吳泉霖，馬福軍，李肖亮

結(jié)腸癌目前主要治療方案為根治性手術(shù)結(jié)合輔助性放化療，但有20%～50%的患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，5年生存率僅57%，故研究結(jié)腸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移危險因素和分子機制對改善預(yù)后有重要意義[1-3]。特定富含AT堿基DNA序列結(jié)合蛋白2(SATB2)為核基質(zhì)相關(guān)蛋白，對基因重組和染色質(zhì)重構(gòu)具有調(diào)節(jié)作用，近年研究表明其與多種惡性腫瘤發(fā)生和進展存在密切聯(lián)系[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)可調(diào)節(jié)哺乳動物體內(nèi)信號傳導(dǎo)，對腫瘤細胞凋亡具有抑制作用，與結(jié)腸癌發(fā)病密切相關(guān)，且是導(dǎo)致化療耐藥的重要原因，因此可能對結(jié)腸癌預(yù)后造成影響[5]。同源盒基因轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)為首個被發(fā)現(xiàn)參與實體腫瘤發(fā)生和進展的長鏈非編碼RNA，文獻報道其與腫瘤細胞侵襲能力密切相關(guān)并可導(dǎo)致患者預(yù)后不良[6]。本研究以結(jié)腸癌患者為樣本分析癌組織SATB2、SIRT1和HOTAIR表達水平及其與預(yù)后的相關(guān)性，為尋找結(jié)腸癌分子標(biāo)志物或治療靶點提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月—2016年6月我院診治符合納入及排除標(biāo)準(zhǔn)的102例結(jié)腸癌，其中男58例，女44例；年齡31～87(58.16±9.45)歲。腫瘤直徑1.2～8.5(3.94±1.27)cm；病理類型：管狀腺癌79例，黏液腺癌23例；分化程度：高分化14例，中分化37例，低分化43例，未分化8例；美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)臨床分期[7]：Ⅰ期20例，Ⅱ期29例，Ⅲ期40例，Ⅳ期13例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2015版)》[8]且經(jīng)病理活檢明確診斷；②年齡≥18歲；③入院前未接受手術(shù)、放化療或靶向治療者；④基礎(chǔ)健康狀況良好且預(yù)計生存期>6個月；⑤患者及家屬完全知曉本研究內(nèi)容并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者；②合并其他可對患者預(yù)后造成影響的重大疾病者；③臨床資料或隨訪結(jié)果欠缺者。

1.2研究方法 采集所有患者性別、年齡、既往病史和隨訪等資料，根據(jù)隨訪結(jié)果將患者分為死亡組和存活組，經(jīng)手術(shù)或腸鏡獲取2組腫瘤組織并檢測SATB2、SIRT1及HOTAIR表達水平，分析SATB2、SIRT1和HOTAIR表達與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.3治療和隨訪 所有患者完善相關(guān)檢查后根據(jù)AJCC分期、基礎(chǔ)健康狀態(tài)和自身意愿選擇手術(shù)、放化療或靶向治療。采用電話、微信或門診等方式隨訪，隨訪截止時間為2021年6月30日，每3個月隨訪1次，記錄患者預(yù)后及總體生存期(OS)，OS為從治療開始至因該疾病導(dǎo)致患者死亡的時間。

1.4SATB2和SIRT1表達水平檢測 取部分結(jié)腸癌組織經(jīng)常規(guī)固定、脫水和石蠟包埋后采用Finesse 325型切片機(德國Thermo Shandon公司)制作4 μm切片，72 ℃烘烤4 h后高壓抗原修復(fù)，蒸餾水沖洗并以過氧化氫封閉6 min，再采用PBS液(北京鼎國生物技術(shù)公司)沖洗。向切片滴加SATB2和SIRT1一抗(美國Santa Cruz公司)，4 ℃孵育過夜后以PBS液沖洗3次，加入二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)并室溫孵育60 min，然后再采用PBS液沖洗3次，DAB顯色劑(武漢博士德生物工程公司)染色和蘇木素(武漢博士德生物工程公司)復(fù)染，蒸餾水沖洗3次后常規(guī)脫水、透明和封片，完成后光鏡下觀察SATB2和SIRT1表達水平。SATB2定位于胞核，SIRT1定位于胞質(zhì)和胞核，觀察10個高倍鏡視野下染色細胞占比和染色強度，并采用半定量法計算。陽性細胞百分比<5%為0分、5%～25%為1分、25%～50%為2分、50%～75%為3分、≥75%為4分，染色強度無色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分，兩部分得分相乘為總分，以總分0～2分為陰性，≥3分為陽性。陽性對照為美國Santa Cruz公司提供的陽性切片，陰性對照為PBS液代替一抗。

1.5HOTAIR表達水平檢測 將結(jié)腸癌組織研碎后加入Trizol試劑(日本寶生物工程株式會社)并在4 ℃環(huán)境以12 000 r/min離心15 min，取上清液置于新離心管中，加入異丙醇后靜置8 min，然后再于4 ℃環(huán)境以12 000 r/min離心10 min，去除上清液后加入75%乙醇溶液1 ml，混勻后于4 ℃環(huán)境以7500 r/min離心5 min，去除上清液并吸取剩余乙醇，加入無DEPC水溶液(天津艾勒科技有限公司)待檢。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并采用熒光定量PCR技術(shù)檢測HOTAIR表達量，反應(yīng)體系共10 μl，包括Premix Taq 5 μl，上下游引物各0.2 μl，模板2 μl，dNTP 2.4 μl和ROX DyeⅡ 0.2 μl，引物由上海生工生物有限公司設(shè)計，上游序列為5'-GCCTGAACTTCCTCCTGCTATT-3'，下游序列為5'-ACACAAAGTGCATACCTACCCA-3'。反應(yīng)條件為95 ℃/2 min，95 ℃/15 s，58 ℃/30 s，共循環(huán)40次，反應(yīng)完成后采用2%瓊脂糖凝膠電泳并繪制PCR產(chǎn)物熔解曲線，以GAPDH為內(nèi)部參照，采用2-ΔΔCt法計算HOTAIR相對表達量。

2 結(jié)果

2.1不同預(yù)后結(jié)腸癌患者基本資料比較 本研究中位隨訪時間為72個月，102例隨訪期間死亡67例，病死率為65.69%，中位OS為63個月。死亡組腫瘤最大徑和AJCC分期Ⅲ+Ⅳ期患者占比均大于存活組，腫瘤分化程度低于存活組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 不同預(yù)后結(jié)腸癌患者基本資料比較[例(%)]

2.2不同預(yù)后結(jié)腸癌患者SATB2、SIRT1及HOTAIR表達情況比較 死亡組SATB2陽性率低于存活組，SIRT1陽性率和HOTAIR mRNA相對表達量高于存活組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 不同預(yù)后結(jié)腸癌患者SATB2、SIRT1及HOTAIR表達情況比較

2.3結(jié)腸癌患者預(yù)后多因素Cox回歸分析 多因素Cox回歸分析顯示，腫瘤低分化、AJCC分期Ⅲ+Ⅳ期、SIRT1陽性和HOTAIR mRNA為結(jié)腸癌患者死亡的危險因素，SATB2陽性為結(jié)腸癌患者死亡的保護因素(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表3 結(jié)腸癌患者預(yù)后多因素Cox回歸分析

2.4結(jié)腸癌患者生存情況分析 SATB2陽性患者中位OS(69個月)長于SATB2陰性患者(54個月)，SIRT1陽性患者中位OS(57個月)短于SIRT1陰性患者(78個月)，HOTAIR mRNA≥47.85患者中位OS(57個月)短于HOTAIR mRNA<47.85患者(78個月)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見圖1。

圖1 結(jié)腸癌患者生存曲線

3 討論

結(jié)直腸癌是胃腸道常見惡性腫瘤[9-11]，好發(fā)于40～50歲男性，據(jù)WHO報道顯示2018年新增和死亡患者數(shù)量分別約為180萬人和88萬人，發(fā)病率居男性惡性腫瘤第3位，居女性惡性腫瘤第2位[12]。結(jié)腸癌發(fā)病受基因、環(huán)境和飲食習(xí)慣等多種因素影響，近年來我國居民因生活水平逐漸改善和飲食結(jié)構(gòu)變化，使得結(jié)腸癌發(fā)病率明顯升高[13-16]。

目前結(jié)腸癌患者整體預(yù)后仍不樂觀。本研究隨訪顯示，102例中位OS為63個月，與李榮振等[17]報道結(jié)果相近。同時本研究分析顯示，死亡組腫瘤最大徑和AJCC分期Ⅲ+Ⅳ期患者占比大于存活組，腫瘤分化程度明顯低于存活組，提示體積增大、臨床分期增加及分化程度降低均可能導(dǎo)致預(yù)后不良。MARKS等[18]分析認為，雖然近年來分子檢測在結(jié)直腸癌中的應(yīng)用逐漸增多，但是臨床和病理資料仍是治療方案選擇和預(yù)后判斷的主要依據(jù)。本研究多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤低分化和AJCC分期Ⅲ+Ⅳ期為結(jié)腸癌患者死亡的危險因素。

隨著醫(yī)學(xué)水平快速發(fā)展和對結(jié)腸癌認識的不斷加深，發(fā)現(xiàn)SATB2、SIRT1和HOTAIR與結(jié)腸癌存在密切聯(lián)系。SATB2包括733個氨基酸，可與富含AT的DNA序列特異性結(jié)合并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和重組，且其作為抑癌基因可參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞免疫、轉(zhuǎn)移和凋亡等生物學(xué)行為，表達缺失可導(dǎo)致結(jié)腸癌分化程度降低[19]。本研究結(jié)果顯示，死亡組SATB2陽性率低于存活組，多因素Cox回歸分析顯示SATB2為結(jié)腸癌患者死亡的保護因素，原因可能與SATB2陽性表達有利于促進腫瘤細胞分化并降低轉(zhuǎn)移發(fā)生風(fēng)險密切相關(guān)。SIMONS等[20]認為SIRT1參與了結(jié)腸癌的發(fā)展過程，其基因突變可能影響結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險。本研究死亡組SIRT1陽性率明顯高于存活組，且多因素Cox回歸分析顯示SIRT1陽性為結(jié)腸癌患者死亡的危險因素，分析原因為SIRT1可通過磷酸化激活腫瘤細胞JNK、ERK和AKT等多種信號通路并促進細胞增殖，從而導(dǎo)致病情進展和預(yù)后不良。有研究認為長鏈非編碼RNA在腫瘤發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用，其中HOTAIR與結(jié)腸癌細胞LoVo遷移能力密切相關(guān)[21]。本研究結(jié)果顯示，死亡組HOTAIR mRNA相對表達量明顯高于存活組，且多因素Cox回歸分析顯示患者死亡風(fēng)險隨著其表達水平的升高呈上升趨勢。同時本研究采用Log Rank法分析顯示，SATB2陰性、SIRT1陽性和HOTAIR mRNA≥47.85的結(jié)腸癌患者中位OS明顯縮短，提示檢測結(jié)腸癌組織SATB2、SIRT1和HOTAIR表達水平對判斷患者預(yù)后具有一定參考價值。

綜上，結(jié)腸癌組織SATB2、SIRT1和HOTAIR表達均為影響患者預(yù)后的重要因素。