葉美君，杜穎穎，李文萃，陸小磊，劉相真

（中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社杭州茶葉研究所，浙江 杭州 310016）

0 引言

胺菊酯CAS號(hào)為7696-12-0，分子量為331.4，純品為白色結(jié)晶固體，具有除蟲(chóng)菊氣味，在弱酸性條件下穩(wěn)定。在30℃條件下，水中溶解度為4.6 mg/L；在25℃條件下溶于苯、二甲苯、甲苯和丙酮，微溶于甲醇和乙醇。胺菊酯為世界衛(wèi)生組織推薦用于公共衛(wèi)生的主要?dú)⑾x(chóng)劑之一，用于防治蚊、蠅、蟑螂等衛(wèi)生害蟲(chóng)，具有觸殺作用、對(duì)蜚蠊有驅(qū)趕作用，但致死性能差，有復(fù)蘇現(xiàn)象。胺菊酯屬于神經(jīng)毒劑，大量攝入會(huì)致人中毒，引起頭痛、頭昏、惡心嘔吐、雙手顫抖，重者抽搐或驚厥、昏迷、休克[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)胺菊酯的研究主要集中在原藥制備、劑型分析，食品中胺菊酯的檢測(cè)方法研究較少，相關(guān)檢測(cè)方法主要集中在氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜法，液相色譜或液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)胺菊酯相關(guān)報(bào)道較少[3-5]。

在茶園種植過(guò)程中尚未報(bào)道胺菊酯作為殺蟲(chóng)劑使用，茶葉中胺菊酯等污染物質(zhì)可能從生產(chǎn)和流通過(guò)程中引入。監(jiān)測(cè)茶葉中胺菊酯殘留水平和排查該類(lèi)物質(zhì)污染源的首要任務(wù)是建立一種快速、靈敏和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。鑒于此，選擇高靈敏度的UPLCMS/MS作為檢測(cè)儀器，采用GCB、PSA、C18和NH2等填料為吸附劑對(duì)茶葉提取液進(jìn)行凈化，降低UPLC-MS/MS檢測(cè)過(guò)程中基質(zhì)干擾，同時(shí)該方法具有準(zhǔn)確、靈敏和通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可為茶葉安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)與評(píng)估提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

UPLC/TSQ Quantum Access MAX超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；分析天平（感量0.000 1 g），瑞士METTLER TOLEDO公司產(chǎn)品；SC-3610型低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；VORTEX-5型旋渦混合器，其林貝爾Kylin-bell產(chǎn)品；HY-5型回旋振蕩器，江蘇省金壇市榮華儀器有限公司產(chǎn)品；CS501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海瑞立科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；MTN-2800D型氮吹濃縮裝置，天津奧特賽恩斯儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試劑與材料

胺菊酯（100.2 μg/mL，1 mL，AccuStandard）；磷酸三苯酯TPP（分析純，含量99%），河北百靈威超精細(xì)材料有限公司提供；乙腈、甲醇和甲酸（色譜純），德國(guó)Merck公司提供；乙酸銨（色譜純），美國(guó)Fluka公司提供；乙腈和甲苯（分析純），華東醫(yī)藥股份有限提供；醋酸（分析純），上海凌峰化學(xué)試劑有限公司提供；無(wú)水醋酸鈉（分析純），溫州吉象化學(xué)股份有限公司提供；無(wú)水硫酸鎂（分析純），上海試四赫維化工有限公司提供；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠PSA（40～60 μm）、十八烷基硅烷鍵合硅膠C18（40～60 μm）、石墨化碳黑GCB（40～120 μm）、50 mL塑料螺紋具塞離心管，上海安譜科學(xué)儀器有限公司提供；0.5，1，5，10 mL刻度移液管，天津市天玻玻璃儀器有限公司提供；2 mL一次性無(wú)菌注射器，華東醫(yī)藥股份有限公司提供；0.22 μm微孔過(guò)濾膜（尼龍），上海迪柯馬分析技術(shù)有限公司提供。茶葉，市售樣品；茶粉，茶葉磨碎樣品，按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8303—2013制備。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.075 0 g TPP于100 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并定容至刻度線，得到750 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用乙腈配制成0.75 mg/L標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

準(zhǔn)確移取1 mL胺菊酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并定容至刻度線，得到10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用乙腈配制成1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，取適量1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)使用溶液和TPP內(nèi)標(biāo)，加入含茶葉基質(zhì)（陰性樣品）的乙腈溶液，配制成2，5，10，50，100 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使用內(nèi)標(biāo)法定量。

1.4 儀器條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相A為水（含5 mmol/L乙酸銨，0.1%（V/V）甲酸），流動(dòng)相B為甲醇（含5 mmol/L乙酸銨，0.1%（V/V）甲酸）；柱溫40℃；進(jìn)樣量4.0 μL；電離模式：電噴霧離子化（ESI），電離源極性：正模式，霧化氣：氮?dú)?，離子噴霧電壓3 500 V，霧化室溫度120℃，離子傳輸管溫度350℃，碰撞氣：氬氣，0.2 MPa，掃描模式：SRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描。

1.5 樣品前處理

（1）提取。稱(chēng)取經(jīng)粉碎的茶葉樣2.0 g于50 mL離心管中，加入10 mL水浸泡30 min，然后加入15 mL乙腈（1%醋酸），6 g無(wú)水硫酸鎂和1.5 g醋酸鈉劇烈振蕩提取1 min，以轉(zhuǎn)速4 200 r/min離心5 min。

（2）凈化。吸取4 mL上清液于內(nèi)含300 mg無(wú)水硫酸鎂，300 mg PSA、200 mg C18和200 mg GCB的15 mL塑料離心管中，渦旋混勻1 min，以轉(zhuǎn)速4 200 r/min離心5 min。準(zhǔn)確移取1 mL上清液于5 mL塑料離心管中，加入66.67 μL TPP內(nèi)標(biāo)，過(guò)0.22 μL微孔濾膜，供UPLC-MS/MS檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化與選擇

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將胺菊酯和TPP的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)入質(zhì)譜儀器直接分析，采用ESI+模式。在MS+MS/MS模式下，選擇信號(hào)強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好的準(zhǔn)分子離子作為母離子進(jìn)行優(yōu)化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)（包括碰撞能量CE、透鏡補(bǔ)償電壓Tube lens等）。

胺菊酯的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 胺菊酯的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)胺菊酯的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用通用型的C18色譜柱作為分離柱，分別選擇乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液，在3%～90%有機(jī)相質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫，考查流動(dòng)相對(duì)胺菊酯檢測(cè)的影響。在正離子模式下，酸性能夠促進(jìn)化合物的離子化，提高化合物的離子化效率和靈敏度，在水相中添加0.1%甲酸時(shí)，胺菊酯的靈敏度高，分離效果滿意。在水相中添加5 mmoL乙酸銨，胺菊酯峰型對(duì)稱(chēng)、信噪比增大、靈敏度提高。

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)選擇乙腈-水（含5 mmol/L乙酸銨，0.1%（V/V）甲酸）溶液體系時(shí)，胺菊酯的色譜分離、保留和靈敏度情況較為理想，穩(wěn)定性較好，但內(nèi)標(biāo)TPP的穩(wěn)定性和靈敏度欠佳。選擇甲醇-水（含5 mmol/L乙酸銨，0.1%（V/V）甲酸）作為流動(dòng)相，內(nèi)標(biāo)TPP的響應(yīng)和穩(wěn)定性顯著提升，但胺菊酯的響應(yīng)相對(duì)乙腈溶液略微下降。在有機(jī)相B中加入一定量的乙酸銨和甲酸，配置成含5 mmol/L乙酸銨和0.1%（V/V）甲酸的甲醇溶液，保證流動(dòng)相中甲酸和乙酸銨的濃度一致，以提高樣品的穩(wěn)定性和重復(fù)性。綜上所述，試驗(yàn)采用水（含5 mmol/L乙酸銨，0.1%（V/V）甲酸）-甲醇（含5 mmol/L乙酸銨，0.1%（V/V）甲酸）作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

梯度洗脫程序見(jiàn)表2，胺菊酯和TPP標(biāo)準(zhǔn)溶液在LC-MS/MS上的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 胺菊酯和TPP標(biāo)準(zhǔn)溶液在LC-MS/MS上的色譜圖

表2 梯度洗脫程序

2.2 前處理方法優(yōu)化

2.2.1 提取方法的選擇

茶葉含水率低，在提取之前加入一定量的水浸泡（非提取劑），基于乙腈良好的提取效率，植物源食品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)大量采用乙腈為提取劑[6-8]。前期試驗(yàn)表明，提取劑中加入1%醋酸可改善胺菊酯在UPLC-MS/MS上的峰型，提高檢測(cè)靈敏度。

提取方式主要有超聲、旋渦、振蕩和勻漿等，根據(jù)前期試驗(yàn)，結(jié)合GB 23200.121《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)植物源性食品中331種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》中7.3種茶葉和香辛料的前處理方法，采用振蕩提取方式。

2.2.2 凈化材料的選擇與優(yōu)化

茶葉中有機(jī)酸、脂肪和磷脂較高，GCB、PSA、C18和NH2等填料去雜質(zhì)效果較優(yōu)，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離和純化，選取GCB、PSA、C18和MgSO4等填料為分散萃?。╠SPE）材料，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究方法，通過(guò)基質(zhì)效應(yīng)和回收率評(píng)價(jià)凈化效果。

選取茶葉胺菊酯陰性樣品，根據(jù)上述1.5樣品前處理制備茶葉空白基質(zhì)，以茶葉空白基質(zhì)為溶劑配置成系列濃度的基質(zhì)加標(biāo)溶液，以胺菊酯與TPP內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值作為縱坐標(biāo)，胺菊酯濃度與TPP內(nèi)標(biāo)物濃度的比值為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線?；|(zhì)效應(yīng)以η表示：η=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率k(s+ck)-溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率k(s)/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率k(s)[9]。

正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)見(jiàn)表3，正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析見(jiàn)表5。

表3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)/mg

表5 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析/mg

由表4可知，GCB，PSA，C18和MgSO4等凈化材料對(duì)胺菊酯的基質(zhì)效應(yīng)顯著，為進(jìn)一步明確GCB，PSA，C18和MgSO4各因素中對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用直觀分析法對(duì)表4試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理。正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理過(guò)程如下：分別對(duì)每次試驗(yàn)各因素的一水平的試驗(yàn)結(jié)果求和，即K1，再對(duì)每次試驗(yàn)各因素的二水平的試驗(yàn)結(jié)果求和，即K2，對(duì)每次試驗(yàn)各因素的三水平的試驗(yàn)結(jié)果求和，即K3，分別求出各因素的極差R（最大值和最小值之間的差值），根據(jù)極差R的大小判斷各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

表4 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)

由表5可知，R(GCB)>R(PSA)>R(C18)>R(MgSO4)，極差越大，所對(duì)應(yīng)的因素越主要，由此可以確定GCB和PSA在凈化過(guò)程中為主要因素，C18和MgSO4在凈化過(guò)程中為次要因素，為尋找最優(yōu)的水平組合，首先對(duì)GCB進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再對(duì)PSA進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

由表5可知，K1(GCB)>K2(GCB)>K3(GCB)，由此可見(jiàn)，GCB含量越低，基質(zhì)效應(yīng)越顯著，為了降低基質(zhì)效應(yīng)，試驗(yàn)提高GCB的含量。

GCB單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)GCB單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表6，GCB對(duì)胺菊酯基質(zhì)效應(yīng)的影響見(jiàn)表7。

表6 GCB單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)/mg

表7 GCB對(duì)胺菊酯基質(zhì)效應(yīng)的影響

由表7可知，GCB含量增加，基質(zhì)效應(yīng)減少，當(dāng)GCB含量繼續(xù)增加，大于300 mg時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)無(wú)顯著變化，由此GCB選定為200 mg。

由表5可知，K1(PSA)=K2(PSA)>K3(PSA)，由此可見(jiàn)，PSA含量增加，基質(zhì)效應(yīng)下降，為了降低基質(zhì)效應(yīng)，試驗(yàn)提高PSA含量。

PSA單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表8，PSA對(duì)胺菊酯基質(zhì)效應(yīng)的影響見(jiàn)表9。

表8 PSA單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)/mg

表9 PSA對(duì)胺菊酯基質(zhì)效應(yīng)的影響

由表9可知，當(dāng)PSA>300 mg，含量繼續(xù)增加，基質(zhì)效應(yīng)無(wú)顯著變化，由此PSA選定為300 mg。

結(jié)合表4、表5、表7和表9數(shù)據(jù)結(jié)果和數(shù)據(jù)分析，分散萃取材料的配比為GCB（200 mg），PSA（300 mg），C18（200 mg），MgSO4（300 mg）。

2.3 方法驗(yàn)證與評(píng)價(jià)

2.3.1 方法線性方程、檢出限和定量限

采用茶葉空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，以胺菊酯與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)譜響應(yīng)峰面積比值（Ri）作為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（由于樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度一致，采用質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)），標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為Y=0.003 630 96X+0.001 422 55，在2～100 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 2。胺菊酯采用茶葉空白基質(zhì)逐級(jí)稀釋?zhuān)?dāng)質(zhì)量濃度稀釋至3.3 μg/L，S/N的值為3，由此確定方法檢出限（LOD）為3.3 μg/kg，以S/N=10計(jì)算最低添加水平（10 μg/kg），以10 μg/kg為添加水平進(jìn)行回收率試驗(yàn)，根據(jù)最低添加水平的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差確定方法定量限（LOQ）為10 μg/kg。

2.3.2 方法準(zhǔn)確度和精密度

分別稱(chēng)取2.0 g胺菊酯茶葉陰性樣品，加入適量標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，配制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平（10.0，20.0，100.0 μg/kg）的加標(biāo)樣品，按照1.5樣品前處理方法進(jìn)行提取與凈化，然后采用UPLC-MS/MS檢測(cè)，每一個(gè)加標(biāo)水平測(cè)定6次。

胺菊酯在茶葉中的加標(biāo)回收率（n=6）見(jiàn)表10。

表10 胺菊酯在茶葉中的加標(biāo)回收率（n=6）

由表10可知，胺菊酯在低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平均有著較好的準(zhǔn)確度與精密度，加標(biāo)回收率為77.11%～105.71%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為6.39%～7.84%。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)30份綠茶、紅茶、青茶、黑茶和白茶樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè)，其中胺菊酯陽(yáng)性樣品1份，殘留量為0.012 mg/kg，檢出率為3.33%，茶葉中胺菊酯的檢出率和殘留量均較低。

3 結(jié)論

以乙腈（1%醋酸）為提取溶劑，振蕩為提取方式，經(jīng)石墨化碳黑、PSA和C18凈化，通過(guò)前處理方法中凈化材料的優(yōu)化，選擇最優(yōu)的凈化材料配比，建立QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)茶葉中胺菊酯的試驗(yàn)方法。該分析方法高效便捷、可操作性強(qiáng)，方法的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度滿足茶葉的日常檢測(cè)要求。