范修強，喻家曉，劉 峰，汪招雄，張明輝，高學(xué)軍

（長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434023）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是芽孢桿菌屬的一種，為革蘭氏陽性需氧菌，廣泛分布在土壤及腐敗的枯草等有機物中。該菌無莢膜、有鞭毛，菌落表面粗糙, 呈白色或微黃色。菌體生長速度快, 對營養(yǎng)要求較低，在普通碳源培養(yǎng)基中生長良好，在工業(yè)生產(chǎn)條件下保持較好的活力。在生殖生長期，幼齡B.subtilis能產(chǎn)生大量芽孢，在生長環(huán)境惡劣、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等不適宜的環(huán)境下進入孢子休眠期，形成抗逆、耐高溫、耐酸堿等抗性作用。在環(huán)境適宜生長條件下，芽胞會重新生長為B.subtilis[1]。B.subtilis是一種重要的益生菌種，不含內(nèi)毒素和無致病性，能夠產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，還能夠分泌淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、和纖維素酶等多種內(nèi)源酶，被美國FDA 認(rèn)定為“Generally regarded as safe”（GRAS）級別益生菌種，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、水環(huán)境改善等方面用途很廣[2]。B.subtilis在中國現(xiàn)已作為益生菌被批準(zhǔn)為飼料添加劑。此外，該菌無顯著的密碼子偏愛性，適于作為“細(xì)菌工廠”生產(chǎn)外源重組蛋白。

1945 年首次發(fā)現(xiàn)B.subtilis可以產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)[3]，至今已發(fā)現(xiàn)B.subtilis能產(chǎn)生幾十種不同分子結(jié)構(gòu)的抗生素（antibiotics），包括由核糖體合成的多肽（又稱為Bacteriocins，細(xì)菌素）、非核糖體的多肽合成酶催化形成的多肽以及非肽類化合物（包括聚酮類化合物、磷脂類化合物等）。多肽類抗生素是B.subtilis最主要的抗菌物質(zhì)，細(xì)菌素抗菌譜較窄，主要抑制與自身種屬較密切的細(xì)菌；而非核糖體合成的多肽具有廣譜抑制細(xì)菌和真菌的活性[4]。隨著基因組學(xué)的快速進展，新的細(xì)菌素正在不斷被認(rèn)知，是傳統(tǒng)抗生素的有前途的替代品。與非核糖體合成的代謝產(chǎn)物相比，由核糖體合成的細(xì)菌素更易于經(jīng)基因工程等分子生物學(xué)技術(shù)進行生產(chǎn)。文章主要概述了枯草芽孢桿菌產(chǎn)生細(xì)菌素的研究進展，旨在為細(xì)菌素（基因）的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 枯草芽孢桿菌細(xì)菌素的分類

在革蘭氏陽性菌中，芽孢桿菌屬是一個十分多樣的菌屬，具有200 多個亞種[5]。芽孢桿菌屬產(chǎn)生的細(xì)菌素具有不同的分子大小、序列、結(jié)構(gòu)和抗菌活性，其分類與乳酸菌細(xì)菌素分類不同。芽孢桿菌細(xì)菌素依據(jù)分子結(jié)構(gòu)特征，不同細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素被分為3 類（Ⅰ～Ⅲ）[5-7]。

Ⅰ類細(xì)菌素，又稱為羊毛硫細(xì)菌素（lantibiotics），為小分子陽離子多肽（＜5kDa），具有兩親性結(jié)構(gòu)，作用于生物膜，氨基酸序列中含有特殊的羊毛硫氨酸（lanthionine）和甲基羊毛硫氨酸（methyllanthionine），因而多肽序列內(nèi)部形成多個環(huán)。Ⅰ類細(xì)菌素又分為4個亞類：Ⅰ.1 亞類為單鏈多肽、相對長的形狀，例如subtilin；Ⅰ.2 亞類為單鏈多肽、具有球形或其它的形狀，例如mersacidin；Ⅰ.3 亞類有兩個多肽組成，例如haloduracin（其包括Halα 和Halβ 2 個多肽）；Ⅰ.4 亞類為環(huán)狀多肽，例如Subtilosin A。Ⅱ類細(xì)菌素不含修飾的氨基酸，為線性小分子多肽（0.77k～10kDa）。Ⅱ類細(xì)菌素又分為3 個亞類。Ⅱ.1 亞類細(xì)菌素含有37～48個氨基酸殘基，在多肽鏈N-末端具有保守的YGNGV/L 基序，例如pediocin；Ⅱ.2 亞類細(xì)菌素在多肽鏈N-末端具有保守的DWTXWSXL 基序，例如thuricin H；Ⅱ.3 亞類細(xì)菌素為沒有保守的N-端基序的其它線性多肽，例如cerein 7A。Ⅲ類細(xì)菌素為具有較高分子質(zhì)量（＞30kDa）的沒有修飾的蛋白質(zhì)，對熱不穩(wěn)定，例如megacin A-216。

2 枯草芽孢桿菌細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)特征、作用機理和抑菌譜

多數(shù)B.subtilis細(xì)菌素具有類似的結(jié)構(gòu)特征，因此也具有類似的分子機理和抑菌譜。多數(shù)B.subtilis細(xì)菌素具有多肽鏈N-端具有帶有正電荷的親水基團，能夠結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞膜的磷脂，當(dāng)這一結(jié)合發(fā)生后，疏水的C-端區(qū)域能夠穿透至疏水的細(xì)胞膜內(nèi)部，使細(xì)胞膜形成穿孔而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。Ⅰ.3 亞類由2 種多肽形成，這2 種多肽的基因在同一操縱子中彼此相鄰，2 種多肽以1：1 的比例共同形成一種膜穿透螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)[6]。B.subtilis細(xì)菌素主要抑制革蘭氏陽性菌包括其他芽孢桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等，其抑制機理在于這些革蘭氏陽性菌具有細(xì)菌素能夠結(jié)合的含肽聚糖的細(xì)胞壁，而革蘭氏陰性菌不具有細(xì)菌素能夠結(jié)合的相應(yīng)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[5,8,9]。B.subtilis細(xì)菌素是天然合成的，具有熱穩(wěn)定性、耐強堿、水溶性好、抗菌譜廣、抗菌活性高、不易產(chǎn)生耐藥性等特點[10,11]。

Ⅰ細(xì)菌素subtilin 是B. subtilisATCC 6633 產(chǎn)生的最有效的lantibiotic 細(xì)菌素，研究工作也最全面和深入[5,9]。以下以subtilin 為例，說明枯草芽孢桿菌細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)特征、作用機理和抑菌譜。Subtilin多肽鏈具有56 個氨基酸殘基，結(jié)構(gòu)分為24 個氨基酸殘基的N-端前導(dǎo)肽（leader peptide）序列和32 個氨基酸殘基的C-端核心肽（core peptide）序列2 個部分。前導(dǎo)肽（leader peptide）序列不含Cys 殘基，與細(xì)菌素分泌到細(xì)胞外有關(guān)，在其分泌至細(xì)胞外時被切除。核心肽含有Ser、Thr 和Cys 氨基酸殘基，是lanthionine 和methyllanthionine 硫醚環(huán)形成所需要的。Ser 和Thr 分別脫水生成2,3-二氫丙氨酸（2,3-didehydroalanine，Dha）和2,3-二氫氨基丁酸（2,3-didehydrobutyrine，Dhb），Dha 和Dhb 與Cys 的巰基反應(yīng)，使肽鏈形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖1）[9]。這樣的分子結(jié)構(gòu)使得subtilin 能夠結(jié)合細(xì)胞壁發(fā)揮作用，并且分子結(jié)構(gòu)具有耐熱、耐酸堿等特征。Subtilin 能夠靶向細(xì)胞壁的前體物lipid II 的焦磷酸桿菌烯基抑制肽聚糖（peptidoglycan）的組裝，使敏感細(xì)菌細(xì)胞膜形成穿孔和透性化導(dǎo)致具體死亡[12]。 Subtilin 與nisin類似，對革蘭氏陽性菌具有廣譜的抑制作用，如抑制其他芽孢桿菌屬菌株、乳球菌屬（Lactococcus spp.）和藤黃微球菌（Micrococcus luteus），其對M.luteus菌株NDCO8166 的最小抑制濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）為0.05μg/mL[5,9]。

圖1 Subtilin（核心肽）分子結(jié)構(gòu)示意圖

3 枯草芽孢桿菌細(xì)菌素的基因簇

3.1 枯草芽孢桿菌基因組簡介

早在1997 年，已完成模式菌B.subtilis168 的全基因組DNA 序列測定（登錄號AL009126）[13]。近幾年近百個B.subtilis亞種（或菌株）的全基因組DNA序列測定業(yè)已完成，提供了更多的B.subtilis細(xì)菌素基因簇的信息。例如，Bacillus subtilisMJ01 染色體基因組大小為4108293 bp，其中有4269 個編碼序列[14]。B.subtilisN2-20 基因組大小為4036899bp，含有4163 個編碼序列，在抗菌物質(zhì)合成方面，N2-20含有10 個基因簇、168 菌株含有11 個基因簇[15]。B.subtilisCGMCC 12426 完整基因組序列由1 個環(huán)形的4138265bp 的染色體與1 個74165 bp 的質(zhì)粒組成，共編碼4222 個編碼序列[16]。在B.subtilis基因組中，與抗菌代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因總共達(dá)到基因組的4-5%。近年來通過基因組挖掘和蛋白分離純化，新發(fā)現(xiàn)一些B.subtilis細(xì)菌素，例如：BAC-IB17[17]，mejucin[18]，Subtilin L-Q11[19]等。還有很多新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌素，尚不清楚其具體分子結(jié)構(gòu)、編碼基因或編碼相應(yīng)合成酶的基因以及分子作用機理，這些細(xì)菌素被稱為細(xì)菌素樣抑制物質(zhì)（bacteriocin-like inhibitory substances，BLIS）[6]。尚有很多編碼序列的多肽產(chǎn)物依據(jù)序列特征被預(yù)測為細(xì)菌素，有待實驗證實。

3.2 細(xì)菌素基因簇結(jié)構(gòu)特征

大部分細(xì)菌素的基因和相關(guān)基因以基因簇的形式存在，包括細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因、負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運細(xì)菌素轉(zhuǎn)運的基因、細(xì)菌素自身免疫基因（保護細(xì)菌不被自身的細(xì)菌素所破壞）、細(xì)菌素表達(dá)調(diào)節(jié)基因、細(xì)菌素加工成熟所需酶類基因。細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物為帶有N-端信號肽的未成熟蛋白，在運輸?shù)郊?xì)胞外時信號肽被細(xì)菌產(chǎn)生的酶所切除[8]。

細(xì)菌素的基因簇具有相似的結(jié)構(gòu)，以下以subtilin 基因簇為例進行具體說明[8]。Subtilin 基因簇總長度為12kb，包含10 個基因：spaBTCSIFEGRK。spaS 為細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因，編碼一個56aa 的subtilin前體蛋白；spaB 和spaC 為修飾subtilin 前體蛋白產(chǎn)生lanthionine 和methyllanthionine 環(huán)狀結(jié)構(gòu)的酶類；spaT 編碼ABC 轉(zhuǎn)運蛋白，該蛋白定位于細(xì)胞膜，將subtilin 前體蛋白運輸?shù)桨?；spaI 表達(dá)蛋白形成一個膜結(jié)合的脂肽，通過結(jié)合subtilin 起到自身免疫作用；spaF、spaE 和spaG 表達(dá)蛋白在細(xì)胞膜上形成復(fù)合物，將subtilin 分子從細(xì)胞內(nèi)泵出到細(xì)胞外，同時也起到自身免疫作用；spaK 表達(dá)一個感應(yīng)（sensor）激酶，能夠識別subtilin，進而通過磷酸化激活spaR 表達(dá)的應(yīng)答調(diào)節(jié)因子spaR 蛋白，磷酸化spaR 能夠激活spaBTCSIFEG 基因的3 個啟動子；spaR 啟動子受到σH 轉(zhuǎn)錄因子的正向調(diào)節(jié)，在營養(yǎng)環(huán)境趨緊時σH 促進subtilin 基因簇的表達(dá)[8]。subtilin 基因簇的具體結(jié)構(gòu)示意圖見圖2。

圖2 Subtilin 基因簇的具體結(jié)構(gòu)示意圖

4 研究展望

近年來多種類抗生素在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域被禁用，因而開發(fā)益生菌中不易產(chǎn)生抗性的Bacteriocins 具有重要的實際意義。B.subtilis細(xì)菌素主要抑制革蘭氏陽性菌，在防治相關(guān)消化道細(xì)菌性疾病及食品貯藏中已有很多實際應(yīng)用。通過基因組挖掘鑒定B.subtilis中新的抑制革蘭氏陰性菌的細(xì)菌素或其他肽類代謝產(chǎn)物等具有抗菌性質(zhì)的抗生素，以及利用基因工程手段將抑制革蘭氏陰性菌的Bacteriocins 或來源于昆蟲等的其它抗菌肽轉(zhuǎn)入B.subtilis[20,21]，將進一步拓展B.subtilis的應(yīng)用，如用于抑制大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）等革蘭氏陰性菌引起的腹瀉等疾病[22]。