周駿潔， 張 超， 楊鑫鑫， 方 旭， 朱昭瓊

（遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院麻醉科，貴州 遵義 563300）

術后認知功能障礙（postoperative cognitive dys?function，POCD）是一種常見的以老年患者圍手術期腦損傷為特征的臨床綜合征，常表現(xiàn)為學習能力和記憶力減退［1］。許多研究表明，神經(jīng)炎癥是POCD 發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)［2-3］，然而神經(jīng)炎癥參與POCD 發(fā)生發(fā)展的機制尚未闡明。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization do?main-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體是由NLRP3、含caspase 募集結構域的凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）及caspase-1 前體（pro-caspase-1）組成。NLRP3 炎癥小體在機體受到異常刺激時會觸發(fā)caspase-1 的裂解和激活，剪切和分泌白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18，即NLRP3 炎癥小體是控制IL-1β 及IL-18 成熟的關鍵上游靶標［4］。研究顯示NLRP3 炎癥小體介導的炎癥反應參與異氟烷誘導老年小鼠認知功能障礙，值得注意的是，年幼動物在相同干預條件下幾乎不會發(fā)生神經(jīng)炎癥或認知功能障礙［5］。

MCC950 是新近發(fā)現(xiàn)的NLRP3 炎癥小體抑制劑。最近一項研究比較各種炎癥抑制劑的藥代動力學報告，肯定了MCC950 的高穩(wěn)定性［6］，且MCC950在體內(nèi)外實驗中均顯示出良好的抗炎作用及顯著的腦保護作用［7-8］。D-半乳糖作為經(jīng)典的快速致衰老模型大鼠用藥，可模擬自然衰老大鼠如免疫系統(tǒng)［9］、循環(huán)系統(tǒng)［10］及神經(jīng)系統(tǒng)［11］的全面衰老特征。因此，本實驗觀察七氟烷（sevoflurane，Sev）對衰老模型大鼠認知能力及前額葉皮質炎癥因子表達的影響，并探討其機制，以期為臨床治療POCD提供參考資料。

材料和方法

1 動物

SPF 級4 月齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠48只，體重約320～350 g，均由長沙天勤生物技術有限公司提供［許可證號：SCXK（湘）20114-0011］。所有大鼠均自由進食水，晝夜交替12 h/12 h，環(huán)境濕度維持40%～50%。本實驗經(jīng)過遵義醫(yī)科大學動物實驗中心倫理委員會批準［倫審（2019）2-044］。

2 主要試劑

D-半乳糖（Solarbio，D8310）；Sev（魯南貝特制藥有限公司，批號：65190902）；MCC950（MedChemEx?press，HY-12815A）；水合氯醛（Solarbio，T8590）；BCA 法蛋白濃度測定試劑盒（Solarbio，PC0020）；兔抗離子鈣結合接頭分子1（ionized calcium-binding adaptor molecule-1，Iba-1）抗體（Abcam，ab178846）；兔抗NLRP3、兔抗csapase-1 和兔抗ASC 抗體均購自Novus；IL-1β 和IL-18 抗體均購自武漢三鷹生物科技有限公司；IL-1β 和IL-18 ELISA 試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（Abcam，ab205718）；內(nèi)參照GAPDH 抗體（Proteintech）；蛋白Marker（Thermo，26616）；0.22 μm PVDF 膜（Merck，ISEQ00010）；Western HRP 發(fā)光底物（Merck，WBKLS0100）。

3 實驗方法

3.1 大鼠衰老模型建立參照文獻［12］，將半乳糖（125 mg·kg?1·d?1）于大鼠頭頸部皮下持續(xù)注射42 d建立衰老模型大鼠。

3.2 實驗動物分組大鼠按SPSS 隨機數(shù)字法分為4 組：空白對照（control，Con）組、MCC950 組、Sev 組和MCC950 治療（Sev+MCC950）組，每組12 只。其中MCC950 組及Sev+MCC950 組分別吸入運載氣體（V氧氣∶V空氣=3∶1）和3.2% Sev+運載氣體6 h，之后30 min、24 h 和48 h 腹腔注射MCC950（10 mg·kg?1·d?1）；Con 組及Sev 組大鼠分別吸入運載氣體和Sev 6 h，之后30 min、24 h和48 h注射等體積生理鹽水。

3.3 Morris 水迷宮實驗測試在直徑120 cm、深60 cm 的圓形水池中進行。逃逸平臺是一個直徑15 cm，高30 cm 的圓柱形結構，并浸沒在水面以下1 cm處。（1）定位航行實驗：持續(xù)5 d，將大鼠尾部朝盆壁前輕輕放入池中三個象限之一，每個位置都位于除平臺外不同象限的盆壁中心。大鼠游至平臺時間即為逃避潛伏期，最大游泳時間設置為120 s，如果大鼠游泳120 s 后仍未找到平臺，大鼠將被輕輕引導到平臺上，并允許停留20 s；（2）工作記憶實驗：通過移除逃逸平臺對各組大鼠進行工作記憶測試，記錄游泳總距離、游泳速度及逃逸平臺所用時間。

3.4 HE染色行為學結束后，取6只大鼠麻醉后冰上斷頭取全腦和肺，立即固定于4%溶液中24 h，后送于遵義醫(yī)科大學病理科進行脫水，石蠟包埋，切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色5 min，鹽酸乙醇分化數(shù)秒后，自來水沖洗10 min 返藍，伊紅染色1 min，自來水沖洗后梯度乙醇水合，二甲苯透明，封片，觀察。

3.5 Western blot取余下6 只大鼠，麻醉后冰上斷頭取出大鼠前額葉皮質，分為左側和右側，取左側前額葉皮質在RIPA 裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑混合物中勻漿，低溫高速（4 ℃、15 000×g）離心20 min 后取上清液體進行BCA 定量，制備上樣蛋白，電泳，轉膜，脫脂牛奶封閉，然后，將膜與相應Ⅰ抗在4 ℃下?lián)u床孵育過夜（本研究中使用的Ⅰ抗除內(nèi)參照抗體稀釋比為1∶2 000，其余稀釋比均是1∶1 000）。次日TBST緩沖液洗滌3次后，ECL發(fā)光液進行曝光。

3.6 ELISA 檢測前額葉皮質區(qū)及血清炎癥因子表達水平將大鼠麻醉后固定于手術臺，腹主動脈進行取血，離心，取血清，冰上斷頭取出大鼠前額葉皮質右側，并加入預冷PBS 制備組織超聲勻漿，4 ℃、15 000×g離心15 min后，取上清液。嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟進行IL-1β和IL-18水平的測定。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行分析處理。計量資料均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。水迷宮重復測量采用球形檢驗后單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 Morris水迷宮實驗結果

如圖1A 所示，在定位航行測試中，隨著訓練天數(shù)的增加，各組大鼠逃避潛伏期呈逐漸縮短且穩(wěn)定的趨勢（P>0.05）。如圖1B 所示，在工作記憶測試中，與Con 組比較，Sev 組大鼠逃避潛伏期顯著延長（P<0.05）；與Sev 組對比，Sev+MCC950 組大鼠逃避潛伏期顯著縮短（P<0.05）。如圖1C、D所示，各組大鼠游泳路程和游泳速度的差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

Figure 1.Effects of sevoflurane（Sev）on learning and memory of the rats in each group.A：escape latency in navigation test；B：es?cape latency in working memory test；C：total distance；D：swimming speed.Mean±SD. n=12.*P<0.05 vs control（Con）group；#P<0.05 vs Sev group.圖1 七氟烷對老年模型大鼠學習記憶的影響

2 大鼠肺組織和大腦前額葉皮質形態(tài)學觀察

如圖2 所示，大鼠肺臟病理切片HE 染色結果提示各組大鼠肺泡結構完整光滑，除Con 組外，其余各組有少量出血和淋巴細胞浸潤。

如圖3所示，與Con組比較，MCC950組大鼠大腦前額葉皮質區(qū)神經(jīng)元細胞呈圓形或錐形，細胞核位于胞核中央，無顯著神經(jīng)元損傷及炎癥細胞浸潤；Sev 組大鼠大腦前額葉皮質部分神經(jīng)元細胞體積縮小，神經(jīng)元細胞胞核固縮深染，神經(jīng)元細胞受損；與Sev 組對比，Sev+MCC950 組大鼠大腦前額葉皮質神經(jīng)元細胞排列緊密，大部分神經(jīng)元細胞形狀呈圓形或錐形，神經(jīng)元細胞損傷程度減輕。

Figure 2.HE staining of lungs in each group（scale bar=50 μm）.A：Con group，B：MCC950 group，C：Sev group；D：Sev+MCC950 group.圖2 七氟烷干預后各組大鼠肺部HE染色觀察結果

Figure 3.HE staining of prefrontal cortex of rats in each group（scale bar =50 μm）.A：Con group；B：MCC950 group；C：Sev group；D：Sev+MCC950 group.圖3 七氟烷干預后各組大鼠大腦前額葉皮質HE染色觀察結果

3 Western blot蛋白表達結果分析

如圖4所示，與Con組比較，Sev組大鼠大腦前額葉皮質區(qū)Iba-1、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白表達顯著上調（P<0.05），各組ASC 蛋白表達無顯著差異（P<0.05）；與Sev 組相比，Sev+MCC950組Iba-1、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白表達顯著下降（P<0.05）。

Figure 4.Western blot analysis of Iba-1，NLRP3，ASC，caspase-1，IL-1β and IL-18 in the prefrontal cortex of rats.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs Con group；#P<0.05 vs Sev group.圖4 大鼠前額葉皮質中Iba-1、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達

4 大鼠前額葉皮質及血清中IL-1β 和IL-18 的檢測結果

ELISA 結果顯示，與Con組比較，Sev組大鼠前額葉皮質及血清炎癥因子IL-1β 和IL-18的表達水平顯著高于Con 組（P<0.05），而與Sev 組 相比，Sev+MCC950組大鼠前額葉皮質及血清炎癥因子IL-1β和IL-18的表達水平顯著減少（P<0.05），見表1、2。

表1 各組大鼠血清炎癥因子表達水平Table 1.The serum levels of inflammatory factors in the rats of each group（μg/L.Mean±SD. n=12）

表2 各組大鼠大腦前額葉皮質炎癥因子表達水平Table 2.The prefrontal cortex levels of inflammatory factors in the rats of each group（μg/L.Mean±SD. n=6）

討 論

為更好探討Sev 對老年大鼠認知能力的影響及機制，建立一個合適的研究模型極為重要。本研究中，我們觀察到各組大鼠肺部組織結構無顯著破壞，且Sev 組僅有少量炎癥細胞浸潤，提示Sev 和MCC950對大鼠肺部組織無損害作用，可以作為神經(jīng)炎癥的可靠模型進行后續(xù)研究。

水迷宮已被廣泛用于評估嚙齒類動物認知行為能力的有效手段［13］。本研究數(shù)據(jù)表明，各組大鼠學習能力基線一致，可排除先天愚鈍型大鼠。Sev干預后，Sev 組大鼠學習記憶能力降低，表現(xiàn)在逃避潛伏期和工作記憶時間顯著增加，提示Sev誘導的衰老模型大鼠出現(xiàn)了認知功能障礙，該結果與其他的相關報道一致［14-16］。而經(jīng)MCC950 治療后，Sev+MCC950組大鼠記憶能力都顯著提高，提示MCC950 在一定程度上可以緩解Sev 導致的認知功能損害。有趣的是，Sev并未影響大鼠的運動能力。

研究表明，大腦前額葉皮質區(qū)是調控自發(fā)性活動、注意力、學習記憶等高階認知能力的重要腦區(qū)，對外界刺激尤其是炎癥因子十分敏感，過高的炎癥因子對認知功能會產(chǎn)生損害［17］。另有研究表明，小膠質細胞受到損傷刺激時會迅速增殖活化，釋放多種炎癥因子誘發(fā)神經(jīng)炎癥，Iba-1 作為小膠質細胞細胞活化的標志性蛋白，其表達水平代表著腦內(nèi)神經(jīng)炎癥水平［18-19］。因而我們推測這可能與Sev 激活小膠質細胞分泌大量炎癥因子有極大的關系。結果和我們預想的一致，Sev導致大鼠前額葉皮質神經(jīng)元細胞受損，同時Iba1 蛋白表達水平顯著升高，MCC950治療后抑制了大鼠腦內(nèi)小膠質細胞的過度活化，且顯著減輕神經(jīng)元細胞損傷情況。這一結果提示，MCC950提高大鼠抗炎能力，抑制大量炎癥所致的大腦損傷，改善大鼠認知能力。

研究表明，NLRP3 炎癥小體可以在神經(jīng)元和小膠質細胞表達［20］?；诖耍覀冇^察到Sev顯著增加大鼠前額葉皮質中NLRP3 和caspase-1 蛋白表達水平，同時觀察到IL-1β 和IL-18炎癥水平表達增加，而MCC950 治療后逆轉了這些結局的發(fā)生。最近研究報道，MCC950可減輕腦損傷及相應的炎癥信號［21］也支持了這一觀點。另外，我們觀察到各組ASC 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義。有研究表明，IL-1β 和IL-18 合成與分泌受到其他蛋白通道的調控，然而與NLRP3 炎癥小體相關的只有蛋白激酶D 被報道［22］，是否還有其他通道的參與目前尚未可知。因此我們推測其他蛋白（如蛋白激酶D等）可能參與NLRP3炎癥小體的組成。同時，我們的研究結果進一步表明MCC950 是NLRP3 炎癥小體抑制劑，且可減輕Sev 導致的認知功能損害，抑制NLRP3 炎癥小體活化及下游炎癥因子表達。

本研究有一定的局限性：首先，大鼠在Sev 暴露期間未進行任何手術刺激，NLRP3 炎癥小體激活情況與手術之間的關系尚不清楚；其次，在本研究中僅使用雄性大鼠來避免雌激素和孕激素的干擾可能會對學習和記憶有潛在影響。我們下一步擬對本研究中的不足之處再進行深入探討。

綜上所述，Sev 導致衰老模型大鼠認知功能障礙及前額葉皮質神經(jīng)炎癥發(fā)生，其機制可能與Sev活化小膠質細胞NLRP3 炎癥小體，進而誘導IL-1β 和IL-18炎癥因子水平升高有關。