肖 歸， 陳廣文， 李 濤， 張華莉， 王慷慨， 劉梅冬， 劉 可， 肖獻忠△

（1中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，湖南 長沙 410008；2海南醫(yī)學(xué)院國際護理學(xué)院，海南 ?？?571199；3嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，廣東 梅州 514000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種由病毒、細菌感染、外傷、中毒、膿毒癥或者休克等非心源性因素造成的急性進行性缺氧性呼吸衰竭。如果得不到控制，ALI 將發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），最終導(dǎo)致死亡［1-3］。ALI 發(fā)病率和病死率高，且目前各種治療方法效果不理想，因此在臨床治療和基礎(chǔ)研究中都引起了高度的重視［4-5］。ALI 主要表現(xiàn)為進行性呼吸窘迫和低氧血癥，其病理改變主要是微血管病變、肺泡通透性增加、大量炎癥細胞浸潤和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生增加。ALI 發(fā)病機制非常復(fù)雜，至今尚未完全闡明，但研究已經(jīng)確定炎癥反應(yīng)是最主要的機制之一。

熱休克因子1（heat shock factor 1，HSF1）是一種與熱休克反應(yīng)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)熱休克蛋白（如Hsp27、Hsp60和Hsp70）的轉(zhuǎn)錄，在肺部炎癥和損傷中發(fā)揮重要的細胞保護作用［6-10］。本課題組之前的研究表明，HSF1 對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的多器官功能障礙［11］和ALI［12］均具有抑制作用。此外，HSF1 能夠減少腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)［13-15］。然而，HSF1減輕ALI的潛在機制仍不明確，需要進一步探索。

中性粒細胞是ALI 發(fā)病機制中的重要效應(yīng)細胞，其激活和遷移與ALI 的嚴重程度密切相關(guān)?；罨闹行粤＜毎軌虍a(chǎn)生許多細胞毒性物質(zhì)，包括顆粒酶、活性氧、活性脂、各種促炎細胞因子和中性粒細胞胞外陷阱，它們可導(dǎo)致肺組織細胞損傷，對ALI 發(fā)展至關(guān)重要［16］。然而，HSF1 對ALI 中性粒細胞細胞的影響仍不明確。本研究旨在研究HSF1 對趨化因子調(diào)節(jié)作用和對中性粒細胞浸潤的影響，探討HSF1對LPS所致ALI的保護作用及其分子機制。

材料和方法

1 動物

SPF 級HSF1?/?和HSF1+/+小鼠由美國德克薩斯大學(xué)西南研究中心Dr.Ivor J.Benjamin惠贈，統(tǒng)一喂養(yǎng)在中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，由專人負責(zé)小鼠基因型檢測，獲取雄性HSF1?/?和HSF1+/+小鼠，2～3 月齡，25 g 左右。小鼠分為HSF1+/++生理鹽水（nor?mal saline，NS）組、HSF1+/++LPS 組、HSF1?/?+NS 組和HSF1?/?+LPS 組，其中HSF1+/++LPS 組和HSF1?/?+LPS組按照5 mg/kg 的劑量從氣管滴注LPS（濃度0.8 mg/mL），而HSF1+/++NS組和HSF1?/?+NS組從氣管滴注同等體積的NS。

2 主要試劑

LPS（大腸桿菌055：B5）購自Sigma；Purified rat anti-mouse CD16/CD32（貨號553142）、PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse CD45（貨號555483）、FITC anti-mouse Ly6G（貨號551459）和70 μm cell strainer 購自BD；APC anti-mouse/rat XCR-1（貨號372603）購自Bio?Legend；XCL-1 ELISA 試劑盒購自Raybiotech；antimouse Ly6G antibody 和anti-goat XCR-1 antibody 購自Santa Cruz；4% 多聚甲醛購自北京鼎國公司；PBS 購自歐盟公司。

3 主要方法

3.1 小鼠ALI 模型的建立按照之前的方法構(gòu)建小鼠ALI 模型［12］。用0.3% 戊巴比妥鈉（0.01 mL/g體重）腹腔注射麻醉小鼠，暴露小鼠氣管后，用1 mL注射器緩慢滴加LPS（5 mg/kg，濃度為0.8 mg/mL）入氣管內(nèi)，豎立起小鼠，旋轉(zhuǎn)，使LPS 分布均勻，對照組給予NS 氣管內(nèi)滴注，滴注LPS 或NS 12、24 和36 h 后檢測各項指標(biāo)。

3.2 收集小鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）分別于注射LPS 或NS 12、24 和36 h 后將小鼠用頸椎脫臼法安樂死，將小鼠固定在干凈的泡沫板上，用消毒滅菌后的眼科剪剪切小鼠頸部皮膚，暴露氣管，用鑷子從下穿過氣管，在靠近小鼠頭部的氣管切一小斜切口，將套管針輕柔插進氣管，拔出硬針，確保套管針固定在氣管內(nèi)。用1 mL注射器抽1 mL PBS 緩慢注入支氣管，用手指輕輕震蕩小鼠胸廓1 min，用1 mL 注射器回抽液體，保存在EP 管中（冰上），接著再用1 mL PBS 灌洗支氣管肺泡，重復(fù)3次，第1管回抽率為60%～70%，第2管和第3 管回抽率為80%～90%。 將存有BALF 的EP 管4 ℃、1 500 r/min 離心5 min。第1 管BALF 的上清用于XCL-1 檢測，所有EP 管中的細胞收集起來用于中性粒細胞和XCR-1流式細胞術(shù)檢測。

3.3 流式細胞術(shù)用上述收集的細胞進行流式細胞術(shù)檢測，將BALF中所有的細胞懸浮在1 mL 1×紅細胞裂解緩沖液（BD Biosciences）中5 min，然后250×g離心5 min。將含有BALF 細胞的上清液重懸于100 μL PBS 中，用0.5 μL 純化的大鼠抗小鼠CD16/CD32抗體在4 ℃下封閉10 min。BALF細胞用熒光偶聯(lián)抗體（PerCP-Cy?5.5 大鼠抗小鼠CD45 抗體0.5 μL、FITC 抗小鼠Ly6G 抗體0.5 μL 和APC 抗小鼠XCR-1抗體0.5 μL）在4 ℃下避光20 min，然后以250×g離心5 min。上清液用100 μL 2% 多聚甲醛4 ℃避光固定10 min，上流式細胞儀（BD Biosciences，LSRⅡ）檢測，使用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

3.4 ELISA使用ELISA 試劑盒（RD），根據(jù)說明書操作，檢測肺組織勻漿、BALF和血清中XCL-1水平。

3.5 免疫熒光染色滴注LPS 或NS 12、24 和36 h后，將小鼠用頸椎脫臼法安樂死，并立即取出左肺放于4% 多聚甲醛中固定24 h。石蠟包埋后，將肺組織切成4 μm 厚的切片。將切片置于檸檬酸鈉緩沖液中并在100 ℃的微波中加熱15 min，然后與PBS 中的10% 牛血清白蛋白在室溫下孵育2 h 以封閉非特異性結(jié)合位點。隨后，切片與鼠中性粒細胞單克隆抗體（抗Ly6G 抗體；1∶200）和抗XCR-1 抗體（1∶100）在4 ℃下過夜，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶50；ABclonal）在37 ℃下避光孵育1 h。用PBS 洗滌4次后，用密封液處理樣品。使用Panoramic 250/MIDI（Hungary）拍片。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism 7.0 和SPSS 21.0 分析所有數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組樣本之間比較選用獨立樣本t檢驗，多組比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HSF1對LPS 所致的ALI小鼠BALF 中性粒細胞百分率的影響

本研究使用CD45+LY6G 標(biāo)記中性粒細胞，采用流式細胞術(shù)檢測各組小鼠不同時點BALF 中性粒細胞百分率的變化。如圖1 所示，在12、24 及36 h，HSF1?/?+LPS 組小鼠BALF中性粒細胞比例均高于HSF1+/++LPS 組小鼠（P<0.01），24 h 時BALF 中性粒細胞含量最高，這與炎癥狀態(tài)下經(jīng)典炎癥細胞遷移的過程相符。以上結(jié)果表明，HSF1 能減輕LPS 所致的ALI肺泡中性粒細胞的浸潤。

2 HSF1對LPS所致ALI小鼠肺組織中性粒細胞浸潤的影響

采用免疫熒光方法分別檢測小鼠肺組織中性粒細胞數(shù)目，結(jié)果見圖2。12 h、24 h 時和36 h 時，與HSF1+/++LPS 組相比，HSF1?/?+LPS 組肺組織中的中性粒細胞浸潤更多（紅色箭頭），表明HSF1 能減輕LPS所致急性肺損傷小鼠肺組織中的炎癥細胞的浸潤。

3 HSF1 對LPS 所致ALI 小鼠血清、肺組織和BALF中趨化因子XCL-1濃度的影響

3.1 血清中XCL-1 的濃度LPS 處理12、24 和36 h后，HSF1?/?+LPS 組小鼠血清中XCL-1 水平顯著高于HSF1+/++LPS 組（P<0.05），且在24 h 達到高峰（P<0.01），見圖3。以上結(jié)果表明，HSF1 可能通過抑制血清中XCL-1 的表達水平來抑制中性粒細胞浸潤，從而發(fā)揮保護作用。

3.2 肺組織中XCL-1 的濃度LPS 處理12、24 和36 h 后，HSF1?/?+LPS 組小鼠肺組織中XCL-1 水平顯著高于HSF1+/++LPS 組（P<0.05），且在24 h 達到高峰（P<0.01），這與血清的結(jié)果相一致，見圖4。以上結(jié)果表明，HSF1 可能通過抑制肺組織中XCL-1 的表達水平來抑制中性粒細胞浸潤，從而發(fā)揮保護作用。

3.3 BALF 中XCL-1 的濃度與HSF1+/++LPS 組相比，12 和24 h 時，HSF1?/?+LPS 組BALF 的XCL-1 水平顯著高于HSF1+/++LPS 組（P<0.01），且在24 h 達到高峰；36 h 時，HSF1?/?+LPS 組BALF 的XCL-1 水平略高于HSF1+/++LPS 組（P<0.05），見圖5。以上結(jié)果表明，HSF1 可能通過抑制肺泡中XCL-1 的表達水平來抑制中性粒細胞浸潤，從而發(fā)揮保護作用。

4 HSF1對LPS 所致ALI小鼠BALF 中性粒細胞表面XCR-1表達的影響

LPS處理12 h后，HSF1?/?+LPS組小鼠BALF 的中性粒細胞表面XCR-1 比例高于HSF1+/++LPS 組（P<0.01）；24 h 時，HSF1?/?+LPS 組 和HSF1+/++LPS 組BALF 的中性粒細胞表面XCR-1 均有增加，HSF1?/?+LPS 組小鼠BALF 的中性粒細胞表面XCR-1 比例仍高于HSF1+/++LPS 組（P<0.01）；36 h 時，HSF1?/?+LPS組小鼠BALF 的中性粒細胞表面XCR-1 水平仍高于HSF1+/++LPS 組，見圖6。以上結(jié)果表明，在LPS 所致的ALI模型中，HSF1能通過抑制中性粒細胞上XCR-1表達而發(fā)揮對中性粒細胞浸潤的抑制作用。

討 論

Figure 1.The effect of HSF1 on percentage of neutrophils in BALF of ALI mice induced by LPS.Mean±SD. n=6.##P<0.01 vs HSF1+/++NS group；**P<0.01 vs HSF1+/++LPS group.圖1 HSF1對LPS所致ALI小鼠BALF中性粒細胞百分率變化的影響

肺組織因為獨特的解剖結(jié)構(gòu)非常容易遭受外界有害物質(zhì)的損傷，不少研究者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肺臟受到LPS等刺激時，大量中性粒細胞會從血管游出聚集到肺部，并釋放大量的細胞因子，引起體內(nèi)促炎和抗炎系統(tǒng)失衡，從而進一步激活炎癥細胞，導(dǎo)致ALI/ARDS的發(fā)生［17］。HSF1是必不可少的熱休克基因，HSF1?/?動物的細胞在遭受高溫等刺激時，相比于野生型動物更容易凋亡，這證明了HSF1能夠提高細胞的存活率［18-20］。HSF1能夠提高存活率這一現(xiàn)象在很多動物中也有證實。 本課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，HSF1?/?小鼠對LPS 的敏感性顯著增強，并且其生存率顯著降低，且HSF1 能夠有效減少內(nèi)毒素血癥中TNF-α、IL-1β 和IL-6 等炎癥因子的表達水平，表明HSF1 對LPS 所導(dǎo)致的內(nèi)毒素血癥具有明顯的抑制作用［21］。本課題前期采用HSF1?/?小鼠經(jīng)氣管內(nèi)滴注LPS 制備了小鼠ALI 模型，并通過檢測肺濕/干重、肺組織病理學(xué)改變、BALF 蛋白定量、BALF 和肺組織中VEGF 的含量等確認小鼠ALI 模型建立成功，且發(fā)現(xiàn)HSF1 明顯減輕LPS 所致的ALI，但其作用機制仍不明確［12］。因此，本研究中我們繼續(xù)使用上述小鼠ALI模型，采用流式細胞術(shù)檢測了LPS 處理12、24 和36 h后各組小鼠BALF中性粒細胞含量，并采用免疫熒光法檢測了不同組別小鼠肺組織中性粒細胞含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HSF1?/?+LPS 組的中性粒細胞含量均高于HSF1+/++LPS 組，說明在LPS 誘導(dǎo)的ALI 時，HSF1 能夠抑制中性粒細胞在肺部的浸潤。

Figure 2.The effect of HSF1 on infiltration of neutrophils in the lung tissues of ALI mice induced by LPS（immunoflurorescence，×40）.圖2 HSF1對LPS所致ALI小鼠肺組織中性粒細胞浸潤的影響

Figure 3.The effect of HSF1 on the serum concentration of XCL-1 in ALI mice induced by LPS.Mean±SD. n=6.#P<0.05，##P<0.01 vs HSF1+/++NS group；*P<0.05，**P<0.01 vs HSF1+/++LPS group.圖3 HSF1對LPS所致ALI小鼠血清中XCL-1濃度的影響

Figure 4.The effect of HSF1 on the concentration of XCL-1 in the lung tissues of ALI mice induced by LPS.Mean±SD. n=6.#P<0.05，##P<0.01 vs HSF1+/++NS group；*P<0.05，**P<0.01 vs HSF1+/++LPS group.圖4 HSF1對LPS所致ALI小鼠肺組織中XCL-1濃度的影響

Figure 5.The effect of HSF1 on the concentration of XCL-1 in the BALF of ALI mice induced by LPS.Mean±SD.n=6.#P<0.05，##P<0.01 vs HSF1+/++NS group；*P<0.05，**P<0.01 vs HSF1+/++LPS group.圖5 HSF1對LPS所致ALI小鼠BALF中XCL-1濃度的影響

HSF1 究竟通過何種分子機制抑制中性粒細胞在ALI 小鼠肺部的浸潤呢？在肺部炎癥時，最開始中性粒細胞趨化到肺血管的能力比較弱，隨著中性粒細胞和肺血管內(nèi)皮細胞變得活化，并釋放趨化分子和黏附分子，中性粒細胞進入肺循環(huán)的能力變強，并且能夠穿過肺血管內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞和肺間質(zhì)滲出到肺泡腔中。研究證明，XCL-1 是其中非常關(guān)鍵的趨化分子［22］。XCL1 是C 族趨化因子家族的一員。XCR-1 是其特異性受體，主要表達在在中性粒細胞、T 細胞、NK 細胞和B 細胞表面。XCL-1 通過與XCR-1 相互作用，產(chǎn)生趨化效應(yīng)［23］。在本科室前期工作中，采用含有384 個炎癥因子基因的微陣列，利用HSF1?/?和HSF1+/+小鼠制備了內(nèi)毒素血癥模型，采用該模型小鼠的肺組織，篩選出了HSF1 調(diào)控的相關(guān)炎癥基因，發(fā)現(xiàn)HSF1 可能抑制XCR-1 的表達［24］。進一步生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在XCR-1轉(zhuǎn)錄起始位點上游，存在HSF1 結(jié)合位點；通過進一步生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)XCL-1的啟動子區(qū)也含有HSF1 的結(jié)合位點。因此，我們推測HSF1 對LPS 所致ALI 小鼠肺組織中性粒細胞浸潤的抑制作用可能是通過調(diào)節(jié)XCL-1/XCR-1 這一對趨化因子配體/受體的表達來實現(xiàn)的。據(jù)此，我們通過ELISA 檢測了小鼠血清、肺組織及BALF 中XCL-1 的表達水平，并采用流式細胞術(shù)檢測了BALF 中性粒細胞表面XCR-1 的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠敲除HSF1后，在LPS所致的ALI模型中，血清、肺組織和BALF中的XCL-1水平以及BALF 中性粒細胞表面的XCR-1 水平均高于野生型小鼠。因此，HSF1 可能是通過抑制XCL-1及中性粒細胞表面XCR-1 的表達，從而發(fā)揮對中性粒細胞浸潤的抑制作用。但HSF1 是否是在轉(zhuǎn)錄水平直接調(diào)節(jié)XCR-1的表達尚需要進一步研究。

Figure 6.The effect of HSF1 on the expression of XCR-1 on the nuetrophils in BALF of ALI mice induced by LPS.Mean±SD. n=6.#P<0.05，##P<0.01 vs HSF1+/++NS group；*P<0.05，**P<0.01 vs HSF1+/++LPS group.圖6 HSF1對LPS所致ALI小鼠BALF的中性粒細胞表面XCR-1表達的影響

總之，本研究證明了HSF1 通過抑制XCL-1/XCR-1 這一對趨化因子配體/受體的表達，抑制了中性粒細胞在肺組織的遷移和浸潤，從而減輕了LPS所致的肺損傷，這對進一步揭示ALI/ARDS 的潛在防治靶點有著重要意義。