郭 晶， 陳麗文， 溫藝紅， 黃智琪， 陳澤潤， 劉彥俊，朱杰寧， 方咸宏， 徐金東， 單志新，△

（1華南理工大學醫(yī)學院，廣東 廣州 510006；2廣東省心血管病研究所，廣東 廣州 510080；3華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；4南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510280；5廣東省臨床藥理學重點實驗室，廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學科學院，廣東 廣州 510080）

心肌肥厚是心臟通過增大心肌細胞體積，增強心肌收縮力，減輕心室壁壓力，以維持心臟正常功能的一種代償反應［1］，主要分為生理性心肌肥厚和病理性心肌肥厚，生理性心肌肥厚可維持心臟的正常功能，而病理性心肌肥厚常伴隨心力衰竭（heart failure，HF）、心律失常甚至死亡［2］。HF 是由多種病因引起的心功能損害的一個共同慢性病理階段［3］，而心肌肥厚是HF 形成的重要病理機制，因此阻斷心肌肥厚過程對治療HF有重要意義。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是由外顯子或內含子通過特殊剪切方式而形成的閉合環(huán)狀分子［4］。與線性mRNA 相比，circRNA 不具有5'-加帽結構及3'-ploy尾，可免受核酸外切酶的消化，豐富表達于真核細胞中［5-7］。近年來circRNA 的多種生理功能被發(fā)現(xiàn)，例如，它們作為miRNA 海綿阻止mRNA 翻譯［8］，與RNA 相關蛋白結合［9］，通過調節(jié)剪接或轉錄影響基因表達［10］，從而在生物學過程和許多疾病的進展中發(fā)揮關鍵作用。有研究表明，circRNA 可影響動脈粥樣硬化［11］、心肌梗死［12］以及心室重構［13-14］等多種心血管疾病的進程，但其具體分子機制尚不明確。

課題組前期工作顯示，來自于Kelch 蛋白樣家族成員20（Kelch-like family member 20，KLHL20）基因的circRNA_100395 可通過結合微小RNA-144-3p（microRNA-144-3p，miR-144-3p）發(fā)揮抑制人心房肌成纖維細胞纖維化相關基因表達的作用［15］，而circRNA_100395對于心肌肥厚是否有調控作用及其機制尚不清楚。本項工作利用HF 患者心肌組織及血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）誘導的人AC16心肌細胞肥大模型，檢測circRNA_100395 的表達特征，利用原代分離乳小鼠心肌細胞（neonatal mouse ventricular cardiomyocytes，NMVCs），通過重組腺病毒rAd-circRNA_100395介導過表達該circRNA，探究其對心肌肥大相關基因表達的調控及作用機制。

材料和方法

1 動物

SPF 級出生1～3 d的C57BL/6乳小鼠，雌雄不限，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（粵）2013-0034。

2 細胞株和主要試劑

本文所用細胞株均購自ATCC。細胞培養(yǎng)所需胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶（tryp?sin-EDTA）、培養(yǎng)液（DMEM/F-12）等均購自Gibco；Li?pofectamine 2000、Lipofectamine RNAi MAX Reagent、4× SDS Loading Buffer 和Trizol 均購自Invitrogen；2×SYBR Green Mix（TaKaRa）；RIPA 蛋白裂解液（Beyo?time）；PVDF 膜（Whatman）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；ECL 化學發(fā)光檢測試劑盒（Millipore）；兔抗β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）抗體（Sigma）；兔抗骨骼肌α-肌動蛋白（skeletal muscle α-actin，ACTA1）抗體、鼠抗GAPDH抗體及抗兔和抗小鼠Ⅱ抗（Protein Technology）；兔抗心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）抗體（Bioworld）；質粒提取試劑盒（Omega）；miR-31-5p mimic（廣州銳博生物科技有限公司）；其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純。本文所涉及的引物均來自Invitrogen，詳細信息見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 主要方法

3.1 實驗組織本項研究共收集了8份健康捐獻者心肌組織和14份HF患者心肌組織，獲取的人心肌組織樣品均獲得患者知情同意，并經廣東省人民醫(yī)院倫理委員會批準（批準號No.GDREC2014066A），手術樣品來源：廣東省心血管病研究所。

3.2 NMVCs 的原代分離與培養(yǎng)取出生1～3 d 的SPF 級C57BL/6 乳小鼠心臟置于潔凈的冷PBS 溶液中，去除非心肌組織的腺體以及殘留的血液之后轉移至50 mL 離心管中，加入冷PBS 吹打2～3 次后，加入5 mL 0.25% EDTA-胰蛋白酶和7 mL PBS，4 ℃、70 r/min 于搖床上消化過夜（12～16 h）。過夜后，仍可見完整的心臟組織，終止消化后留取細胞沉淀，加入7 mL 無血清培養(yǎng)液和70 μL 膠原酶Ⅱ，37 ℃、70 r/min于搖床上孵育消化10 min，用巴式管反復吹打10～20次，可見組織完全消化。向懸液中加入25 mL 完全培養(yǎng)液終止消化，離心后棄上清，加入冷PBS 重懸后使用70 μm 濾網過濾，300×g常溫離心5 min 收集細胞。加入完全培養(yǎng)液獲取細胞懸液，置于75 cm2的培養(yǎng)瓶中，在恒定條件下（溫度為37 ℃、CO2體積分數為5%）的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5～2 h 后，根據差速貼壁原理分離NMVCs。將分離的心肌細胞懸液鋪到預先用1% 明膠包裹的12 孔板內，待細胞穩(wěn)定生長24 h 后，用PBS 漂洗細胞后更換新的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后處理。

3.3 RT-qPCR 檢測利用Trizol 法從人心肌組織或NMVCs中提取總RNA。取1 μg總RNA 加入4 μL 5×逆轉錄試劑（含有dNTP Mixture、Oligo-dT Primer、Random Primers、PrimeScript RTase 和RNase Inhibi?tor）進行逆轉錄反應后得到普通體cDNA，通過qPCR檢測circRNA_100395 表達水平及KLHL20 和心肌肥厚標志物的mRNA 水平。另外取1 μg 總RNA，加入0.2 μL 特異性miRNA 逆轉錄引物、5 μL 5× Prime?Script RT Buffer、1.25 μL RT Enzyme Mix 進行逆轉錄，得到成熟體cDNA，以其為模板進行qPCR，以U6為內參照檢測miRNAs 的表達水平。 在ViiA ?7 Quantitative PCR System（Applied Biosystems）中進行PCR 和結果分析。 利用2?ΔΔCt法計算miRNAs、circRNA_100395、KLHL20和心肌肥厚生物標志物的相對表達水平。

3.4 Western blot 檢測蛋白表達水平向NMVCs 中加入蛋白裂解液RIPA 冰上裂解15 min 后，轉移至1.5 mL EP 管內，4 ℃、10 000×g離心15 min 吸取上清。配制BCA 工作液，37 ℃孵育30 min 后測定蛋白濃度，取20 μg 蛋白上清液，加入4×SDS Loading Buf?fer，混勻后99 ℃、10 min 變性，樣品于深低溫保存?zhèn)溆?。通過SDS-PAGE、轉膜、封閉，用所需檢測蛋白的相應抗體［anti-GAPDH（1∶5 000），anti-β-MHC（1∶2 000），anti-ACTA1（1∶2 000），anti-ANP（1∶1 000）］，對PVDF 膜進行4 ℃過夜孵育。用TBST 溶液洗膜3次后用相應Ⅱ抗（1∶5 000）進行室溫孵育1 h。再次用TBST溶液漂洗3次，ECL發(fā)光試劑盒顯影，內參照為GAPDH，利用ImageJ進行圖像灰度分析。

3.5 雙螢光素酶報告基因檢測以pGL3-promoter為載體，根據生物信息學預測的circRNA_100395 與miR-31-5p 的結合序列，將該段序列及其突變序列分別插入pGL3-promoter 構建雙螢光素酶報告基因載體。準備工具細胞HEK-293 均勻鋪至24 孔板，穩(wěn)定生長后共轉染500 ng 上述構建的重組質粒、0.2 ng pRL-TK 以及100 nmol/L miR-31-5p mimic，24 h 后收板。 分別測定螢火蟲螢光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)L）和海腎螢光素酶（Renillaluciferase，RL）的發(fā)光強度，兩者的比值（FL/RL）變化即可反映circRNA_100395與miR-31-5p相互結合的能力。

3.6 鬼筆環(huán)肽（phallodin）染色準備confocal皿，均勻鋪入NMVCs，經病毒感染或miR-31-5p mimic 轉染處理后，棄原培養(yǎng)液后用PBS 漂洗2 次。吸干PBS，加入500 μL 4% 多聚甲醛固定液，常溫下靜置20～30 min。吸干多聚甲醛溶液，用PBS 清洗2～3 次，每次10 min，加入500 μL 0.1% Triton X-100 透化液，室溫下靜置3～5 min。吸干透化液，再次用PBS 清洗細胞2～3次。吸干PBS，加入500 μL新鮮配制的鬼筆環(huán)肽工作液（1 mL 1% BSA 溶液加入1 μL 1 000× iFluor 647），常溫下避光靜置60～90 min。染色結束后，用PBS 清洗3 次，每次5 min。吸干PBS，滴入DAPI 封片劑，于4 ℃冰箱內避光保存，待共聚焦顯微鏡拍攝圖片。

3.7 RNA pull-down 實驗準備NMVCs 均勻鋪于6孔板中，穩(wěn)定生長后感染rAd-circRNA_100395過夜，轉染生物素探針標記的circRNA_100395-probe，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后提取總RNA，同時準備鏈霉素磁珠，將二者混合后室溫孵育30 min。利用磁力架收集磁珠，加入洗脫液反復洗脫3 次，獲得與磁珠結合的總RNA 混合物。利用RT-qPCR 檢測可能與circRNA_100395結合的幾種miRNAs的含量。

4 統(tǒng)計學處理

應用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行統(tǒng)計分析。數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較采用t檢驗；多組間均數比較先進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析（oneway ANOVA），并用Bonferroni 校正的t檢驗進行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 circRNA_100395在HF患者心肌組織中表達上調

麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）染色結果顯示，與健康對照組相比，HF 患者的心肌細胞面積明顯增大，呈現(xiàn)心肌細胞肥大現(xiàn)象（圖1A）。通過Western blot 實驗證實，相對于健康器官捐獻者，HF 患者心肌組織β-MHC 及ACTA1 蛋白水平顯著上調（P<0.01），見圖1B。RT-qPCR 結果提示circRNA_100395及其宿主基因KLHL20在HF患者心肌組織中表達上調（P<0.05），見圖1C。PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，circRNA_100395 可由人cDNA 擴增出特異性條帶，而不能由人基因組DNA（genomic DNA，gDNA）擴增，見圖1D。通過DNA 測序，證實PCR 產物中包含正確的circRNA_100395 接頭序列（圖1E）。RT-qPCR 實驗表明在Ang II 處理的AC16心肌細胞肥大模型中，circRNA_100395 及其宿主基因KLHL20表達下調（P<0.05），見圖1F。

2 circRNA_100395 抑制心肌細胞肥大相關基因的表達

Figure 1.Up-regulation of circRNA_100395 in the myocardium of patients with heart failure（HF）.A：the cross-sectional area of car?diomyocytes was increased in the myocardium of HF patients（WGA staining，scale bar=100 μm）；B：the protein expres?sion of β-MHC and ACTA1 in the myocardium of HF patients and healthy controls detected by Western blot；C：the expres?sion of circRNA_100395 and KLHL20 mRNA in the myocardium of HF patients and healthy controls detected by RTqPCR；D：identification of circRNA_100395 and KLHL20 gene by PCR assay；E：DNA sequencing results confirmed the correct sequence of the junction site of circRNA_100395；F：the expression of circRNA_100395 and KLHL20 mRNA in Ang-II-treated human cardiomyocyte AC16 cells detected by RT-qPCR. n=3.Mean±SD.*P<0.05，**P<0.01 vs healthy controls；#P<0.05 vs vehicle.圖1 circRNA_100395在心衰患者心肌組織中表達上調

利用定向克隆構建重組circRNA_100395 腺病毒感染NMVCs，24 h后收板，倒置熒光顯微鏡下可見rAd-circRNA_100395 表達的綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP），顯示腺病毒感染NMVCs充分（圖2A）。RT-qPCR 結果進一步證實circRNA_100395 在rAd-circRNA_100395 感染 的NMVCs 中 表達含量顯著增加（P<0.01），見圖2B，同時隨cir?cRNA_100395 表達含量增加，心肌細胞肥大相關基因Myh7（蛋白β-MHC）、Acat1以及Anp的mRNA 和蛋白表達顯著下調（P<0.05），見圖2C、D。鬼筆環(huán)肽染色可見Ang II 處理后的NMVCs 細胞表面積明顯增大，而感染rAd-circRNA_100395可有效逆轉由Ang II引起的的心肌細胞肥大反應，見圖2E。

3 circRNA_100395與miR-31-5p相互作用的鑒定

通過生物信息學預測，circRNA_100395 與miR-31-5p 存在結合位點（圖3A）。通過雙螢光素酶報告基因實驗，分別構建pGL3-circRNA_100395 和pGL3-circRNA_100395-mut，將兩種質粒分別與miR-31-5p mimic 共轉染至HEK293 細胞中，結果顯示共轉染circRNA_100395 與miR-31-5p mimic，螢光素酶活性相對于對照組顯著降低（P<0.05），而將該位點突變后，其螢光素酶活性無明顯改變（圖3B）。RT-qPCR結果提示，miR-31-5p 在HF 病人心肌組織中表達下調（P<0.05），見圖3C。同時，在NMVCs 中感染rAdcircRNA_100395 可 引 起miR-31-5p 降 低（P<0.05）（圖3D）。通過RNA-RNA pull-down 實驗，利用生物素標記的circRNA_100395 探針可明顯富集NMVCs中miR-31-5p（P<0.01）（圖3E）。

Figure 2.circRNA_100395 attenuates the expression of hypertrophy-related genes in NMVCs.A：adenovirus-mediated efficient overexpression of circRNA_100395 in NMVCs（the infection of recombinant circRNA_100395 adenovirus（rAd-circRNA_100395）was monitored by the co-expressed marker of GFP；scale bar=100 μm）；B：the expression of circRNA_100395 determined by RT-qPCR；C：the mRNA expression of β-MHC，ACTA1 and ANP in NMVCs detected by RT-qPCR；D：the protein expression of β-MHC，ACTA1 and ANP in NMVCs determined by Western blot；E：morphological changes of NMVCs observed by Phalloidin-iFluor 647 staining（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs rAd-GFP group；#P<0.05 vs rAd-GFP+Ang II group.圖2 circRNA_100395抑制乳小鼠心肌細胞中肥大相關基因的表達

4 miR-31-5p 可減弱circRNA_100395 對心肌細胞肥大的抑制作用

Figure 3.Identification of interaction between circRNA_100395 and miR-31-5p.A：bioinformatics prediction showed the potential binding sites of miR-31-5p in circRNA_100395（the mutant nucleotides were labled in red）；B：verification of miR-31-5p as a target gene of circRNA_100395 by the dual-luciferase reporter assay；C：the expression of miR-31-5p in the myocar?dium of HF patients and healthy controls；D：the expression of miR-31-5p in NMVCs with overexpression of circRNA_100395；E：the levels of miRNAs which were pulled down by circRNA_100395 in NMVCs.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs pRL-TK+PGL3_circRNA_100395-wt+scramble group；#P<0.05 vs healthy control group；△P<0.05 vs rAd-GFP group；▲▲P<0.01 vs miR_200a-3p group.圖3 CircRNA_100395與miR-31-5p相互結合作用的鑒定

利用Lipofectamine 試劑，將miR-31-5p mimic 轉染至NMVCs 中低血清培養(yǎng)30 h，RT-qPCR 結果顯示，NMVCs 中miR-31-5p 含量顯著增加（P<0.01），同時促進心肌細胞肥大相關基因Myh7、Acta1以及Anp的mRNA 表達（P<0.01）見圖4A、B。另外Western blot 實驗得到與mRNA 水平一致的結果，在轉染了miR-31-5p mimic 后，β-MHC、ACTA1 以及ANP 表達水平顯著增加，見圖4C。鬼筆環(huán)肽染色可見miR-31-5p 可明顯增加NMVCs 的肥大反應（P<0.05），見圖4D）。利用NMVCs，先行感染rAd-circRNA_100395過夜后再轉染100 nmol/L miR-31-5p mimic，24 h 后檢測心肌細胞肥大相關基因的表達情況。Western blot 結果顯示，感染circRNA_100395 的NMVCs 的β-MHC、ACTA1 以及ANP 表達顯著下調，轉染miR-31-5p 可減弱circRNA_100395 對β-MHC、ACTA1 以及ANP表達的抑制作用（圖4E）。

討 論

前期研究［15］已證實，circRNA_100395 可通過結合miR-144-3p 發(fā)揮抑制心肌纖維化相關基因表達，但其對心肌肥厚的調控作用及機制尚不清楚。本研究表明circRNA_100395 通過結合miR-31-5p 抑制乳小鼠心肌細胞肥大相關基因的表達，提示該circRNA對于心肌纖維化和心肌肥厚具有雙重抑制作用，可能成為心肌重構治療研究的重要靶點。

本項研究結果顯示circRNA_100395 及其宿主基因KLHL20在HF 患者心肌組織中表達升高，而在Ang II 誘導的AC16 心肌肥大模型中表達降低，這種整體和細胞水平表達特征不一致提示人心肌組織和心肌重構病理機制的復雜性。心肌組織包括心肌細胞、心肌成纖維細胞、內皮細胞和免疫相關細胞等多種類型的細胞構成。HF 是多種心血管疾病的終末階段，往往由心肌肥厚發(fā)展而來［16］；HF 發(fā)生時，多種信號通路被激活［17］，炎癥因子或者細胞因子釋放，進而可引起體內多種circRNA以及mRNA的表達改變，進而出現(xiàn)與細胞水平不一致的情況。

Figure 4.miR-31-5p reversed the inhibitory effect of circRNA_100395 on the expression of hypertrophy-related genes in NMVCs.A：miR-31-5p level in NMVCs transfected with miR-31-5p mimic；B：the mRNA expression of β-MHC，ACTA1 and ANP in NMVCs transfected with miR-31-5p mimic；C：the protein expression of β-MHC，ACTA1 and ANP in NMVCs transfected with miR-31-5p mimic；D：morphological changes of NMVCs observed by Phalloidin-iFluor 647 staining（scale bar=50 μm）；E：the protein expression of β-MHC，ACTA1 and ANP in NMVCs determined by Western blot.Mean±SD. n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs scramble；△P<0.05，△△P<0.01 vs scramble+rAd-GFP；#P<0.05 vs miR-31-5p+rAd-GFP.圖4 miR-31-5p過表達可以減弱circRNA_100395對心肌細胞肥大相關基因的抑制作用

已有研究證實來自于胞質的circRNA 可通過海綿吸附microRNA 以解除對下游靶基因的控制而發(fā)揮生物學作用［18］，課題組前期的研究證實circRNA_000203 通過競爭性結合miR-26b-5p 和miR-140-3p，阻斷二者與下游靶基因gata4結合，從而發(fā)揮促進心肌肥厚的作用［19］。在本項研究中，通過生物信息學預測結合雙螢光素酶報告基因以及RNA-RNA pulldown 實驗，證實了circRNA_100395 與miR-31-5p 的結合作用。在HF 病人心肌中circRNA_100395 與miR-31-5p 呈現(xiàn)相反的表達特征，而在NMVCs 中過表達circRNA_100395 可顯著降低miR-31-5p 水平，也提示兩者間存在表達調控關系。功能實驗證實，過表達miR-31-5p 可以特異地增加NMVCs 的肥大反應，減弱circRNA_100395 對心肌細胞肥大的抑制作用，證實circRNA_100395 可通過結合miR-31-5p 發(fā)揮抑制心肌細胞肥大的作用。我們既往研究證實circRNA_100395可通過結合miR-144-3p抑制心肌纖維化相關基因的表達［15］，本文研究明確circRNA_100395 通過結合miR-31-5 抑制心肌細胞的肥大作用，因此說明circRNA_100395 是通過結合不同的miRNAs 分別發(fā)揮抑制心肌細胞肥大和纖維化表型的，具有細胞類型的特異性。

以往研究證實miR-31-5p 可參與多種心血管疾病的調控，如miR-31-5p 可抑制心肌素表達，促進血管平滑肌細胞表型轉換以及主動脈瘤和夾層的發(fā)生［20］。miR-31-5p 可參與lncRNA Tincr 調控PKC? 的表達，抑制miR-31-5p 的表達可以顯著逆轉由ln?cRNA Tincr 引起的心肌細胞的增大［21］。而在本研究再次證實miR-31-5p 可以增加心肌細胞肥大相關基因表達和肥大反應，與既往的報道一致［21］，也提示抑制miR-31-5p 功能可能發(fā)揮減弱心肌細胞肥大的作用。

綜上，本項研究提示circRNA_100395 在HF 組織中表達上調，circRNA_100395 可抑制心肌細胞肥大相關基因的表達，而該作用可被與其特異結合的miR-31-5p 逆轉。后續(xù)我們將繼續(xù)明確miR-31-5p 的下游靶點，探究其具體的分子機制以及涉及的信號通路，并在整體上驗證circRNA_100395 通過結合miR-31-5p 發(fā)揮抑制心肌肥厚的機制，為開展基于circRNA的心肌肥厚治療研究提供科學資料。