王 華， 唐浚杰▲， 徐李玲， 陳芳圓， 王穎薇， 周 清△， 陳 劍△

（暨南大學1第一臨床醫(yī)學院，2生命科學技術學院，3基礎醫(yī)學院，廣東 廣州 510630）

眼表化學傷是一種常見的眼部急癥，可導致嚴重視力損害，占眼部急癥的0.1%～15%，估計發(fā)病率為每年每10 萬人0.051～50 例［1］。眼表化學傷的治療主要是眼表重建，包括角膜、結膜、淚膜和眼瞼的重建。結膜上皮由層狀鱗狀上皮和分泌黏蛋白的杯狀細胞組成，可調節(jié)眼表微環(huán)境，維持淚膜穩(wěn)定，保持角膜表面光滑。因此，成功的結膜重建是恢復眼表結構完整和功能穩(wěn)定的重要前提。然而，眼表化學傷患者通常缺乏足夠的健康結膜組織進行結膜重建，而異種結膜組織又存在免疫排斥反應［2］。

為了解決免疫排斥和移植材料短缺的問題，為結膜重建提供理想的替代品，已有研究開發(fā)了組織工程結膜細胞片。目前結膜細胞片的構建主要是通過直接在支架表面種植細胞獲得結膜移植物［3］。直接種植存在以下缺點［4-5］：（1）上皮難以快速分層；（2）細胞容易從支架上脫落；（3）杯狀細胞分化差。直接種植只構造了一個單層細胞面，雖然細胞可以逐步分化形成多層細胞面，但隨著培養(yǎng)時間的延長，底層細胞的逐漸出現(xiàn)衰老和凋亡，細胞和支架之間的黏附力也開始降低。

RADA-16是一種廣泛應用的自組裝納米多肽水凝膠，在生理條件下可以自組裝成孔隙尺寸為50～200 nm、含水量大于99% 的網絡結構［6］，可以模擬細胞外基質的三維結構，提供一個利于細胞生長的三維環(huán)境，促進細胞的增殖和遷移［7］，已被成功應用于軟骨細胞、間充質干細胞、內皮細胞等不同類型的細胞培養(yǎng)［8-10］。該材料還用于組織工程，促進骨組織和神經組織的再生，顯示其具有支持細胞附著、增殖和分化的能力［11-12］。

基于此，我們設想將RAD16-I 與兔結膜上皮細胞（rabbit conjunctival epithelial cells，rCECs）混合后種于脫細胞的細胞外基質（decellularized extracellu?lar matrix，dcECM）上，希望其也能發(fā)揮相關的調控作用，進一步促進結膜上皮細胞的增殖，從而快速形成復層細胞片。本研究以此為切入點，評價RAD16-I對結膜上皮細胞復層過程的影響，探討其作用機制及應用潛能。

材料和方法

1 動物

新西蘭大白兔，雌雄不限，2.5～3.0 kg，普通清潔級別，用于結膜上皮細胞及結膜組織取材，來源于暨南大學醫(yī)學院動物房及廣州花都區(qū)花東信華實驗動物養(yǎng)殖場［許可證號為SCXK（粵）2019-0023］。

2 主要試劑

高糖DMEM 培養(yǎng)液、PuraMatrix?（RAD16-I）及胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Corning；分散酶（dispase）Ⅱ、0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA、細胞角蛋白（cytokeratin，CK）4、CK13、黏蛋白5AC（mu?cin 5AC，MUC5AC）、磷脂酶A2 及脫氧膽酸鈉購自Sigma；pan-cadherin 抗體、laminin 抗體、Alexa Fluor 488 及Alexa Fluor 594 購自Abcam；collagen I 和colla?gen IV 抗體購自Affinity；核酸染料DAPI 購自Invitro?gen；磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）及碳酸鹽緩沖液（carbonate-buffered saline，CBS）購自Biosharp；阿爾辛藍（Alcian blue，AB）-過碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色試劑盒及Calcein-AM/PI 活/死細胞雙染試劑盒購自北京索萊寶公司；櫻花OCT包埋劑購自上海鑫樂公司。

3 主要方法

3.1 細胞培養(yǎng)采用酶消化法［13］，新西蘭大白兔耳緣靜脈注入空氣處死，立即取結膜組織，充分分離干凈多余的脂肪和肌肉組織。用含有1% 青霉素/鏈霉素 的PBS 沖 洗3 次，后 用2.0×103U/L disase Ⅱ在37 ℃、5% CO2中浸泡2 h；再用0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA 消化5 min，加入完全培養(yǎng)液終止消化，離心收集細胞，以1×108/L 接種培養(yǎng)，待細胞生長增殖到80% 匯合時及時傳代。每天倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化及其生長增殖情況。

3.2 rCECs 的鑒定當傳代細胞達到80% 匯合時，用75%乙醇固定，用AB-PAS染色試劑盒檢測結膜杯狀細胞。AB 染色20 min 后氧化劑氧化5 min，Schiff試劑染20 min，蘇木素染色1 min 后酸性分化液分化2 s，最后用Scott 藍化液返藍。細胞表型通過免疫熒光染色確定，用PBS 沖洗細胞數(shù)次，然后在室溫下用1% Triton X-100 孵化30 min，10% 山羊血清孵化1 h，然后用Ⅰ抗在4 ℃孵育過夜，對照組加PBS。隨后，室溫下Ⅱ抗避光孵育2 h。

3.3 dcECM 的制備新鮮兔結膜組織用CBS 浸泡12 h，然后放入含有2×106U/L磷脂酶A2和5 g/L脫氧膽酸鈉的CBS 中室溫下水浴震蕩6 h，CBS 洗滌3 次后放入含2×106U/L 磷脂酶A2 的CBS 中室溫下水浴震蕩12 h。最后將結膜組織用生理鹽水清洗50 h（每2 h更換一次生理鹽水）。所得樣品干燥至恒重，角膜環(huán)鉆裁剪成直徑12 mm 的圓形，鈷60（25 kGy）滅菌后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4 dcECM 脫細胞效率檢測采用HE染色和免疫熒光染色觀察dcECM 脫細胞前后的變化。簡而言之，dcECM 和天然結膜（natural conjunctiva，NC）的樣品被冷凍在OCT 化合物中，制備成5 μm 切片，行HE染色和collagen I免疫熒光染色以觀察異種細胞去除效果及天然細胞外基質存留情況。DNA 提取試劑盒提取DNA 后使用超微量紫外分光光度計測定所提取DNA 樣品的濃度，根據溶液體積計算得到各樣品DNA含量，以評估脫細胞效率。

3.5 dcECM 的復水能力及體外降解能力為比較NC 和dcECM 的復水能力，將恒重干燥的NC 和dcECM（n=5）樣品的質量記為m0。樣品在PBS 中浸泡24 h 后，再次稱量質量，記為m1。樣品的含水率（%）=（m1?m0）/m1×100%。

為比較NC和dcECM的降解能力，將恒重干燥的NC 和dcECM（n=3）切成1 cm×1 cm 的樣品，測量其確切質量，記為m0，37 ℃下將其置于PBS 中，濃度為1.5 g/L。分別于第1、4、7、14、21、30、45、60 和90 天將樣品取出，用蒸餾水清洗后干燥，測量其質量，記為m1。樣品的體外降解率（%）=（m0?m1）/m0×100%。

3.6 細胞片的構建首先將滅菌后的dcECM 固定在環(huán)架上，室溫下用培養(yǎng)基復水30 min。隨后，酶消化法收集足量細胞（每個細胞片用5×105rCECs）用于組織工程結膜（tissue engineering conjunctiva，TEC）上皮細胞片的構建。rCECs 經10% 蔗糖溶液洗滌后離心，用80 μL 蔗糖溶液和20 μL RAD16-I 多肽水凝膠重懸，隨后，將細胞混懸液加入到復水后的dcECM表面。對照組不使用RAD16-I，即消化收集5×105rCECs，使用100 μL 完全培養(yǎng)液重懸后直接種植到復水后的dcECM 的表面。構建完成后加入2 mL 培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。

3.7 細胞活/死染色檢測細胞活性每天用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。培養(yǎng)5 d后，從細胞培養(yǎng)箱中取出樣品進行評估。用Calcein-AM/PI 活/死細胞染色試劑盒來檢測細胞存活率。簡而言之，在熒光顯微鏡下觀察（隨機選擇5 個視野，20 倍放大）活細胞（綠染）和死細胞（紅染），使用ImageJ 軟件計數(shù)。活細胞比例用活細胞數(shù)除以總細胞數(shù)來計算。

3.8 組織學及免疫熒光分析為比較細胞片的結構、細胞表型和基質成分，將細胞片包埋于OCT后制成20 μm 切片。行HE 染色觀察組織結構；ImageJ 軟件測量上皮層平均厚度；行CK4、CK13 及MUC5AC免疫熒光檢測觀察細胞表型及基質成分；行collagen IV、pan-cadherin 及l(fā)aminin 免疫熒光染色檢測細胞間及細胞與基質間的連接情況。

4 統(tǒng)計學處理

所有統(tǒng)計分析均使用GraphPad Prism 6.0 軟件進行。數(shù)據均用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。采用獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 rCECs的體外培養(yǎng)與鑒定

大多數(shù)rCECs 在接種24 h 內貼壁生長。隨著培養(yǎng)時間的延長，rCECs 呈半透明圓形（圖1A）。ABPAS 染色顯示結膜上皮原代培養(yǎng)中存在杯狀細胞（圖1B）。免疫熒光染色顯示，培養(yǎng)細胞中結膜上皮細胞標志物CK4 和杯狀細胞特異性黏蛋白MUC5AC陽性表達（圖1C、D），與結膜上皮細胞表型一致。

2 脫細胞基質的外觀

NC 呈乳白色薄膜，脫細胞后，dcECM 呈半透明的白色薄膜，透明度較NC增加（圖2A）。

3 脫細胞基質的結構

HE 和免疫熒光染色（圖2B、C）證實異種細胞成分基本完全去除，天然膠原纖維結構得到完整保留。NC 的DNA 含量為（1 846.85±66.15）μg/g，脫細胞后DNA 含量顯著下降至（46.47±2.48）μg/g，表明細胞成分有效去除（圖2D）。

4 脫細胞基質的性質

dcECM 的水分含量與NC 相比無顯著差異（82.20%vs80.20%，P>0.05），見圖2E。兩者的體外降解率亦無顯著差異（P>0.05），見圖2F。這些結果表明，磷脂酶A2 可以有效地去除異種抗原成分，同時完整保留天然細胞外基質的膠原結構，達到脫細胞的效果；此外，理化性質并不會因脫細胞過程而改變。

5 RAD16-I構建細胞片的流程及結果

rCECs 與RAD16-I 混合后種植在dcECM 表面構建三維細胞片（圖3），不添加RAD16-I直接將細胞混懸液種植在支架上作為對照組。

6 RAD16-I對細胞活力的影響

2 種方式構建的細胞片在培養(yǎng)第3 天均混合在一起，呈鵝卵石狀（圖4A）。細胞活/死染色（圖4B）顯示，和二維對照組相比，僅有散在死細胞（紅點）隱藏在三維細胞片內，獨立樣本t檢驗顯示，三維細胞片活細胞比例（97.90%）與二維細胞片（89.31%）相比有顯著差異（P<0.01），見圖4D。

Figure 1. In vitro expansion of rabbit conjunctival epithelial cells.A：light microscopic images of rabbit conjunctival epithelial cells；B：Alcian blue-periodic acid-Schiff staining to identify goblet cells；C and D：immunofluorescence staining of cultured rab?bit conjunctival epithelial cells using antibodies against CK4 and MUC5AC.圖1 兔結膜上皮細胞的體外擴增

7 RAD16-I對細胞復層能力的影響

HE 染色（圖4C）顯示，三維細胞片中的rCECs 與基質緊密連接，形成4～5 層上皮，而對照組僅形成1～2層上皮。經統(tǒng)計學分析，上皮平均厚度差異有統(tǒng)計學意義［（20.19±1.05）μmvs（6.12±0.45）μm，P<0.05］，見圖4E。

8 RAD16-I對細胞增殖能力的影響

CK4、CK13 和MUC5AC 免疫熒光染色鑒定細胞片的細胞表型。三維細胞片中檢測到結膜上皮細胞標志物CK4 和CK13 及杯狀細胞特異性黏蛋白MUC5AC，而對照組中未檢測到，見圖5。

9 RAD16-I對胞間連接能力的影響

免疫熒光染色檢測鑒定細胞片的細胞外成分及胞間連接，結果顯示，pan-cadherin、laminin 和colla?gen IV 在2 組均呈陽性表達，但添加RAD16-I 的細胞片的胞間連接明顯強于對照組，見圖6。

討 論

在臨床上，自體結膜或結膜替代品常用于結膜重建。雖然自體結膜是結膜重建的最佳選擇，但它僅限于有足夠健康結膜組織的患者。羊膜（amotic membrane，AM）是一種常用的結膜移植替代品，可有效減少結膜表面炎癥，防止結膜瘢痕形成。然而，AM 在眼表重建方面仍具有一定的限制性。傳統(tǒng)的AM 移植治療存在疾病傳播和異源反應等風險，AM移植物在炎癥環(huán)境中可能快速降解，這極大地限制了其在嚴重炎癥環(huán)境中的應用，如眼表化學燒傷［14-15］。在此基礎上，結膜細胞片因其低免疫原性和良好的生物相容性而發(fā)展成為理想的結膜替代品。

dcECM 是通過物理和化學過程來去除細胞結構、核酸和抗原成分的［16］。dcECM 具有以下優(yōu)勢［17］：組織特異性的生物力學強度和生物相容性，能有效促進細胞遷移、增殖和分化；該材料來源廣泛，生物性能穩(wěn)定；制備方法簡單易操作。結膜基質主要由3種大分子蛋白組成：層粘連蛋白、糖蛋白和膠原蛋白［18］。我們用磷脂酶A2 對兔結膜進行脫細胞處理，結果證實脫細胞處理后的結膜上皮層被完全去除，基質中的膠原纖維結構得到保留。雖然目前對脫細胞支架和種子細胞的研究有所改進，但如何將這兩種重要元素結合起來仍然是一個挑戰(zhàn)。

RAD16-I 是由麻省理工學院的張曙光教授等人發(fā)現(xiàn)的一種知名的自組裝多肽水凝膠，它在水介質中形成β-結構并自組裝成納米纖維［19］。 由于RAD16-I 具有良好的生物相容性，可促進細胞增殖和組織再生，因此其商業(yè)名稱為PuraMatrix［20-21］。近年來，RAD16-I 越來越多地被用作組織再生的人工支架。有報道稱，自組裝多肽水凝膠的濃度會影響細胞形狀，常用的濃度范圍為0.2%～0.5%［22］。在本研究中，我們將RAD16-I 的濃度稀釋至0.2%，因為rCECs在該濃度下表現(xiàn)出更好的分層能力。

Figure 2.Preparation of decellularized conjunctiva.A：photographs of decellularized extracellular matrix（dcECM）and natural con?junctiva（NC）after dehydration；B：histological analysis of dcECM and NC；C：immunofluorescence staining of dcECM and NC using antibodies against collagen I（COLI）；D：DNA content of dcECM and NC；E：moisture content of dcECM and NC after rehydration；F：in vitro degradation capacity of dcECM and NC.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs NC group.圖2 脫細胞結膜的制備

Figure 3.Overall approach for the construction of multilayer cell sheet.圖3 構建復層細胞片的流程及結果

Figure 5.Cell phenotype in tissue engineering conjunctiva（TEC）.Immunofluorescence staining for CK13（A），CK4（B）and MUC5AC（C）expression in the cells on 3D TEC and control TEC.圖5 組織工程結膜細胞片的細胞表型

Figure 6.Extracellular components in tissue engineering con?junctiva （TEC）.Immunofluorescence staining for cadherin（A），laminin（B）and collagen IV（C）ex?pression in the extracellular matrix of 3D TEC and control TEC.圖6 組織工程結膜細胞片的細胞外成分

前期研究發(fā)現(xiàn)，氣/液界面培養(yǎng)提供了一個更接近體內的培養(yǎng)環(huán)境，可以促進細胞增殖、分化及快速復層［23］。一些研究已經實現(xiàn)了在生物支架上的結膜上皮細胞復層。例如，Zorn-Kruppa 等［24］在氣/液界面下培養(yǎng)6 d 后實現(xiàn)了3 層以上的結膜上皮細胞復層；Gipson 等［25］將結膜上皮細胞在涂有I 型膠原的Tran?swell上培養(yǎng)后實現(xiàn)了2～3層的復層；Bosworth等［26］在dcECM-PCL靜電紡絲支架上實現(xiàn)了結膜上皮細胞的復層。在本研究中，我們通過RAD16-I 水凝膠將rCECs 和dcECM 有效結合，恢復結膜的固有結構和功能。培養(yǎng)5 d后用HE染色直接觀察移植物的整體結構。組織學分析表明，0.2% RAD16-I 構建的細胞片形成了4～5層的細胞復層，而不含RAD16-I的細胞片僅形成1～2 層細胞復層。與通常需要7 d 以上形成復層的傳統(tǒng)方法相比，RAD16-I 具有快速形成復層的能力。

細胞分化與周圍微環(huán)境［27］密切相關。與傳統(tǒng)高分子材料的微尺寸相比，RAD16-I 的納米尺寸更接近于細胞外基質，為細胞提供了一個真實的三維微環(huán)境［28］。結膜杯狀細胞主要負責分泌黏蛋白形成淚膜。黏液蛋白改變或杯狀細胞功能障礙可導致眼表微環(huán)境紊亂。因此，杯狀細胞的恢復是結膜重建中的一個重要問題。本研究結果表明，對照組在體外培養(yǎng)5 d 后，CK4、CK13 和MUC5AC 均陰性表達，考慮可能是因為結膜上皮細胞在培養(yǎng)過程中因缺乏足夠的營養(yǎng)和生長環(huán)境發(fā)生了衰老和變異，從而引起角蛋白發(fā)生變異，該現(xiàn)象此前亦有相關報道［29］。三維培養(yǎng)組結膜杯狀細胞在RAD16-I 所創(chuàng)造的微環(huán)境中成功分化生長，并在細胞片中檢測到杯狀細胞特異性標志物MUC5AC。在正常結膜上皮中，杯狀細胞通常聚集在一起，幾乎插入到整個層狀上皮中，與相鄰層狀上皮細胞形成緊密的連接。結合本研究結果，推測三維微環(huán)境和復層結膜上皮可能為杯狀細胞的生長提供支持。

細胞-細胞和細胞-基質相互作用決定細胞片的整體結構穩(wěn)定性。種子細胞與支架之間缺乏足夠的生物力學特性，在移植過程中容易出現(xiàn)上皮層脫落，這將極大地影響細胞片的實際臨床應用。層粘連蛋白和IV 型膠原是結膜基質的主要成分，在增強細胞與基質的相互作用中起著重要作用［30］。IV型膠原的主要作用是在結膜基底膜中形成特殊的網狀結構，為上皮細胞的黏附提供支架，而層粘連蛋白是大分子糖蛋白，主要作用可促進細胞與細胞、細胞與基質之間的黏附，促進細胞分裂、鋪展和細胞運動，提高細胞運動能力和趨化性，幫助細胞形成接觸和伸展［31］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白和IV 型膠原在RAD16-I 構建的細胞片中均陽性表達，且明顯強于對照組。結合cadherin 的陽性表達，初步證實RAD16-I 自組裝多肽水凝膠可以促進培養(yǎng)微環(huán)境中細胞-細胞和細胞-基質間的相互作用。

我們的結果表明，RAD16-I 自組裝多肽水凝膠具有模擬細胞外基質微環(huán)境的能力，促進細胞的活力、增殖及胞間連接，從而可以有效地在dcECM表面快速形成復層上皮。盡管我們使用的材料均具有良好的生物相容性，但其安全性仍需進一步深入系統(tǒng)地探討，同時RAD16-I 促進結膜上皮細胞復層的具體分子機制也是我們下一階段的研究重點。