01 for L-Arg production

Tween 80合成的基本底物為油酸，但其難溶于水。Menberru等[28]報(bào)道，Tween 80及油酸按一定比例混合能促進(jìn)棒桿菌生長(zhǎng)，Tween 80包含的疏水性和親水性基團(tuán)使其能與油酸混合并分散在水介質(zhì)中，一定比例的油酸可能因其疏水性與菌株細(xì)胞膜相互作用，與Tween 80共同增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力并提高菌體生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)探討Tween 80和油酸按一定物質(zhì)的量比乳化后對(duì)CCM01產(chǎn)L-精氨酸代謝的影響，結(jié)果如圖3及表2所示。在Tween 80最佳添加量（15 mg/mL）下，當(dāng)n（Tween 80）∶n（油酸）物質(zhì)的量比為1∶0.1（即油酸添加量為0.99 mg/mL）時(shí)，細(xì)胞質(zhì)量濃度達(dá)到最大，為（9.16±0.17）g/L，較CCM01+15 mg/mL Tween 80組增加了6.39%，此時(shí)L-精氨酸產(chǎn)量、葡萄糖消耗量也達(dá)到最大值，分別為（40.74±1.58）g/L和（102.38±0.21）g/L，表明Tween 80和油酸物質(zhì)以物質(zhì)的量比為1∶ 0.1混合可以最大程度地促使細(xì)胞生長(zhǎng)，為L(zhǎng)-精氨酸的生產(chǎn)提供更多的細(xì)胞工廠，同時(shí)葡萄糖的高轉(zhuǎn)化也能為L(zhǎng)-精氨酸的合成提供更多的碳源。但隨著油酸添加量的增加，菌株生長(zhǎng)和糖消耗明顯被抑制，L-精氨酸產(chǎn)量也隨之下降，表明適當(dāng)比例的Tween 80與油酸才有助于菌株的生長(zhǎng)。按照n（Tween 80）∶n（油酸）為1∶ 0.1添加也有利于胞內(nèi)NADPH積累（表3），此時(shí)胞內(nèi)NADPH水平達(dá)到（34.07±1.86）μmol/g，較CCM01+15 mg/mL Tween 80組提高了26.47%。以上結(jié)果表明，與Tween 40和Tween 80相比，按n（Tween 80）∶n（油酸）為1∶0.1添加更有利于CCM01合成L-精氨酸。

2.2 Tween對(duì)CCM01中L-精氨酸合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.2.1 Tween對(duì)合成NADPH相關(guān)磷酸戊糖途徑基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

NADPH是精氨酸合成過程中不可或缺的還原力，在L-精氨酸合成途徑中，每合成1 mol精氨酸需要消耗3 mol NADPH，因此，NADPH供應(yīng)充足有利于L-精氨酸合成。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加不同脂肪酸鏈Tween均有助于提升CCM01菌株的NADPH供應(yīng)量，本實(shí)驗(yàn)通過realtime PCR觀察不同條件下CCM01中合成NADPH有關(guān)的磷酸戊糖途徑基因簇tkt-tal-zwf-opcA-pgl和gnd的轉(zhuǎn)錄水平。

圖4 Tween對(duì)NADPH合成相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig. 4 Effect of Tween on transcription levels of genes involved in NADPH synthesis

如圖4所示，10 mg/mL Tween 40、15 mg/mL Tween 80及按n（Tween 80）∶n（油酸）為1∶0.1添加均可使CCM01磷酸戊糖途徑的基因簇tkt-tal-zwf-opcA-pgl和gnd轉(zhuǎn)錄水平得到提高，且n（Tween 80）∶n（油酸）為1∶0.1添加組各基因轉(zhuǎn)錄水平均較高，這與該添加組高產(chǎn)L-精氨酸的結(jié)果相符。

2.2.2 Tween對(duì)L-精氨酸生物合成途徑相關(guān)基因及farR轉(zhuǎn)錄水平的影響

在谷氨酸棒桿菌中，脂肪酸響應(yīng)蛋白FarR可響應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境中的脂肪酸酯，下調(diào)farR轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)L-精氨酸合成途徑中相關(guān)基因（gdh、argB和argG）的轉(zhuǎn)錄水平，F(xiàn)arR在L-精氨酸合成中扮演了負(fù)調(diào)控的角色[29-30]。據(jù)此，為了解在CCM01中添加Tween對(duì)farR轉(zhuǎn)錄水平的影響及其變化對(duì)L-精氨酸生物合成途徑相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，本實(shí)驗(yàn)通過real-time PCR檢測(cè)L-精氨酸合成途徑的相關(guān)基因gdh、argB、argG及farR轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖5所示。添加不同脂肪酸鏈的Tween不同程度下調(diào)了farR基因轉(zhuǎn)錄水平，尤其是n（Tween 80）∶n（油酸）為1∶0.1組中，farR的轉(zhuǎn)錄水平較CCM01組高度顯著下調(diào)（P＜0.001），為最低水平；相應(yīng)地，gdh、argB和argG基因的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高，這與此條件下精氨酸產(chǎn)量最高的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

圖5 Tween對(duì)L-精氨酸生物合成途徑相關(guān)基因及farR轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 5 Effect of Tween on transcription levels of genes involved in the L-Arg biosynthetic pathway and farR

3 結(jié) 論

CCM01中敲除的DtsR1是脂肪酸合成途徑的起始關(guān)鍵酶——乙酰輔酶A羧化酶，其缺失阻斷了脂肪酸的合成，從而減少了NADPH消耗，有利于L-精氨酸的合成[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該蛋白的缺失可提高菌株對(duì)高質(zhì)量濃度Tween的耐受，相對(duì)較高質(zhì)量濃度的Tween可以進(jìn)一步提高CCM01精氨酸積累，究其原因是，一方面，提高了磷酸戊糖途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平，從而為L(zhǎng)-精氨酸合成提供了充足的NADPH；另一方面，Tween下調(diào)了脂肪酸響應(yīng)蛋白FarR的表達(dá)，F(xiàn)arR作為L(zhǎng)-精氨酸合成途徑的負(fù)調(diào)控因子，其下調(diào)導(dǎo)致L-精氨酸合成相關(guān)基因argB、argG和gdh的上調(diào)，這也有利于L-精氨酸的合成。綜上所述，Tween 40、Tween 80及適當(dāng)比例Tween 80和油酸的混合添加，不僅能提高CCM01的NADPH供應(yīng)，且能通過下調(diào)FarR的表達(dá)進(jìn)而上調(diào)L-精氨酸合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平，從兩方面提高精氨酸產(chǎn)量。