馬 青， 李長(zhǎng)毅， 王導(dǎo)新， 鄧 旺

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400010）

上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）是肺泡腔內(nèi)鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)的重要環(huán)節(jié)，能有效地清除聚集的水腫液，對(duì)維持氣體交換和改善氧合至關(guān)重要，可明顯降低急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）患者的病死率［1］。磷酯酰肌醇3-激酶（phos?phatidylinositol 3-kinase，PI3K）是參與調(diào)節(jié)ALI 肺泡液體清除（alveolar fluid clearance，AFC）的重要信號(hào)通路，但其下游的作用靶點(diǎn)及與ENaC 的關(guān)系仍未完全闡明清楚［2］。血清-糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1（serumglucocorticoid regulated kinase 1，SGK1）是胰島素激活PI3K 通路發(fā)揮效應(yīng)的下游重要靶點(diǎn)，也是調(diào)節(jié)ENaC 表達(dá)的關(guān)鍵因子［3］。本研究通過(guò)建立小鼠ALI模型，觀察PI3K/SGK1信號(hào)通路對(duì)AFC 及ENaC 表達(dá)的影響，探討PI3K/SGK1信號(hào)通路在ALI中的作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF 級(jí)雄性C3H/HeN 小鼠24 只（7～9 周，體重為20～24 g）購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（渝）2007-0001］。脂多糖（lipopolysac?charide，LPS；O111：B4）和伊文思藍(lán)（Evans blue）購(gòu)自Sigma；重組人胰島素購(gòu)自EliLilly；PI3K p85α小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）購(gòu)自Santa Cruz；SGK1siRNA 由Gene Pharma 設(shè)計(jì)并合成；ENaC α亞基（α-ENaC）、ENaC β亞基（β-ENaC）、ENaC γ亞基（γ-ENaC）、PI3K p85α、SGK1、磷酸化SGK1（Ser422）及β-actin 單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；RNA 提取試劑盒和RT-PCR 試劑盒購(gòu)自TaKaRa；Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型與分組小鼠給予巴比妥50 mg/kg腹腔注射麻醉后，分離暴露頸靜脈，留置靜脈導(dǎo)管，氣道內(nèi)滴入LPS（5 mg/kg）建立ALI 模型［4］。24 只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、ALI 組、胰島素組和PI3KsiRNA組，每組6 只小鼠。對(duì)照組：經(jīng)頸靜脈泵入等體積的生理鹽水；ALI 組：給予LPS 建立ALI 模型后，持續(xù)泵入等體積的生理鹽水；胰島素組：給予LPS 建立ALI模型后，持續(xù)經(jīng)頸靜脈泵入胰島素（0.1 U·kg?1·h?1）［5］；PI3KsiRNA 組：建立ALI 模型，持續(xù)泵入胰島素（0.1 U·kg?1·h?1）的同時(shí)，100 μgPI3K p85αsiRNA稀釋于100 μL生理鹽水中通過(guò)移液管直接導(dǎo)入小鼠喉嚨，立即閉合小鼠氣道［6］。對(duì)照組、ALI 組和胰島素組中以同樣方式給予等量的空白siRNA 作為參照。8 h后處死小鼠，收集肺組織標(biāo)本。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染小鼠原代肺泡上皮II 型細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。 依據(jù)Lipo?fectamine?2000 轉(zhuǎn)染的要求，細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染PI3KsiRNA 和SGK1siRNA。轉(zhuǎn)染72 h 后，細(xì)胞于含或不含200 mU/L 胰島素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 h。細(xì)胞分組：對(duì)照組（無(wú)胰島素）、胰島素組、PI3KsiRNA（胰島素+PI3K p85αsiRNA）組和SGK1siRNA（胰島素+SGK1siRNA）組。

2.3 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）收集小鼠麻醉后，打開(kāi)胸腔，用腰麻導(dǎo)管做氣管置管，用1 mL 生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，共3次，回收率達(dá)80%～90%。將收集的BALF 取少許置于白細(xì)胞計(jì)算盤(pán)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，在高倍鏡下計(jì)數(shù)除上皮細(xì)胞及紅細(xì)胞外的所有細(xì)胞。BALF以14 000×g離心10 min后沉淀的細(xì)胞再加1 mL RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，搖勻后取20 μL做細(xì)胞計(jì)數(shù)，最終取4×104個(gè)細(xì)胞用Diff-Quik染色，觀察總細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)。

2.4 AFC 測(cè)定游離右肺組織并行氣管插管，注入100% 氮?dú)夂?，將?.15 g/L Evans blue 標(biāo)記的5% 白蛋白等滲生理鹽水（5 mL/kg）經(jīng)導(dǎo)管灌入小鼠肺組織，機(jī)械通氣1 h 后測(cè)定肺泡腔內(nèi)Evans blue 標(biāo)記的白蛋白濃度，根據(jù)公式計(jì)算：AFC（%）=（Vi?Vf）/Vi×100%，Vf=Vi×Pi/Pf［8］。Vi：起始注入肺泡內(nèi)液體量；Vf：最后肺泡內(nèi)液體量；Pi：起始注入的Evans blue 標(biāo)記的白蛋白濃度；Pf：最后Evans blue 標(biāo)記的白蛋白濃度。

2.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織10% 福爾馬林固定，石蠟包埋切片，厚度5 μm。10% 胎牛血清水浴箱封閉1 h 后，PBS 洗凈3次后，分別與α-ENaC、β?ENaC 和γ-ENaC Ⅰ抗4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。PBS 沖洗3 次，再與熒光標(biāo)記Ⅱ抗（Alexa Fluor 594 goat anti?rabbit IgG）37 ℃水浴箱孵育1 h，PBS 沖洗3次。加DAPI 染核，PBS 沖洗3 次，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.6 RT-PCR 實(shí)驗(yàn)提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)RT-PCR試劑盒要求，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR 條件：預(yù)變性94 ℃1 min；變性94 ℃30 s，退火53 ℃（α -ENaC）、53 ℃（β-ENaC）、55 ℃（γ-ENaC）和55 ℃（βactin）30 s，72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)。PCR 引物序列如下：α-ENaC 的上游引物為5'-TACCCTTCCAAG?TATACACAGC-3'，下游引物為5'-CAGAAGGAGA?CTCCGAATTAGT-3'，產(chǎn)物509 bp；β-ENaC 的上游引物為5'-GCTAAAGAGCTAGCAGTAATGG-3'，下游引物為5'-CTGGTGTTTGTTATGCCTAGAG-3'，產(chǎn)物406 bp；γ-ENaC 的上游引物為5'-GGATCCTGAGAGAGA?ATCATGC-3'，下游引物為5'-GTGTCCAGCTAT?GCCCTTTAAC-3'，產(chǎn)物363 bp；β-actin的上游引物為5'-GTACAACCTTCTTGCAGCTCCT-3'，下游引物為5'-ACAGGATTCCATACCCAGGAAG-3'，產(chǎn)物871 bp。PCR 產(chǎn)物在1.0% 瓊脂糖上進(jìn)行凝膠電泳。Quantity One 軟件分析目的條帶密度，以目的條帶與β-actin比值作為結(jié)果進(jìn)行比較。

2.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)提取細(xì)胞膜蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5% 脫脂奶粉封閉1 h 后，分別與抗體（α-ENaC 和γ-ENaC，1∶300；β?ENaC、SGK1 和磷酸化SGK1，1∶500；PI3K p85α，1∶1 000；β-actin，1∶2 500）4 ℃孵育過(guò)夜。用Tris 緩沖液+Tween 20（TBST）洗膜3 遍，然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1.5 h，ECL 顯色。凝膠成像系統(tǒng)掃描，Quantity One 軟件分析目的條帶吸光度（A）值，以目的條帶與β-actin比值作為結(jié)果進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析處理結(jié)果。所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)變化

與對(duì)照組比較，ALI 組BALF 中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05）；與ALI 組比較，胰島素組BALF 中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)顯著降低（P<0.05）；與胰島素組比較，PI3KsiRNA干預(yù)后BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)顯著升高（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)變化Table 1.Numbers of total cells and neutrophils in BALF（×104 L?1.Mean±SD. n=6）

2 AFC情況

與對(duì)照組比較，模型組AFC顯著降低（P<0.05）；胰島素治療后，AFC 顯著提高（P<0.05）；PI3KsiRNA干預(yù)后，AFC 較胰島素組顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1.Changes of alveolar fluid clearance in each group.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs ALI group；△P<0.05 vs insulin group.圖1 各組肺泡液體清除率變化情況

3 免疫熒光染色檢測(cè)肺組織ENaC蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較，ALI 組α-ENaC、β-ENaC 和γ-ENaC 的表達(dá)減少；胰島素組α-ENaC、β-ENaC 和γ-ENaC 的表達(dá)增加；PI3KsiRNA 干預(yù)后α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC的表達(dá)減少，見(jiàn)圖2。

4 肺泡上皮細(xì)胞ENaC mRNA表達(dá)

與胰島素組比較，PI3KsiRNA 組中α-ENaC、β-ENaC 和γ-ENaC 的mRNA 表達(dá)顯著降低（P<0.05）；與胰島素組比較，SGK1siRNA 組中α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC 的mRNA 表達(dá)顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖3及表2。

5 肺泡上皮細(xì)胞ENaC蛋白表達(dá)

與胰島素組比較，PI3KsiRNA 組中α-ENaC、β-ENaC 和γ-ENaC 的蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）；與胰島素組比較，SGK1siRNA 組中α-ENaC、β-ENaC 和γ -ENaC 的蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖4及表2。

表2 各組肺泡上皮鈉通道的表達(dá)Table 2.Expression of ENaC in each group（Mean±SD. n=6）

6 肺泡上皮細(xì)胞SGK1磷酸化水平

與對(duì)照組比較，胰島素組SGK1磷酸化水平顯著升高（P<0.05）；與胰島素組比較，PI3KsiRNA 干預(yù)后SGK1磷酸化水平顯著降低（P<0.05）；與胰島素組比較，SGK1siRNA 干預(yù)后SGK1 磷酸化水平顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖5。

討 論

Figure 2.The expression of ENaC in lung tissues of each group detected by immunofluorescence staining.The scale bar=50 μm.圖2 免疫熒光染色檢測(cè)各組肺組織ENaC表達(dá)

Figure 3.The mRNA levels of α-，β- and γ-ENaC in alveolar epithelial cells of each group detected by RT-PCR.圖3 RT-PCR 檢測(cè)各組肺泡上皮細(xì)胞中ENaC 的mRNA 表達(dá)水平

Figure 4.The protein levels of α-，β- and γ-ENaC in alveolar epithelial cells of each group detected by Western blot.圖4 Western blot 檢測(cè)各組肺泡上皮細(xì)胞中ENaC 的蛋白表達(dá)水平

ALI/ARDS 由于多種肺內(nèi)外病因?qū)е路闻?微血管屏障結(jié)構(gòu)破壞，肺微血管通透性增高，從而肺泡腔內(nèi)富含蛋白質(zhì)的大量水腫液聚集及透明膜形成，導(dǎo)致呼吸窘迫及頑固性低氧血癥，近10 年住院死亡率達(dá)45%［9-10］。LPS 通過(guò)激活大量的促炎癥因子啟動(dòng)NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子，釋放炎癥介質(zhì)，大量中性粒細(xì)胞聚集，釋放活性氧，引起肺泡上皮-毛細(xì)血管屏障損傷和滲漏，引起肺水腫，是模擬ALI/ARDS 的常用方法［11］。本研究中通過(guò)LPS 建立小鼠ALI 模型，ALI 模型組中BALF 的總粒細(xì)胞數(shù)和中細(xì)胞數(shù)顯著增加，AFC 降低，提示肺泡-微血管屏障破壞及炎癥因子聚集，與人的ALI/ARDS病理生理表現(xiàn)相似。

Figure 5.The phosphorylation of SGK1 in alveolar epithelial cells detected by Western blot.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs insulin group.圖5 肺泡上皮細(xì)胞SGK1磷酸化水平

SGK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其激活依賴于羧基末端疏水基序中Ser422 通過(guò)胰島素作用PI3K信號(hào)通路的磷酸化實(shí)現(xiàn)［12］。本實(shí)驗(yàn)中胰島素作為激活PI3K/SGK1 通路的有效途徑，同時(shí)還具有抗炎作用［13］。本實(shí)驗(yàn)中胰島素的劑量不會(huì)引起血糖的較大差異的變化，這在前期研究中已經(jīng)得到證實(shí)［5］。在胰島素作用后，炎癥細(xì)胞的滲出減少，AFC 增加，肺組織損傷減少。PI3KsiRNA 干預(yù)后，明顯抑制了胰島素引起的保護(hù)效應(yīng)，炎癥細(xì)胞滲出顯著增加，說(shuō)明胰島素激活的PI3K信號(hào)通路減輕LPS誘導(dǎo)的肺損傷，保護(hù)了小鼠肺組織。

AFC 被認(rèn)為是排除肺泡腔內(nèi)過(guò)多水腫液的有效途徑［14-15］。本研究中PI3KsiRNA 干預(yù)后，AFC 也較胰島素組顯著降低，提示PI3K 信號(hào)通路能有效促進(jìn)AFC，減輕肺水腫。肺泡ENaC 是肺泡腔內(nèi)鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，完成鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的限速步驟，為排除肺泡腔內(nèi)過(guò)多的水腫液提供源動(dòng)力，是調(diào)節(jié)AFC 的最重要途徑和治療肺水腫的一個(gè)靶點(diǎn)［16-17］。ENaC 由α、β和γ 3 個(gè)亞基組成，主要表達(dá)于肺泡上皮II 型細(xì)胞。研究表明，α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC是AFC中必不可少的通道蛋白［18-19］。本研究結(jié)果顯示LPS 誘導(dǎo)的ALI 模型組中，α-、β-和γ-ENaC 蛋白的表達(dá)顯著下降，而胰島素治療后能顯著上調(diào)α-、β-和γ-ENaC 的蛋白表達(dá)，同時(shí)PI3K siRNA 干預(yù)后，α-、β-和γ-ENaC蛋白的表達(dá)顯著下降，其變化與AFC 一致，提示胰島素激活PI3K 信號(hào)通路與ENaC 介導(dǎo)的AFC 存在聯(lián)系。為進(jìn)一步探討參與AFC 調(diào)節(jié)的PI3K 信號(hào)通路下游的作用靶點(diǎn)，我們進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，胰島素干預(yù)后，α-、β-和γ-ENaC mRNA 和蛋白表達(dá)顯著增加，其變化與胰島素誘導(dǎo)的SGK1磷酸化水平升高一致。PI3KsiRNA 和SGK1siRNA 分別干預(yù)后，α-、β-和γ-ENaC 的mRNA 和蛋白表達(dá)顯著降低，其變化與SGK1 磷酸化水平降低一致，說(shuō)明α-、β-和γ-ENaC 表達(dá)的變化是通過(guò)PI3K/SGK1 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，與AFC 變化趨勢(shì)一致。 這證明了激活PI3K/SGK1 信號(hào)通路通過(guò)上調(diào)ENaC 各亞基的表達(dá)，從而促進(jìn)AFC，減輕肺水腫，保護(hù)小鼠肺組織。本研究結(jié)果揭示PI3K 信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)SGK1 與ENaC 的關(guān)系及在ALI/ARDS中調(diào)控AFC的分子基礎(chǔ)，是在我們前期研究基礎(chǔ)上的深入和完善［2，5］，這對(duì)明確疾病的發(fā)病機(jī)制具有實(shí)際價(jià)值。

ALI/ARDS近10年病死率居高不下，目前仍然缺乏相對(duì)有效的治療措施。本研究的結(jié)果提示激活PI3K/SGK1 信號(hào)通路通過(guò)上調(diào)ENaC 各亞基的表達(dá)，增強(qiáng)AFC，減輕肺組織損傷，可作為治療ALI/ARDS的潛在有效靶點(diǎn)，對(duì)疾病治療提供了參考資料。