朱春雪 何嫣婕 何美娟 劉 晴 劉承雨 王一成 黃漢鵬

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇鎮(zhèn)江 212000

病毒感染細(xì)胞后，Toll 樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）特異性識(shí)別病毒雙鏈核糖核酸，激發(fā)炎癥因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等轉(zhuǎn)錄，出現(xiàn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[1-3]；誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致相關(guān)基因如肌醇需求酶-1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）、拼接型X 盒子結(jié)合蛋白1（spliced X-box binding protein 1，xBP1s）、C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）等增加，引起或加重炎癥、細(xì)胞自噬及凋亡[4-8]。

中藥苦金片清熱利咽、消腫止痛，但抗病毒作用鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用病毒類(lèi)似物Poly（I∶C）感染巨噬細(xì)胞體外模擬活病毒感染[9-10]，觀察苦金片對(duì)感染過(guò)程中炎癥因子、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因及抗病毒因子如干擾素調(diào)節(jié)因子-3（interferon regulatory factor-3，IRF-3）、β 干擾素（interferon-β，IFN-β）、干擾素刺激基因15（interferon stimulated gene 15，ISG15）、寡腺苷酸合成酶1（oligoadenylate synthetase 1，OAS1）、黏病毒耐藥蛋白1（myxovirus resistance 1，MX1）的影響。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）（上海酶研科技有限公司）；Poly（I∶C）（APExBIO 公司，貨號(hào)：B5551313 377BD）；高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco 公司，貨號(hào)：8120281、42F335）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，批號(hào)：AJG2280A、AI80465A）；BCA 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：No.090120201103）；GAPDH、caspase-3、IL-6、TNF-α、TGF-β、xBP1s 兔抗鼠多克隆抗體（CST公司，貨號(hào)：#9662、#2118、#12912、#11948、#3711、#40435）；CCK-8 試劑盒（東仁化學(xué)研究所，批號(hào)：FH783）；苦金片（上海醫(yī)藥集團(tuán)青島國(guó)風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：151003）。

1.2 研究方法

1.2.1 溶液制備 苦金片溶液：適量苦金片置磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered solution，PBS），59℃水浴5 h，室溫下，以離心半徑20 cm，3500 r/min 離心10 min，過(guò)濾，配成100 mg/ml 溶液，4℃保存。

Poly（I∶C）溶液：適量Poly（I∶C）溶于PBS 制成10 mg/ml 溶液，-20℃保存。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM 中，37℃、5%CO2孵箱（Thermo 公司，150i 型）培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8 法檢測(cè)RAW264.7 細(xì)胞活力 RAW264.7細(xì)胞按104個(gè)細(xì)胞/孔密度接種于96 孔板。為觀察濃度對(duì)細(xì)胞的影響，設(shè)立苦金片不同濃度組（1、2、5 mg/ml）、空白組、對(duì)照組（加入等量培養(yǎng)基）、Poly（I∶C）（20 μg/ml）組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5 次，每100 μl 培養(yǎng)基加10 μl CCK-8孵育2 h，酶標(biāo)儀（Thermo 公司，fc 型）檢測(cè)450 nm 光密度（optical density，OD）值，細(xì)胞活性（%）=（給藥組OD 值-空白組OD 值）/（對(duì)照組OD 值-空白組OD 值）×100%。

1.2.4 細(xì)胞分組 RAW264.7 細(xì)胞接種于6 孔板并分為三組：對(duì)照組、Poly（I∶C）組與苦金片組（1 mg/ml），實(shí)驗(yàn)重復(fù)5 次。Poly（I∶C）組予Poly（I∶C）（20 μg/mL）刺激12 h，苦金片組在Poly（I∶C）刺激后，吸去上清，洗滌后予苦金片（1 mg/ml）刺激6 h，對(duì)照組不予特殊處理。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) Trizol 試劑提取對(duì)照組、Poly（I∶C）組、苦金片組（1 mg/ml）細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，30 s，1 個(gè)循環(huán)；95℃，5 s，40 個(gè)循環(huán)。引物序列（上海生工生物科技有限公司）見(jiàn)表1。將值標(biāo)準(zhǔn)化為T(mén)ublin 表達(dá)，結(jié)果用2-ΔΔCt表示。

表1 引物序列

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法 對(duì)照組、Poly（I∶C）組、苦金片組（1 mg/ml）細(xì)胞充分裂解后離心，收集總蛋白，加熱變性后取20 μg 蛋白上樣，凝膠電泳（80 V 30 min，110 V 1 h）后濕轉(zhuǎn)到PVDF 膜（300 mA，2 h），室溫封閉1.5 h，分別用GAPDH 抗體、IL-6 抗體、TNF-α 抗體、caspase-3 抗體、xBP1s 抗體1∶1000 稀釋后4℃搖床孵育過(guò)夜（GAPDH 為內(nèi)參）。清洗后與HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗（1∶100）室溫孵育1.5 h，清洗曝光，Image J軟件分析灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 對(duì)結(jié)果作圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦金片對(duì)Poly（I∶C）刺激下巨噬細(xì)胞活力的影響

Poly（I∶C）組細(xì)胞活力低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；苦金片不同濃度組高于Poly（I∶C）組，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）?？嘟鹌煌瑵舛冉M比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），后續(xù)實(shí)驗(yàn)中苦金片濃度選擇1 mg/ml。見(jiàn)圖1。

圖1 苦金片對(duì)Poly（I∶C）刺激下巨噬細(xì)胞活力的影響（n=5）

2.2 苦金片對(duì)Poly（I∶C）刺激下相關(guān)因子mRNA 表達(dá)的影響

Poly（I∶C）組TLR3、IRF3、IFN-β、ISG15、OAS1、MX1，IL-6、TNF-α、TGF-β，IRE1α，xBP1s，CHOP mRNA表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P <0.01）；與Poly（I∶C）組比較，苦金片組TLR3、IRF3、IFNβ、ISG15、OAS1、MX1 mRNA 表達(dá)上調(diào)，IL-6、TNF-α、TGF-β、IRE1α、xBP1s、CHOP mRNA 表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P <0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 苦金片對(duì)Poly（I∶C）刺激下相關(guān)因子mRNA 表達(dá)的影響（n=5）

2.3 苦金片對(duì)Poly（I∶C）刺激下相關(guān)因子蛋白表達(dá)影響

Poly（I∶C）組IL-6、TNF-α、xBP1s、caspase-3 蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；苦金片組IL-6、TNF-α、xBP1s、caspase-3 蛋白表達(dá)低于Poly（I∶C）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 苦金片對(duì)Poly（I∶C）刺激下相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響（n=5）

3 討論

呼吸道病毒可引起病毒性呼吸道疾病，臨床發(fā)病率高[11-12]，探索有效的治療臨床意義重大。中藥作為我國(guó)傳統(tǒng)治療藥物，其中也存在多種抗病毒藥物[13-16]。苦金片由苦地丁、金銀花、黃芩、牛蒡子、桔梗、玄參、甘草組成，其中苦地丁生物堿可抗炎[17]；金銀花中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸-A 等可拮抗流感病毒[18-19]；黃芩苷[20]、牛蒡子苷、牛蒡子苷元[21]等均有抗病毒功效。因此，筆者以Poly（I∶C）體外刺激巨噬細(xì)胞模擬病毒感染過(guò)程，探索苦金片的抗病毒作用。

TLR3 與配體結(jié)合活化會(huì)進(jìn)一步激活I(lǐng)RF3、IFN-β等表達(dá)，誘導(dǎo)天然抗病毒反應(yīng)[22-23]。本實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)Poly（I∶C）孵育的巨噬細(xì)胞TLR3、IRF3、IFN-β、ISG15、OAS1、Mx1 mRNA 表達(dá)升高，表明Poly（I∶C）可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)；苦金片組TLR3、IRF3、IFN-β、ISG15、OAS1、Mx1 mRNA 高于Poly（I∶C）組，提示藥物增強(qiáng)了細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。

另一方面，病毒感染后建立的天然抗病毒信號(hào)也能誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子表達(dá)，炎癥因子釋放過(guò)多會(huì)加速細(xì)胞溶解或凋亡[24]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，Poly（I∶C）處理后IL-6、TNF-α、TGF-β、caspase-3 表達(dá)增加，表明Poly（I∶C）誘導(dǎo)了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，加速了巨噬細(xì)胞凋亡，苦金片組IL-6、TNF-α、xBP1s、caspase-3 蛋白表達(dá)低于Poly（I∶C）組，提示苦金片可在一定程度逆轉(zhuǎn)上述作用。

病毒感染后，大量病毒蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成中使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)，一旦超過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷能力，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路便被激活[25]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，Poly（I∶C）處理后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因IRE1α、xBP1s、CHOP mRNA 表達(dá)升高，與Poly（I∶C）組比較，苦金片組IRE1α、xBP1s、CHOP mRNA 表達(dá)下調(diào)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被過(guò)度激活，苦金片可明顯減輕了這種應(yīng)激狀態(tài)。

綜上，苦金片通過(guò)上調(diào)抗病毒基因表達(dá)、抑制炎癥介質(zhì)釋放和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過(guò)度應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率，提示苦金片具有抗病毒療效，為其臨床應(yīng)用提供新的依據(jù)。