甄寧新, 崔 巍, 田寶平
(浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院重癥醫(yī)學科,浙江 杭州 310009)
免疫系統(tǒng)由先天性免疫和適應性免疫組成。先天免疫反應作為機體免疫防御的第一道防線,能通過模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)迅速識別入侵體內的病原體及組織或細胞受到損傷、低氧等因素刺激后釋放的內源性損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs),進而產(chǎn)生快速而非特異性的免疫應答[1]。線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)作為一種損傷相關分子模式,在激活先天免疫反應、促進炎癥的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用[2]。mtDNA 的釋放與炎性疾病的發(fā)生發(fā)展相關[2]。隨著對胞質DNA感受器探索的深入,研究者們發(fā)現(xiàn)胞質DNA 感受器——環(huán)鳥苷酸-腺苷酸[cyclic GMP-AMP,cGAMP]合成酶(cGAMP syn?thase,cGAS)能識別胞質中的mtDNA,激活下游干擾素基因刺激因子[stimulator of interferon(IFN)genes,STING),進而促進I 型IFN、腫瘤壞死因子α、白細胞介素6等的釋放[3-4]。cGAS-STING通路在機體抵抗病原體方面發(fā)揮了重要作用,也有研究表明該信號通路的紊亂參與了腫瘤、自身免疫性疾病和炎性疾病的發(fā)生[5-9]。本文就mtDNA、cGAS-STING通路與肺部炎性疾病之間的關系進行綜述,回顧相關藥物研究的成果,為進一步明確炎性疾病的發(fā)病機制,相應靶向治療的策略提供參考資料。
1.1 mtDNA 激活免疫系統(tǒng)人mtDNA 的核苷酸序列于1981 年確定,它是一個16 569 bp 的雙鏈環(huán)狀分子,編碼37 個基因,能夠表達幾種參與氧化磷酸化的關鍵蛋白質,在細胞能量代謝中發(fā)揮關鍵作用[10]。此外,近年來的研究表明,mtDNA 可以作為一種免疫刺激物在免疫應答方面發(fā)揮重要作用。Collins 等[11]最早在2004 年報告了mtDNA 的免疫刺激潛力,將mtDNA 注射到小鼠關節(jié)中會引起關節(jié)炎,提示游離的mtDNA 可能作為免疫刺激物促進炎癥的發(fā)生。目前認為,mtDNA 主要通過3 種信號通路在免疫反應中發(fā)揮作用。(1)Toll 樣受體9(Toll-like receptor-9,TLR-9):有學者認為線粒體起源于20 多億年前的α-變形桿菌,因此也擁有類似于細菌DNA 未甲基化的CpG 序列,該序列能被TLR-9 識別并激活核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路,介導炎癥反應[12-15]。(2)cGAS-STING 通路:當mtDNA 進入胞質,能夠被胞質中的核酸感受器cGAS 識別,從而激活cGAS-STING 信號通路,引起I 型IFN 介導的免疫反應[3]。(3)mtDNA 還可以激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體,后者可導致procaspase-1 自剪切成活化形式,活化的caspase-1 可促進IL-1β 和IL-18 的成熟和釋放,從而誘發(fā)炎癥反應[16]。因此,當mtDNA 作為一種自身免疫刺激物釋放到胞質或循環(huán)后會激活多種信號通路,促進炎癥因子分泌,引起一系列免疫反應。
1.2 mtDNA 的釋放機制任何存在于胞質或循環(huán)中的自身DNA 都是一種潛在的免疫刺激物,可與多種PRRs 結合,促進炎癥的發(fā)生。其中,線粒體中的mtDNA 釋放到細胞質已成為cGAS-STING 途徑激活的重要觸發(fā)因素[17-18]。mtDNA 位于線粒體基質中,必須穿越線粒體內膜和線粒體外膜兩層障礙才能到達細胞質中[19]。
目前,許多研究顯示了線粒體外膜通透化(mito?chondrial outer membrane permeabilization,MOMP)與mtDNA 釋放之間的聯(lián)系。在細胞凋亡過程中,Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax和Bak受到凋亡刺激后,在線粒體外膜寡聚,誘導MOMP,并介導細胞色素C 的釋放及caspase 的激活,最終引起細胞凋亡[20]。利用多種顯微鏡技術觀察受到凋亡刺激的完整細胞的線粒體顯示,Bax和Bak蛋白激活和寡聚化后,線粒體外膜上這2種蛋白聚集的部位出現(xiàn)大孔,線粒體內膜通過這些大孔擠入細胞質中,形成線粒體疝,促使包括mtDNA 在內的線粒體基質內容物進入細胞質[21]。這一過程還涉及到擠入胞質的線粒體內膜通透性的改變。在凋亡刺激和抑制caspase 的條件下,MOMP 發(fā)生后不久,線粒體內膜對小離子的通透性增加[22]。在不同的研究中線粒體內膜通透性的變化程度不同[21-22]。關于線粒體內膜如何通透,其通透過程是否受到調控,目前尚不清楚。值得注意的是,以往的研究認為強烈的促凋亡刺激會導致MOMP 快速擴散到細胞中的所有線粒體,這一過程是完全且同步的,被認為是觸發(fā)細胞死亡不可逆轉的關鍵步驟[23]。但最近的研究使用一種新的成像技術顯示,在亞致死劑量的刺激下,MOMP 僅發(fā)生在有限數(shù)量的線粒體中,且不會導致細胞死亡,這一現(xiàn)象被稱為少數(shù)MOMP,會導致DNA 損傷和基因組不穩(wěn)定,并且可以介導促炎信號的傳導以抑制體內多種病原體的生長[24-25]。目前,少數(shù)MOMP 的生物學功能仍未知,部分線粒體被選中發(fā)生MOMP的潛在機制需要更深入的研究。
mtDNA 釋放的另一個潛在機制是通過線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)[18,26]。親環(huán)蛋白D(cyclophilin D,CypD)被認為對mPTP的形成至關重要,而環(huán)孢菌素A(cyclospo?rin A)是CypD 的抑制劑,能抑制線粒體膜通透性的改變,減少釋放到胞質的mtDNA[18,26]。但與之相矛盾的是,有研究顯示誘導線粒體片段化及CypD 的缺失對MOMP誘導的mtDNA釋放沒有影響[27]。
mtDNA 在凋亡細胞中的釋放機制已經(jīng)被廣泛研究,但目前其在活細胞中的釋放機制并不統(tǒng)一。上文提到的少數(shù)MOMP是一種在活細胞中介導mtDNA釋放的可能機制[24]。另一種可能的機制是,氧化應激的刺激,不足以激活Bak 和Bax 蛋白,但可引起電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion chan?nels,VDAC)的低聚,在線粒體外膜上形成大孔,介導mtDNA 片段的釋放[22,28]。 此外,mtDNA 能與VDAC1 的N 末端結構域中帶正電荷的殘基相互作用,促進VDAC1 的寡聚,形成前饋循環(huán),進一步增加mtDNA 的釋放[22]。另外,一項關于胃腸道嗜酸性粒細胞脫顆粒的研究顯示,在沒有細胞死亡的情況下,胃腸道嗜酸性粒細胞釋放mtDNA 而不是核DNA,這一過程可被活性氧生成抑制劑阻止,且通過延時自動共聚焦成像(time-lapse automated confocal imaging)分析單細胞中DNA 釋放的動力學后觀察到,mtDNA的釋放發(fā)生在1 s 內,單個嗜酸性粒細胞以彈射器樣的方式釋放mtDNA,但不同嗜酸性粒細胞的釋放時點有所不同[29]。不過,關于引起這種彈射釋放的能量是如何產(chǎn)生和存儲的仍有待進一步研究。不同的是,在大量嗜酸性粒細胞群體中評估顯示,mtDNA 的釋放要慢得多,細胞外mtDNA 的水平持續(xù)上升長達30~60 min[30]。造成這種差異的原因可能是其分泌具有的不同分子機制。
2.1 cGAS-STING 通路Sun 等[3]在2013年通過分離純化,鑒定了一種環(huán)化核苷酸合成酶(cGAS),并揭示了一種新型的免疫信號傳導機制,即cGASSTING 信號通路。cGAS 是一種位于胞質的核酸感受器,能夠識別出現(xiàn)在胞質中的各種來源的雙鏈DNA,與之結合形成二聚體,隨后cGAS 發(fā)生構象變化,從而促進ATP 和GTP 轉化為cGAMP。cGAMP 是一種第二信使,它與錨定在內質網(wǎng)的STING 結合,誘導其C末端尾巴的構象發(fā)生變化,構象變化的STING從內質網(wǎng)轉移到高爾基體,并能募集TANK 結合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1),使它和轉錄因子IFN調節(jié)因子3(IFN regulatory factor 3,IRF3)磷酸化,后者可入核促進IFN 刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的大量轉錄,從而引起I型IFN介導的免疫反應。另外,STING 還可以激活IκB 激酶,使IκB磷酸化,釋放NF-κB 進入細胞核,與IRF3 和其他轉錄因子一起發(fā)揮功能,誘導IFN 和炎性細胞因子如TNF、IL-1β和IL-6的表達,促進炎癥發(fā)生[31]。
2.2 mtDNA激活cGAS-STING信號通路多種致病因素導致的細胞應激狀態(tài)可通過某些尚未闡明的機制使mtDNA 釋放到胞質。胞質mtDNA 作為cGAS 的配體激活STING 通路的作用在許多研究中已經(jīng)被證實[4,32]。線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcrip?tion factor A,TFAM)在維護mtDNA 穩(wěn)定方面發(fā)揮著至關重要的作用。 West 等[4]在TFAM雜合敲除(TFAM+/-)小鼠模型和皰疹病毒感染的小鼠胚胎成纖維細胞中的研究顯示,TFAM敲除會導致mtDNA 包裝蛋白TFAM 丟失,引起細胞mtDNA應激,mtDNA釋放到胞質中激活cGAS-STING-TBK1-IRF3信號通路,上調ISGs的表達并增強I型IFN 對病毒感染的反應。但Song 等[33]的研究結果與之相反,TFAM 蛋白水平的降低導致細胞質中mtDNA 拷貝數(shù)減少,并抑制牛分枝桿菌在骨髓基質細胞中誘導產(chǎn)生I 型IFN。造成這種差異的原因并未闡明,可能是由于細胞類型和病原體不同。mtDNA 的胞質異位以及隨后的cGAS-STING 激活是腎損傷和纖維化的關鍵調節(jié)因子。TFAM敲除小鼠中mtDNA 胞質異位,促炎細胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β 和CCL2 水平升高并募集巨噬細胞,且STING 通路活化和NF-κB 水平升高,最終引起小鼠腎臟炎癥和纖維化;這種病理改變可以被STING 抑制劑所緩解[32]。肥胖癥會誘發(fā)mtDNA 釋放,從而觸發(fā)cGAS-STING 途徑的激活,導致脂肪組織中慢性無菌炎癥反應的增加[34]。另外,如前文所述,細胞接受凋亡信號后線粒體上形成Bak/Bax 孔,誘導MOMP,被認為是釋放mtDNA 到胞質的途徑,但值得注意的是,凋亡細胞通過Bak/Bax 孔同時釋放的細胞色素C 促進了凋亡小體的形成和下游caspase-3和caspase-7 的激活,這會抑制mtDNA 介導的cGASSTING 途徑的IFN 反應,從而減輕mtDNA 釋放引起的無菌性炎癥[35-36]。
3.1 急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)與cGAS-STING 通路的激活目前ARDS的發(fā)病率和病死率仍然很高,其發(fā)病率占入住ICU 患者的10.4%,死亡率約為40%[37]。ARDS 病理特征主要為彌漫性肺泡損傷,從而導致肺泡內液體滲出增加,清除減少,促進肺水腫和透明膜形成,肺內分流增加和通氣血流比例失調,最終導致頑固性低氧血癥[38]。目前認為,失控的炎癥反應是導致ARDS進展的中心環(huán)節(jié)。在治療方面,以支持治療為主的非藥物治療(包括通氣策略的改變、俯臥位通氣、體外膜氧合的應用等)取得了一定的進展,有效降低了ARDS 患者的病死率[39];但相關藥物治療并未取得較為理想的進展,究其根本,是由于ARDS 發(fā)生及發(fā)展的病理生理分子機制尚未完全明確,無相應的靶向治療藥物。近年來,有研究關注到mtDNA與ARDS病理過程之間的關聯(lián)。
組織細胞損傷釋放mtDNA 被認為是炎癥病理學發(fā)展的關鍵因素。最近的研究表明,患者血清、血漿及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中mtDNA 含量升高與ARDS 發(fā)生率之間存在相關性[15,40]。一項臨床研究觀察到,ARDS 患者血清及BALF 中mtDNA 的水平較對照組均顯著升高,其水平高低與患者的預后相關,并且在ARDS 早期,BALF 中mtDNA 的升高遠高于血清[15]。在多種病理狀態(tài)(如創(chuàng)傷、膿毒癥等)下,患者血清mtDNA 水平普遍升高,這可能是由于mtDNA 作為觸發(fā)炎癥發(fā)生和擴大的啟動分子,是多種疾病進展的共同啟動因子[41-42]。在臨床應用中,血清mtDNA 這一指標診斷ARDS的特異性并不高,并且僅有對炎癥損傷的提示作用。此外,BALF 中的mtDNA 水平對ARDS 的預測是否具有更高的敏感性,需要更多的臨床研究闡明。
另一個有趣的現(xiàn)象是,當把mtDNA 通過循環(huán)系統(tǒng)輸入體內時會引起急性肺損傷(acute lung injury,ALI)。在研究輸血相關ALI(transfusion-related ALI,TRALI)時,通過對血制品中的mtDNA DAMPs 進行測定顯示,mtDNA 主要存在于堆積的紅細胞、新鮮冰凍血漿和血小板中,表明mtDNA 可能與TRALI 的發(fā)生有關[43]。那么輸血是否可以看作是將累積在血制品中的mtDNA 人為地輸入患者體內?這一想法在動物實驗中也得到了驗證。利用外源性mtDNA 刺激小鼠后,肺部大量炎癥細胞浸潤,肺泡間隔增厚,肺實質細胞凋亡。此外,mtDNA 暴露會顯著增加肺損傷和水腫的程度[14]。Zhang 等[2]將mtDNA 注入小鼠血管后,引起了肺部及全身其他臟器的炎癥反應,并在BALF 中測得中性粒細胞計數(shù)增加,TNF-α 和IL-6含量升高。這提示mtDNA 作為一種自身免疫刺激物,激活了先天免疫反應,刺激循環(huán)中的中性粒細胞趨化聚集至肺部,引起中性粒細胞介導的非特異性器官損傷。另外,Kuck 等[44]將來源于大鼠肝臟的mtDNA 經(jīng)動脈輸入大鼠體內后,觀察到血管濾過系數(shù)顯著升高,最終導致ALI 的發(fā)生。進一步研究表明,這一現(xiàn)象能被靶向mtDNA 的8-氧橋鳥嘌呤DNA糖基化酶1(8-oxoguanine DNA-glycosylase 1,Ogg1)所減弱。上述研究提示,mtDNA 可以使肺血管通透性增加,通過影響肺血管內皮屏障的完整性,促進ARDS的發(fā)生。但值得注意的是,該實驗中經(jīng)動脈注射的mtDNA 濃度比生理狀態(tài)高很多,這一濃度下所產(chǎn)生的效應在生理狀態(tài)下是否能繼續(xù)發(fā)生,還需進一步的研究。上述體外實驗和動物實驗結果均顯示,mtDNA 可以激活先天免疫,引起炎癥反應,導致器官損傷,這一過程與ARDS的發(fā)生發(fā)展相關。
Wu等[14]的研究顯示,肺組織中細胞外的mtDNA可通過TLR-9、p38 MAPK 和NF-κB 途徑促進NLRP3炎癥小體活化,介導急性炎癥和肺組織損傷。更深入的研究表明,利用脂多糖氣道霧化誘導小鼠發(fā)生ARDS,mtDNA 可以放大這種效應,導致肺部滲出增加,在TLR-9基因敲除小鼠中,炎癥反應的相關效應被削弱[15],提示mtDNA 可以通過TLR-9 發(fā)揮其免疫激活作用,促進炎癥的發(fā)生。目前,尚不明確cGASSTING通路在mtDNA介導ARDS中的機制,這也給后續(xù)的研究提供了一種新的方向,可以利用基因編輯技術,敲除或過表達動物體內cGAS-STING 通路上的相關基因,研究ARDS動物模型中某種病理機制的改變或信號通路下游轉錄因子和炎癥介質的變化。
3.2 慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo?nary disease,COPD)與cGAS-STING 通路的激活COPD 是以不可逆的氣流受限為特征的一種氣道慢性炎性疾?。?5]。長期吸入香煙煙霧和顆粒物等能通過PPRs 激活先天免疫反應,導致肺組織內中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量及黏液分泌增加[45]。暴露于香煙煙霧,在體外實驗中會導致人支氣管上皮細胞死亡,并在細胞外環(huán)境中檢測到雙鏈DNA(double-stranded DNA,dsDNA)和mtDNA 釋放增加,在體內實驗中誘導小鼠支氣管肺泡中dsDNA 和mtDNA 釋放[46]。另外,哮喘-COPD 重疊綜合征患者體內mtDNA/核DNA比率增加,提示該疾病中也存在線粒體功能障礙[47]。但暴露于香煙煙霧這種造模方法具有操作時間長、難度大、動物模型不穩(wěn)定等缺點。近來,研究人員采用滴鼻途徑給予香煙塵霧顆粒建立的小鼠COPD 模型,更為簡便穩(wěn)定[48]。Nascimento 等[49]研究表明,在COPD 模型小鼠的BALF 中自身DNA 含量增加,中性粒細胞募集增多,同時伴隨著cGAS 和STING 的過表達。與野生型小鼠相比,分別敲除STING基因和cGAS基因的小鼠BALF 中dsDNA 含量顯著減少,下游趨化因子CXCL10 產(chǎn)生減少,肺部炎癥也相對較輕,而TLR-9基因敲除小鼠的上述指標與野生型小鼠相似,提示暴露于香煙煙霧后釋放的自身DNA 被cGAS而不是TLR-9識別,進而激活STING通路導致I型IFN 分泌增加,促進肺部炎癥的發(fā)生。長期吸入顆粒物如二氧化硅,是COPD 的另一大病因,也會導致慢性肺部炎癥,研究表明二氧化硅也依賴cGASSTING 途徑發(fā)揮誘導肺部炎癥的作用[50]。因此,香煙煙霧暴露與吸入顆粒物誘導的肺部炎癥均被證實能通過釋放自身DNA,依賴cGAS-STING途徑激活發(fā)揮促炎作用。目前尚缺少cGAS-STING 參與COPD病理生理的直接臨床證據(jù)。
3.3 支氣管哮喘與cGAS-STING 通路的激活支氣管哮喘是一種由多種免疫細胞參與的慢性氣道炎性疾病。研究表明,線粒體功能障礙與哮喘發(fā)生的病理生理機制有關。鼻病毒感染引發(fā)與中性粒細胞胞外網(wǎng)狀陷阱形成相關的dsDNA 釋放,促進過敏性哮喘的進展[51]。卵清蛋白是實驗性過敏性哮喘的常見過敏原,能導致小鼠支氣管上皮細胞線粒體超微結構改變及功能障礙[52]。另外,暴露于豚草花粉提取物也能造成線粒體功能障礙,并加劇了抗原驅動的過敏性氣道炎癥[53]。L-精氨酸的使用能減少支氣管上皮細胞DNA 片段化,恢復了支氣管上皮細胞線粒體的超微結構改變,緩解了小鼠過敏性氣道炎癥中的氣道損傷[52]。臨床研究顯示,哮喘患者外周血中線粒體拷貝數(shù)顯著升高[54],并且細胞外DNA 的水平高低與哮喘的嚴重程度有關[55]。這提示線粒體功能障礙可能導致mtDNA 釋放,通過某些機制促進哮喘的發(fā)生。相關機制研究顯示,在卵清蛋白和塵螨誘導的小鼠哮喘模型中,氣道上皮細胞胞質中dsDNA 的積累增加,并且氣道上皮細胞中cGAS的缺失顯著減少了氣道嗜酸性粒細胞和巨噬細胞的聚集及集落刺激因子的產(chǎn)生,減輕氣道高反應性并緩解了氣道炎癥,但該研究并未確定STING蛋白在其中發(fā)揮的作用[56]。使用cGAS結合dsDNA 后產(chǎn)生的第二信使cGAMP 作為DNA 的替代刺激物,能加劇塵螨誘導的過敏性炎癥,提示cGAMP 可能是過敏性哮喘的內源性加重因素,TBK1抑制劑可改善這一病理過程[57]。以上研究表明,線粒體功能障礙和mtDNA 的累積與哮喘的發(fā)生存在關系,并且可能通過cGAS-STING 途徑發(fā)揮作用,但后續(xù)的損傷機制需要進一步的研究。
4.1 與cGAS 相關的抑制劑cGAS 作為胞內DNA感受器被持續(xù)激活可能導致炎性疾病,作為通路上的啟動因子,抑制其激活可能成為這類疾病的潛在治療方法。抑制cGAS 激活的方式包括干擾DNA 與cGAS結合、干擾底物(ATP和GTP)與cGAS的結合以及通過對cGAS進行翻譯后修飾改變其催化活性。
有許多化合物在藥理學上被證實能干擾DNA與cGAS 的結合??汞懰帲╝ntimalarial drugs,AMDs)如羥氯喹(hydroxychloroquine,HCQ)、喹吖因(quina?crine)等通過將其插入DNA-cGAS 界面上DNA 凹槽中,呈劑量依賴性地阻礙DNA與cGAS的相互結合并能替換已結合的DNA,從而抑制Ⅰ型IFN在THP-1細胞的表達[58]。在AMDs的結構基礎上,An等[59]合成了幾種含6-氨基-2-甲氧基-9-氨基吖啶的新化合物,其中X6 具有最佳的水溶性和細胞滲透性,通過與兩個相鄰cGAS 單體上的DNA 結合位點相互作用,妨礙cGAS 與DNA 的結合。隨后以X6 和HCQ 分別干預Trex1(three prime repair exonuclease 1)?/?小鼠,結果顯示,與HCQ 相比,X6 治療的小鼠心肌中cGAMP 產(chǎn)生減少,ISGs表達顯著下降。在治療cGAS 介導的自身免疫性心肌炎方面,X6比HCQ 有著更出色的表現(xiàn)和更低的毒副作用;X6 還能降低來自系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的外周血單個核細胞中ISGs 的表達[59]。此外,通過液相色譜分析評估化合物對人cGAS 的抑制作用篩選出了蘇拉明(一種曾用于治療非洲錐蟲病和盤絲尾蟲病的帶負電的多磺酸萘醌鹽類化合物),可以作為DNA 模擬物,占據(jù)DNA 結合位點但不能激活cGAS,從而抑制2',3'-cGAMP 的合成,降低了THP-1細胞中IFN-β的水平[60]。最近,Padilla-Salinas等[61]篩選出在體外靶向人cGAS的高親和力抑制劑CU-32和CU-76,分子對接分析表明,它們能插入DNA 結合表面Zn環(huán)附近的凹槽中,通過構象變化抑制h-cGAS的二聚化,在人THP-1細胞中具有抑制活性。
針對cGAS 活性位點的小分子抑制劑能干擾底物(ATP 和GTP)與cGAS 的結合,從而抑制2',3'-cGAMP 的產(chǎn)生。在超過1 000 種化合物的文庫中進行基于質譜的高通量篩選確定,對小鼠cGAS 有抑制作用的化合物RU.365及其苯并噻唑類似物RU.332通過占據(jù)cGAS的催化位點,降低cGAS對ATP和GTP的親和力,從而抑制2',3'-cGAMP產(chǎn)生[62]。氯代化合物RU.521由于與Arg364和Tyr421的堆積作用疊加,在小鼠原代巨噬細胞中表現(xiàn)出了更好的抑制能力,降低了小鼠巨噬細胞中IFN-β1 的表達[62]。人和小鼠cGAS 在結構上存在差異,RU.521 抑制h-cGAS 的能力存在爭議,但一項最新的研究顯示RU.521中在細胞水平對人源和鼠源cGAS 有相似的抑制能力[63-64]。利用基于化學發(fā)光分析ATP 濃度變化的高通量篩選確定了小分子化合物G150 是人cGAS 的特異性抑制劑,在人源的原代巨噬細胞中具有抑制活性[65]。有研究通過新型熒光偏振測定法確定了PF-06928215 作為人cGAS 的高親和力抑制劑,但在細胞實驗中該化合物沒有抑制活性,其原因可能是該化合物的細胞滲透性差[66]。高分辨率X線晶體結構顯示PF-06928215可與人cGAS 的活性位點結合。在此基礎上,Zhao等[67]通過高分辨率X線晶體結構模擬研究了cGAS與PF-06928215 相互作用的結合模型和關鍵氨基酸殘基,隨后利用熱漂移檢測技術篩選確定了與cGAS 活性位點結合的抑制劑——化合物S2/S3,但目前缺乏該化合物的體外和細胞實驗數(shù)據(jù)。
翻譯后修飾在調節(jié)蛋白質功能方面十分重要。蛋白質乙?;诎庖叻磻趦鹊母鞣N生物學過程中都起著重要作用。使cGAS 的關鍵位點Lys384、Lys394 或Lys494 乙酰化可抑制其活性;阿司匹林作為乙?;w可增加cGAS 的乙酰化并抑制cGAS 的活性,從而抑制Trex1?/?小鼠和Aicardi-Goutières 綜合征患者細胞中DNA介導的自身免疫反應[68]。
4.2 與STING蛋白相關的抑制劑STING蛋白作為cGAS-STING 通路上承上啟下的重要分子,其異常激活與多種自身免疫性疾病及炎性疾病密切相關,研究人員針對這一蛋白展開了廣泛的藥物研究。棕櫚?;种苿?-溴棕櫚酰酸酯或STING蛋白N端Cys88和Cys91位點的突變能有效抑制STING蛋白在高爾基體中的棕櫚酰化;這種翻譯后修飾在STING蛋白激活下游通路產(chǎn)生I型IFN反應中至關重要[69]。基于這一發(fā)現(xiàn),研究人員開發(fā)了靶向STING 蛋白Cys88 和Cys91位點以抑制蛋白棕櫚?;幕衔?。Haag等[70]進行了基于小鼠細胞的化學篩選發(fā)現(xiàn)兩種硝基呋喃衍生物C-178和C-176,能與STING蛋白Cys91之間形成共價鍵,抑制STING 蛋白的棕櫚酰化,進而阻止STING蛋白組裝成多聚體復合物,阻斷下游信號傳導,抑制I型INF的產(chǎn)生;用C-176干預Trex1?/?小鼠,各種系統(tǒng)性炎癥明顯減輕且沒有中毒跡象。進一步篩選確定了在人源細胞和動物體內均具有良好抑制能力的化合物H-151。此外,內源性硝基脂肪酸能與STING 蛋白Cys88 和Cys91 位點共價結合以抑制該途徑的激活,并減少鼠源和人源細胞中I型IFN的釋放[71]。
另外,作用于STING 蛋白其他位點的化合物也被發(fā)現(xiàn)有抑制作用。從紫杉醇中分離出的環(huán)肽astin C 通過與2',3'-cGAMP 競爭性結合STING 蛋白C 端的激活口袋而阻止IRF3 的募集,抑制cGAS-STING信號通路觸發(fā)的先天免疫反應[72]。將astin C 應用于Trex1?/?小鼠,其體內的I 型IFN 水平顯著下降。此外,根據(jù)STING 蛋白的對稱性開發(fā)了一種小分子的STING 蛋白拮抗劑Compound 18,它能占據(jù)cGAMP結合位點,在體外抑制STING通路的激活[73]。
cGAS-STING信號通路抑制劑的總結見表1。
表1 cGAS-STING信號通路抑制劑Table 1.Inhibitors of cGAS-STING signaling pathway
Table 1.(continued)
值得注意的是,抑制cGAS-STING 通路后會導致機體免疫功能低下,對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視減弱導致發(fā)生腫瘤的風險增加以及抗病毒、抗細菌反應減弱導致機體可能發(fā)生嚴重感染,這些風險可能會成為這類藥物臨床應用的潛在障礙,也是在開發(fā)藥物過程中應當注意的問題。
mtDNA釋放導致cGAS-STING信號通路的激活,與多種肺部炎性疾病的發(fā)生有關。在ARDS、COPD和哮喘的患者體內均觀察到了血漿mtDNA 水平的升高。血漿mtDNA 水平可以幫助臨床醫(yī)生預測和識別可能發(fā)展為ARDS 的潛在患者,對其進行更積極的早期醫(yī)療干預,但其預測能力以及與疾病嚴重程度的關系尚不明確。此外,在測定mtDNA 含量時,采用不同的標本如血清、血漿及BALF時,與預后的關聯(lián)程度是否存在區(qū)別,這需要更深入的研究。在肺部炎性疾病的動物模型中驗證了敲除cGASSTING 信號通路上的相關基因可以減輕氣道炎癥反應,提示肺部炎性疾病的發(fā)病機制與cGAS-STING 信號通路的激活相關,但目前研究未闡明mtDNA 是通過獨立結合cGAS 還是TLR-9,亦或是結合這2 種受體共同發(fā)揮免疫刺激作用。另外,靶向抑制cGASSTING 信號通路的藥物正處于臨床前研究階段,目前已有許多小分子抑制劑在體外和細胞研究中展現(xiàn)出生物學活性,并在自身免疫性疾病的動物模型中展現(xiàn)出良好的療效,但對于肺部炎性疾病的作用需要進一步的基礎研究來驗證,還需要更多的動物實驗來驗證其安全性。