吳春興，王 彬，武亭宇，王博龍

（宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000）

肺心病全稱肺源性心臟?。╬ulmonary heart disease），是臨床常見的心臟病之一。目前多認(rèn)為肺心病是由于某些慢性肺部疾病或肺胸部疾患遷延不愈導(dǎo)致肺部功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變，從而引起肺動(dòng)脈高壓、心功能衰竭等嚴(yán)重事件。雖然該病進(jìn)展緩慢，但發(fā)病率、死亡率較高，嚴(yán)重威脅人類健康。目前西醫(yī)主要采取氧療、控制感染或?qū)ΠY治療心衰等措施，但在疾病發(fā)展后期這些治療手段卻收效甚微［1-2］。

中醫(yī)認(rèn)為，肺心病是由于外邪犯肺、痰瘀阻肺、陽(yáng)虛水泛等多種原因?qū)е路螝獠缓?，氣機(jī)受阻、失于宣降，進(jìn)而遷延不愈致肺、脾、腎等臟器俱虛，基本病機(jī)為氣虛血瘀［3］。中藥在治療肺心病方面不僅能明顯改善患者臨床癥狀，提高療效，且不良反應(yīng)少，值得在臨床推廣［4］。本文通過(guò)對(duì)治療肺心病的中藥復(fù)方進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，以期總結(jié)出中藥治療肺心病的用藥規(guī)律和作用機(jī)制，為該病的臨床治療和實(shí)驗(yàn)研究提供借鑒和參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

所收集的文獻(xiàn)資料全部來(lái)源于中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)等平臺(tái)，以“肺心病”、“肺源性心臟病”等主題詞進(jìn)行檢索，搜索出相關(guān)文獻(xiàn)建立數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

選擇單純采用中藥內(nèi)服或以內(nèi)服為主治療肺心病的臨床研究文獻(xiàn)，包括隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)、個(gè)案報(bào)道等，且要有相應(yīng)的藥物組成；臨床隨機(jī)對(duì)照研究，須經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理表明中藥組成有明顯優(yōu)勢(shì)。剔除動(dòng)物實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)、綜述類文獻(xiàn)、會(huì)議論文等，重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)只計(jì)一次。

1.3 中藥規(guī)范化處理

參考《中藥學(xué)》［5］以及2020 版《中國(guó)藥典》［6］，規(guī)范化處理納入中藥的名稱,如“麥冬”、“麥門冬”統(tǒng)一為“麥冬”；“姜半夏”、“清半夏”、“法半夏”統(tǒng)一為“半夏”；并在此基礎(chǔ)上統(tǒng)計(jì)中藥的歸經(jīng)、功效。

1.4 數(shù)據(jù)錄入與核對(duì)

將符合標(biāo)準(zhǔn)的中藥復(fù)方涉及的中藥逐一錄入Excel 2007 表格，舍去加減方。完成錄入后，再由另一人負(fù)責(zé)錄入數(shù)據(jù)的審核以確保數(shù)據(jù)源的準(zhǔn)確性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用Excel2007 表格相關(guān)功能統(tǒng)計(jì)中藥的使用頻次、功效、歸經(jīng)等信息；運(yùn)用IBM SPSS Modeler18.0 軟件的Aprior 算法進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化展示。本研究設(shè)最低支持度為0.1，最小置信度為0.8，且關(guān)聯(lián)規(guī)則表示為“后項(xiàng)-前項(xiàng)”。

1.6 網(wǎng)絡(luò)藥理分析

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）中按照口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug likeness，DL）≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)篩選關(guān)鍵中藥組合的有效成分；并將這些化合物的潛在靶點(diǎn)上傳至Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）匹配相應(yīng)基因名稱。利用數(shù)據(jù)庫(kù)Genecards（https://www.genecards.org）收集肺心病相關(guān)疾病靶點(diǎn)，通過(guò)兩者比對(duì)映射，獲得關(guān)鍵中藥組合治療肺心病的作用靶點(diǎn)。利用David 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov）進(jìn)行KEGG 通路富集分析，以明確中藥治療肺心病涉及的信號(hào)通路。將富集結(jié)果上傳至微生信平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/）以繪制KEGG 信號(hào)通路氣泡圖和基因-通路弦圖。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果

根據(jù)所設(shè)定的檢索關(guān)鍵詞，初步得到文獻(xiàn)323 篇。甄別篩選后納入符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)69 篇。只錄文獻(xiàn)涉及的基本方，建立中藥治療肺心病數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.2 單味藥用藥頻次

69 首方劑涉及中藥130 味，累計(jì)使用777 次。按頻數(shù)由高到低依次排序，用藥頻數(shù)≥10 次的高頻中藥有26 味，排靠前的中藥依次是：黃芪、丹參、茯苓、甘草、苦杏仁、半夏、葶藶子、赤芍、川芎、五味子，如表1 所示。

表1 肺心病治療高頻中藥（使用頻次≥10）

2.3 高頻中藥功效分類、歸經(jīng)分析

利用Excel 2007 表格的數(shù)據(jù)透視表功能統(tǒng)計(jì)分析高頻中藥（使用頻次≥10）的功效、歸經(jīng)，如同一味中藥有多種歸經(jīng)，則全部統(tǒng)計(jì)在內(nèi)。如圖1～2 所示，化痰止咳平喘藥使用次數(shù)最多（146 頻次），補(bǔ)虛藥（142 頻次）、活血化瘀藥（91 頻次）次之；多數(shù)中藥歸屬肺經(jīng)（296 頻次），脾經(jīng)（203 頻次）、心經(jīng)（202 頻次）次之。

圖1 高頻中藥功效雷達(dá)圖

圖2 高頻中藥歸經(jīng)雷達(dá)圖

2.4 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

關(guān)聯(lián)規(guī)則分析顯示，高頻中藥間共產(chǎn)生了41 項(xiàng)中藥組合。所有中藥組合的提升度均＞1，這說(shuō)明它們均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且藥物組合的提升度越大越好［7］。按照置信度降序排列，前15 位的中藥組合見表2。關(guān)聯(lián)規(guī)則可視化展示如圖3 所示，連線粗細(xì)與關(guān)聯(lián)程度呈正相關(guān)。即中藥之間的連線越粗，它們的關(guān)系越密切?？梢姡S芪與白術(shù)、茯苓、葶藶子、赤芍、川芎等之間的連線較粗，說(shuō)明這些中藥在治療肺心病時(shí)具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。

圖3 高頻中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則可視化展示

表2 藥物之間關(guān)聯(lián)分析（按置信度降序排列）

2.5 基于TCMSP 探討關(guān)鍵中藥組合治療肺心病的作用機(jī)制

根據(jù)前文分析，黃芪、赤芍、葶藶子在治療肺心病時(shí)使用頻次較高，組合間置信度最強(qiáng)；而由3 藥組成的強(qiáng)心栓亦是治療心力衰竭的經(jīng)典名方。因此，定義黃芪、赤芍、葶藶子為治療肺心病的關(guān)鍵中藥組合。

2.5.1 活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中按OB≥30%、DL≥0.18 篩選關(guān)鍵中藥組合涉及的化學(xué)成分，共獲取61 個(gè)化合物，其中黃芪20 個(gè)、赤芍29 個(gè)、葶藶子12 個(gè)。刪除各自無(wú)靶點(diǎn)的成分，共得到56 個(gè)活性成分；對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)831 個(gè)，去重后保留207 個(gè)潛在靶點(diǎn)。利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)收集肺心病的相關(guān)靶點(diǎn)，對(duì)比映射得到關(guān)鍵中藥組合治療肺心病的靶點(diǎn)97 個(gè)，即為黃芪、赤芍、葶藶子治療肺心病的作用靶點(diǎn)。在String 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載作用靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)的TSV 格式，運(yùn)用Cytoscape3.7.2 軟件篩選作用靶點(diǎn)中度值排名靠前的靶點(diǎn)，得分前五名的靶點(diǎn)依次是AKT1（度值=64）、VEGFA（度值=64）、CXCL8（度值=60）、MMP9（度值=58）、TP53（度值=57）。說(shuō)明這些靶點(diǎn)在黃芪、赤芍、葶藶子治療肺心病中發(fā)揮重要作用，見圖4。利用Cytoscape3.7.2 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖5，該網(wǎng)絡(luò)由125 個(gè)節(jié)點(diǎn)和298 條邊組成。經(jīng)Network Analyzer 分析，度值較高的活性成分主要有槲皮素（MOL000098，度值=63）、山柰酚（Kaempferol，度值=37）、7-O-甲基異丙醇胺（7-O-methylisomucronulatol，度值=22）、黃芩素（baicalein，度值=22）等?？梢?，網(wǎng)絡(luò)中的每個(gè)活性化合物都可作用于多個(gè)不同的靶點(diǎn)，這充分體現(xiàn)了中藥在發(fā)揮治療作用時(shí)具有多成分、多靶點(diǎn)的整體性特點(diǎn)。

圖4 作用靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖5 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5.2 KEGG 通路富集分析

將作用靶點(diǎn)導(dǎo)入David 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，根據(jù)P-value＜0.05，KEGG 通路富集結(jié)果氣泡圖，見圖6。節(jié)點(diǎn)越大，表明富集在該信號(hào)通路上的靶基因越多；顏色越紅，代表該信號(hào)通路與肺心病的治療關(guān)系越密切。因此，黃芪、赤芍、葶藶子治療肺心病涉及的通路包括TNF 信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、PI3K-Akt 信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、MAPK 信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、HIF-1 信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）等。關(guān)鍵中藥涉及的通路信息見表3，基因-通路關(guān)聯(lián)弦圖如圖7 所示，一條通路可富集多個(gè)不同基因，一個(gè)基因又同時(shí)出現(xiàn)在不同相關(guān)通路上，這表明黃芪、赤芍、葶藶子是通過(guò)作用于多靶點(diǎn)、多通路治療肺心病。

圖6 KEGG 通路富集分析氣泡圖

圖7 基因-通路關(guān)聯(lián)弦圖

表3 各通路基本信息

3 討論

肺源性心臟病是臨床上較常見的心臟病之一，西醫(yī)認(rèn)為該病多是由于肺部長(zhǎng)期疾患或反復(fù)發(fā)作、遷延不愈累及心臟所致。肺心病屬于中醫(yī)“喘證”、“肺脹”、“痰飲”等范疇［8］，基本病機(jī)為“氣虛”、“淤血”［9-10］。本研究借助數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對(duì)治療肺心病的中藥復(fù)方進(jìn)行了整理分析，以期更好地闡明中藥治療肺心病的用藥規(guī)律及關(guān)鍵中藥組合的治療機(jī)制，服務(wù)臨床。

結(jié)果顯示，使用頻率最高中藥有黃芪、丹參、茯苓、甘草、苦杏仁等。黃芪味甘，歸肺、脾經(jīng)，能補(bǔ)氣健脾、補(bǔ)益肺氣；與紫菀、苦杏仁等祛痰止咳藥配伍可用于肺氣虛弱、痰喘日久者。現(xiàn)代藥理研究表明［11］，黃芪提取物能有效地保護(hù)肺功能。丹參味苦性寒，既能涼血活血，又可活血祛瘀，其應(yīng)用是對(duì)瘀血證在肺心病中長(zhǎng)期存在的辨證施治。茯苓味甘，入脾經(jīng)，善滲泄水濕，使痰無(wú)有所生。甘草主入心、肺、脾經(jīng)，補(bǔ)脾益氣、祛痰止咳；有祛痰、平喘之功，隨證配伍用于多種咳喘，有無(wú)痰均適宜。研究表明［12］，甘草中的甘草次酸和甘草甜素有很好的潤(rùn)肺止咳功效。苦杏仁味苦，入肺經(jīng)，味苦降泄、宣發(fā)肺氣，因此為治療肺心病咳喘之要藥。李露［13］等發(fā)現(xiàn)，杏仁苷能有效延長(zhǎng)哮喘潛伏期，降低炎癥細(xì)胞數(shù)量，抑制舒縮性介質(zhì)和炎性因子。

功效、歸經(jīng)分析表明，治療肺心病的中藥以“化痰止咳平喘藥、補(bǔ)虛藥、活血化瘀藥”為主，這些用藥規(guī)律與中醫(yī)認(rèn)為本病屬“喘證”、“痰飲”、“氣虛”、“淤血”等病機(jī)相一致。目前中醫(yī)辨證治療肺心病也大都是“從痰論治、從虛論治和從瘀論治”這三個(gè)方面著手［14］?！栋Y因脈治》載“病痰飲者，當(dāng)以溫藥和之”，溫中健脾，潤(rùn)肺化濕，則氣化痰行?；抵箍绕酱?，如半夏藥性為溫，是燥濕化痰，溫化寒痰之要藥?，F(xiàn)代藥理研究表明［15］，半夏水煎劑可有效抑制毛果蕓香堿對(duì)腺體的促分泌作用，具有顯著的祛痰鎮(zhèn)咳作用。歸經(jīng)分析結(jié)果顯示，治療肺心病的中藥多歸肺經(jīng)、脾經(jīng)和心經(jīng)。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為［16-17］，肺心病多是由于肺氣本虛或外邪犯肺等使肺失宣肅，發(fā)為喘咳，肺氣虛日久累及脾臟，脾失運(yùn)化，水飲痰濁，心脈瘀阻。因此，肺脾兩臟的協(xié)調(diào)配合是機(jī)體正常代謝的重要保證。故多選用入肺經(jīng)、脾經(jīng)的中藥進(jìn)行配伍，這樣能達(dá)到補(bǔ)肺益脾的功效，也符合肺心病的發(fā)病病機(jī)。可見，臨床治療肺心病的主要手段是化痰止咳、補(bǔ)肺益脾雙管齊下，輔以活血化瘀。故處方用藥時(shí)應(yīng)注重這些中藥的配伍，這樣才能標(biāo)本兼顧，達(dá)到理想的治療目的。關(guān)聯(lián)規(guī)則得出治療肺心病的常用藥物組合有15 項(xiàng)，這些組合中多包含黃芪、茯苓、赤芍、丹參、葶藶子、苦杏仁等中藥，這與高頻藥物網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果相一致。其中支持度最高的是二聯(lián)藥對(duì)是黃芪-人參；置信度最高的黃芪-赤芍-葶藶子。黃芪、人參為歸脾湯的主要組成中藥；《本草便讀》云“葶藶子入肺家氣分…能降氣行痰”，臨床上常用于治療痰涎壅肺、喘咳哮鳴等癥［18］。石衍梅［19］等研究證明，古代方劑中治療心衰常用的藥對(duì)組合為“黃芪-葶藶子”，而心衰又是肺心病的終點(diǎn)事件之一。在中藥復(fù)方規(guī)律分析中，黃芪、赤芍、葶藶子的出現(xiàn)頻率都很高，且該3 味中藥組合的置信度最高，因此以“黃芪-赤芍-葶藶子”為研究對(duì)象。

關(guān)鍵中藥組合活性成分篩選發(fā)現(xiàn)，部分化合物具有重要的藥理作用，如槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、7-O-甲基異丙醇胺（7-omethylisomucronulatol）、黃芩素（baicalein）等。高漢華等［20］發(fā)現(xiàn)，槲皮素不僅可治療大鼠肺動(dòng)脈高壓，還可抑制肺部炎癥，這或?qū)Ψ涡牟〖毙云诳刂聘腥居幸?。山奈酚可上調(diào)磷酸化P65 蛋白的表達(dá)，抑制支氣管肺泡灌注液中白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的釋放，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)［21］，山奈酚的抗炎作用與SIRT1/HMGB1/NF-κB 通路有關(guān)。黃芩素可顯著抑制肺癌A549 細(xì)胞的增殖能力,使肺部細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生固縮、疏散細(xì)胞分布，并能使其形態(tài)變圓、變鈍，起到抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用［22-23］。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析得出重要的作用靶點(diǎn)有AKT1、VEGFA、CXCL8、MMP9、TP53 等。這些靶點(diǎn)都與細(xì)胞的生存凋亡、分化、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等體內(nèi)過(guò)程有關(guān)。如AKT1 是磷酸化蛋白，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存和死亡。研究證實(shí)［24］，肺組織中MMPs（MMP2、MMP9）表達(dá)異常上調(diào)，氣道平滑肌內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解與合成失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致氣道炎癥反應(yīng)。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，TNF 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等多條信號(hào)通路與肺心病關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)［25］，p38MAPK 信號(hào)通路可使大鼠肺組織內(nèi)的HO-1 表達(dá)上調(diào)。在對(duì)缺氧誘導(dǎo)的哮喘小鼠研究中發(fā)現(xiàn)［26］，哮喘發(fā)生時(shí)HIF-1 通路表達(dá)，協(xié)同p-4EBP1、VEGF 等因子共同參與了哮喘的發(fā)病過(guò)程。此外，TNF 可參與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、炎性及細(xì)胞免疫反應(yīng)等，TNF 信號(hào)通路激活后，可致IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 等炎癥因子過(guò)度表達(dá)，加重肺心病患者哮喘癥狀［27］。

本研究通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，系統(tǒng)闡釋了中藥復(fù)方治療肺心病的用藥規(guī)律，初步剖析了關(guān)鍵中藥組合治療肺心病的復(fù)雜機(jī)制，為后續(xù)的臨床遣方用藥和研究提供了科學(xué)的理論基礎(chǔ)，也為更深一步探究中藥治療肺心病的作用機(jī)制提供了數(shù)據(jù)支撐。