張燕紅， 黃 山， 高詩娟， 李玉琳， 杜 杰△

（1山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 太原 030001；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京市心肺血管疾病研究所血管生物研究室，北京 100029）

混合譜系激酶3（mixed lineage kinase 3，MLK3）又被稱為MAP3K11（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 11），是一種分子量為97 kD 的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于絲裂原活化蛋白激酶（mito?gen-activated protein kinase，MAPK）級聯(lián)途徑的重要分子，接收多種來自細胞表面受體的信號傳導(dǎo)，包括受體酪氨酸激酶、趨化因子受體和細胞因子受體等，通過磷酸化并活化MAPK 激酶，介導(dǎo)下游MAPK 成員c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38 和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶的活化，參與調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞凋亡等［1-2］。研究證實MLK3 在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如MLK3基因敲除鼠心功能下降，血壓升高［3-4］，MLK3基因缺失促進小鼠血管內(nèi)膜新生等［5］。鑒于MLK3 廣泛表達于心臟、主動脈、肺和肝等多種組織細胞中，為特異性探索心血管疾病發(fā)生過程中MLK3 在血管平滑肌細胞中的作用與機制，本研究利用Cre/loxP 重組酶系統(tǒng)，構(gòu)建了平滑肌細胞特異性MLK3基因敲除小鼠，為后期研究奠定基礎(chǔ)。這種基于平滑肌細胞特異性敲除MLK3的小鼠模型目前還未見報道。

材料和方法

1 儀器和試劑

鼠尾裂解液DirectPCR Lysis Reagent 購于Via?gen Biotech；蛋白酶K 購于TIANGEN；抗MLK3 抗體購于CST；抗肌球蛋白重鏈11（myosin heavy chain 11，Myh11）抗體購于武漢塞維爾公司。采用Bio-Rad 凝膠成像分析儀采集DNA 圖像；采用Leica 激光共聚焦顯微鏡（TCS 4D）采集免疫熒光圖像；采用北京軟隆公司的小動物血壓監(jiān)測儀（BP-2010A）測定小鼠血壓；采用深圳雷杜公司的全自動生化分析儀（Chemray 800）分析小鼠外周血生化指標(biāo)。

2 方法

2.1 平滑肌細胞特異性MLK3 基因敲除小鼠的構(gòu)建首先構(gòu)建MLK3-loxP 轉(zhuǎn)基因小鼠（MLK3wt/fl），步驟如下：構(gòu)建靶向MLK3基因4～8 號外顯子兩端的基因打靶載體，并電轉(zhuǎn)至胚胎干（embryonic stem，ES）細胞，篩選Southern 陽性的ES 克隆進行胚胎顯微注射，最終獲得MLK3wt/fl小鼠（由賽業(yè)生物科技有限公司協(xié)助完成）。將MLK3wt/flF0 代成年小鼠與攜帶平滑肌細胞特異表達Cre 重組酶的Tagln-Cre 小鼠（賽業(yè)公司惠贈）交配，得到F1 代Tagln-Cre/MLK3wt/fl小鼠，F(xiàn)1 代之間交配，得到MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠，對照組為MLK3fl/fl/WT。實驗小鼠均飼養(yǎng)在SPF 級環(huán)境，清潔飲食，溫濕度適宜。本實驗得到北京安貞醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2.2 小鼠基因型的鑒定收集雜交后子代小鼠鼠尾，加入蛋白酶K 和鼠尾裂解液（1∶100）的混合液100 μL，56 ℃消化過夜，85 ℃變性30 min，提取基因組DNA 并進行PCR 擴增，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，確定小鼠基因型。PCR 擴增引物如下：MLK3-loxP 的上游引物序列為5'-CAACACTGAAAACGGC?CACATTA-3'，下游引物序列為5'-AAAGGGAACAT?GCTTGTGAGTCT-3'；Tagln-Cre 的上 游引 物序 列為5'AGGTGGCTTGTTTGTCCC-3'，下游引物序列為5'-CGCCGCATAACCAGTGAAACAG-3'。PCR 退火溫度為59 ℃。

2.3 免疫熒光檢測血管平滑肌細胞MLK3的表達分離經(jīng)基因型鑒定為MLK3fl/fl/WT 和MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠的主動脈，制備冰凍切片，室溫晾干后，4%多聚甲醛固定，PBS洗后，室溫封閉，加入抗MLK3的抗體及抗血管平滑肌細胞標(biāo)志物Myh11抗體，4 ℃孵育過夜，熒光II 抗染色，室溫40 min，DAPI 封片液封片。激光共聚焦顯微鏡采圖。

2.4 免疫組化檢測血管平滑肌細胞Myh11 的表達分離經(jīng)基因型鑒定為MLK3fl/fl/WT 和MLK3fl/fl/Tagln-Cre小鼠的主動脈，制備石蠟切片，脫蠟后抗原修復(fù)，3% 雙氧水溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉后加入抗Myh11 的抗體，4 ℃孵育過夜，室溫平衡30 min，PBS 洗后加入Ⅱ抗，室溫50 min，PBS 洗后DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，甘油明膠封片。圖像采集分析，統(tǒng)計陽性面積比率。

2.5 小鼠血壓的測定使用BP-2010A 智能無創(chuàng)血壓計測量血壓：將小鼠固定在配有鼠網(wǎng)的鼠袋中，放于保溫筒上保持恒溫，將傳感器置于小鼠的尾根部，連續(xù)測量血壓后取平均值。

2.6 小鼠血糖和血脂的檢測收集MLK3fl/fl/WT 和MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠的外周血，4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，取上清液，用全自動生化分析儀自動測定葡萄糖（glucose，Glu）、糖化血清蛋白（glycosylated serum protein，GSP）、甘油三脂（triglyceride，TG）、總膽固醇（cholesterol，CHO）、高密度脂蛋白（high-den?sity lipoprotein，HDL）和低密度脂蛋白（low-density li?poprotein，LDL）等指標(biāo)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。組間比較采用t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 平滑肌特異性MLK3基因敲除小鼠的構(gòu)建

利用ES 細胞基因打靶技術(shù)在MLK3基因第4～8外顯子兩端插入loxP 位點以制備MLK3wt/fl小鼠，將其F0 代成年小鼠與攜帶平滑肌細胞特異表達Cre 酶的Tagln-Cre 小鼠交配，得到F1 代MLK3wt/fl/Tagln-Cre 小鼠，F(xiàn)1 代之間交配，得到MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠，對照組為MLK3fl/fl/WT，見圖1。

Figure 1.Schematic diagram of the generation of smooth muscle cell-specific MLK3 knockout mice.圖1 平滑肌特異性MLK3基因敲除小鼠構(gòu)建示意圖

2 平滑肌特異性MLK3基因敲除小鼠基因型的鑒定

鼠尾基因組DNA 經(jīng)PCR 擴增后，經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。圖2A是對MLK3-loxP序列擴增的結(jié)果，野生型MLK3 片段為219 bp，MLK3-loxP 片段為341 bp；圖2B 是對Tagln-Cre 序列擴增的結(jié)果，Tagln-Cre陽性小鼠可擴增得到929 bp的條帶，而WT小鼠則無目的條帶。上述鑒定結(jié)果表明，MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠即平滑肌特異性MLK3基因敲除小鼠。

Figure 2.Genotyping of MLK3fl/fl/Tagln-Cre mice.A：the electrophoresis bands of MLK3-loxP fragments；B：the electrophoresis bands of Tagln-Cre fragments.圖2 平滑肌特異性MLK3基因敲除小鼠基因型的鑒定

3 免疫熒光證實敲除MLK3 基因的平滑肌細胞無相應(yīng)蛋白表達

為了進一步驗證平滑肌特異性MLK3基因敲除小鼠構(gòu)建成功，我們將MLK3 及平滑肌細胞特異性標(biāo)志物Myh11 進行免疫熒光共染，檢測平滑肌細胞中MLK3 的表達。如圖3 所示，MLK3fl/fl/WT 小鼠主動脈平滑肌細胞表達MLK3，而MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠主動脈平滑肌細胞幾乎檢測不到MLK3 的表達。此結(jié)果表明平滑肌細胞特異性敲除MLK3成功。

4 免疫組化表明平滑肌敲除MLK3 導(dǎo)致收縮標(biāo)志物Myh11表達下降

特異性敲除小鼠構(gòu)建成功后，我們首先探討MLK3敲除是否影響平滑肌細胞的收縮功能。為此，用免疫組化染色的方法檢測了平滑肌細胞收縮標(biāo)志物Myh11 的表達。如圖4 所示，與MLK3fl/fl/WT 小鼠相比，MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠主動脈平滑肌細胞的Myh11 陽性面積百分比減少，表明平滑肌細胞特異敲除MLK3基因可能影響血管平滑肌細胞的收縮功能，具體的作用機制將在后續(xù)的研究中探討。

5 平滑肌特異性MLK3 基因敲除小鼠基礎(chǔ)狀態(tài)下血壓正常

Figure 3.Immunofluorescence analysis of MLK3 expression in smooth muscle cells from MLK3fl/fl/WT and MLK3fl/fl/Tagln-Cre mice.圖3 免疫熒光檢測平滑肌特異敲除MLK3基因后MLK3蛋白的表達

Figure 4.Immunohistochemical analysis of Myh11 expression in smooth muscle cells from MLK3fl/fl/WT and MLK3fl/fl/Tagln-Cre mice.Mean±SD. n=4.*P<0.05 vs MLK3fl/fl/WT group.圖4 免疫組化檢測平滑肌細胞收縮標(biāo)志物Myh11的表達

為了評價平滑肌細胞MLK3敲除是否影響了小鼠的基礎(chǔ)表型，我們首先檢測了小鼠血壓情況。利用智能無創(chuàng)血壓儀通過尾套法測定8～10 周齡小鼠收縮壓（systolic blood pressure，SBP）及舒張壓（dia?stolic blood pressure，DBP），結(jié)果顯示，MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠與MLK3fl/fl/WT 對照小鼠相比血壓的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖5。

6 平滑肌特異性MLK3 基因敲除小鼠基礎(chǔ)狀態(tài)下血糖和血脂正常

Figure 5.Blood pressure of MLK3fl/fl/Tagln-Cre and MLK3fl/fl/WT mice.SBP：systolic blood pressure；DBP：diastolic blood pressure.Mean±SD. n=6.圖5 平滑肌特異性MLK3基因敲除小鼠的血壓

利用全自動生化儀檢測了8～10 周齡MLK3fl/fl/Tagln-Cre 鼠與MLK3fl/fl/WT 對照鼠的血糖及血脂水平，結(jié)果如圖6 所示。與MLK3fl/fl/WT 對照鼠相比，MLK3fl/fl/Tagln-Cre 鼠上述指標(biāo)的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，說明基礎(chǔ)狀態(tài)下，平滑肌細胞特異性敲除MLK3不影響血糖及血脂等生化指標(biāo)。

Figure 6.Plasma levels of lipids and glucose in MLK3fl/fl/Tagln-Cre mice.TG：triglyceride；CHO：cholesterol；HDL：high-density li?poprotein；LDL：low-density lipoprotein；Glu：glucose；GSP：glycosylated serum protein.Mean±SD. n=6.圖6 平滑肌特異性MLK3基因敲除小鼠的血糖和血脂

討 論

MLK3 也被稱為MAP3K11，于1994 年首次被發(fā)現(xiàn)［6］。MLK3 作為MAPK 信號通路的重要激酶，在多種組織及細胞中廣譜表達，可調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡等進程。其參與調(diào)控的生理及病理進程具有一定的組織特異性，從而在多種疾病包括腫瘤、神經(jīng)退行性變及心血管疾病等的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用［7］。在腫瘤中，MLK3 促進癌細胞存活、遷移、耐藥性和腫瘤免疫等，是乳腺癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌的潛在治療靶點［1］；在神經(jīng)退行性疾病包括帕金森病和阿爾茨海默病等，MLK3通過激活JNK 介導(dǎo)神經(jīng)元細胞死亡［8-9］。近年來，MLK3 在心血管病的發(fā)生發(fā)展中的作用受到關(guān)注。MLK3 在肥厚性心肌病患者的心肌中表達增加。MLK3 通過激活抗肥厚性JNK信號，抑制壓力負荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥大、心功能下降和心臟重塑，從而發(fā)揮保護作用［3］。血管內(nèi)膜新生是血管介入術(shù)后再狹窄形成的重要機制，而MLK3通過抑制RhoA 的活化抑制血管內(nèi)膜新生［5］，為血管介入術(shù)后再狹窄提供新的干預(yù)策略。

血管平滑肌細胞作為血管壁中層主要的細胞類型，其功能及數(shù)量對于維持動脈外周阻力、血壓調(diào)節(jié)、血流的分布和動脈的修復(fù)至關(guān)重要［10］。成熟、分化的血管平滑肌細胞表達平滑肌細胞特異性標(biāo)志物，包括MYH11、TAGLN（又叫SM22α）及ACTA2（actin alpha 2）［11］，并構(gòu)成收縮表型。成熟的血管平滑肌細胞幾乎不增殖并保持較低的合成活性。病理因素作用下，如高脂、炎癥、血管損傷及持續(xù)機械張力作用等［12-13］，血管平滑肌細胞表現(xiàn)出顯著的功能可塑性，發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，即由收縮表型轉(zhuǎn)換為合成和增殖表型，表現(xiàn)為血管平滑肌細胞收縮標(biāo)志物表達降低，增殖、遷移和合成細胞外基質(zhì)等能力增強［14］。血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化是多種血管疾病，包括動脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄和主動脈瘤等共同的細胞病理基礎(chǔ)［12，15-17］。多種信號通路包括MAPK等參與調(diào)控血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化。探討不同病理狀態(tài)下VSMC 表型轉(zhuǎn)化的分子機制有助于提高對疾病發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的認(rèn)識。本研究發(fā)現(xiàn)平滑肌細胞特異性MLK3基因敲除小鼠的血管平滑肌細胞收縮標(biāo)志物Myh11表達下降，提示MLK3參與維持血管平滑肌收縮功能及血管穩(wěn)態(tài)。后續(xù)的研究將重點探討MLK3 維持血管穩(wěn)態(tài)及在不同血管疾病中的作用與機制。

由于MLK3 廣泛表達于多種組織細胞，并且MLK3調(diào)控的生物學(xué)過程具有一定的組織特異性，為更準(zhǔn)確地研究MLK3 在血管平滑肌細胞中的功能，我們采用基于Cre/loxP 重組酶的條件性基因敲除策略，構(gòu)建了平滑肌特異性MLK3基因敲除小鼠。Cre/loxP 重組酶系統(tǒng)可實現(xiàn)位點特異性的基因重組，是構(gòu)建條件性基因敲除鼠的經(jīng)典方法。本研究中，我們首先通過ES 打靶技術(shù)在小鼠MLK3基因的4～8 號外顯子兩端插入loxP 位點，獲得了MLK3-loxP 小鼠，進而與平滑肌細胞特異性啟動子Tagln 介導(dǎo)表達Cre重組酶的小鼠雜交。Tagln 啟動子特異性介導(dǎo)平滑肌細胞表達Cre 重組酶，表達的Cre 重組酶識別MLK3基因的4～8 號外顯子兩端插入的loxP 位點并切除中間的DNA 序列，從而實現(xiàn)了平滑肌特異性敲除MLK3基因。利用Tagln啟動子介導(dǎo)平滑肌細胞特異表達Cre 酶構(gòu)建平滑肌特異敲除鼠模型已在多篇文章中報道［18-20］，證實了該啟動子的特異性及有效性。為了在蛋白水平進一步證實敲除小鼠構(gòu)建成功，我們用免疫熒光染色檢測了血管組織中MLK3蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)野生型小鼠的MLK3 在血管內(nèi)皮細胞及中層平滑肌細胞均有表達，而平滑肌細胞特異性MLK3基因敲除小鼠的內(nèi)皮細胞有MLK3 表達而中層平滑肌細胞檢測不到MLK3 的表達，證實平滑肌細胞特異性MLK3基因敲除小鼠構(gòu)建成功。進而，我們評價了該品系小鼠的基礎(chǔ)表型，發(fā)現(xiàn)該小鼠的血壓、血脂等指標(biāo)沒有變化，但血管平滑肌收縮標(biāo)志物Myh11的表達降低，表明MLK3基因缺失可能影響了血管平滑肌細胞的收縮功能。既往研究發(fā)現(xiàn)，MLK3基因全身敲除鼠的基礎(chǔ)血壓升高［3-4］，但我們在平滑肌細胞特異性MLK3基因敲除小鼠中未觀察到基礎(chǔ)血壓的變化，提示MLK3 對血壓的調(diào)控作用可能不依賴于其在平滑肌細胞中的功能。眾所周知，血管壁的主要組成細胞內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞均參與血壓維持。我們的免疫熒光結(jié)果表明，MLK3在血管內(nèi)皮細胞也有高表達，基于上述結(jié)果，我們考慮血管內(nèi)皮細胞中的MLK3 在維持血壓中發(fā)揮重要作用，具體的作用及機制還需深入探討。

綜上所述，平滑肌細胞特異性MLK3基因敲除小鼠構(gòu)建成功。利用該動物模型可重點探討血管平滑肌細胞中MLK3 維持血管穩(wěn)態(tài)及在不同血管疾病中的作用與機制。