蔡 婉，葛 文，王 婧，周 華，池 浩

急性心肌梗死(acute myocardial infraction，AMI)是指冠狀動(dòng)脈急性缺血、缺氧導(dǎo)致的心肌壞死，是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)的一種危急重癥。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)使急性心肌梗死的治療取得了巨大進(jìn)步，早期冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建已使AMI的死亡率下降，但有研究表明，PCI術(shù)后1年內(nèi)病死率高達(dá)7%～12%和心力衰竭發(fā)生率為22%[1]，早期血運(yùn)重建后心律失常發(fā)生率較高[2]。心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的機(jī)制包括氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞毒性以及細(xì)胞凋亡等，其中氧化應(yīng)激損傷作為一個(gè)重要因素，氧自由基的大量增加破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致鈣超載和線粒體內(nèi)膜電位的崩潰，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷及死亡[3-4]。

研究表明，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap-1)/核因子相關(guān)因子-2(Nrf2)/抗氧化結(jié)合原件(ARE)信號(hào)通路在抗氧化損傷中有重要作用[5]。Nrf2因子是機(jī)體內(nèi)維持氧化還原反應(yīng)的主要因子之一，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧自由基增加時(shí)，Nrf2從Keap-1上撤離，移位至細(xì)胞核中，與ARE結(jié)合，啟動(dòng)下游抗氧化蛋白、解毒酶等基因表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化的作用[6]。既往研究表明，Nrf2信號(hào)通路的激活可明顯改善心肌梗死后小鼠的心功能，Nrf2基因敲除后，小鼠快速發(fā)展為心力衰竭，死亡率也隨之增加[7-8]。Nrf2因子通過(guò)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)從而達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[7，9]。

中藥復(fù)方鹿紅方具有成分復(fù)雜及作用途徑、靶點(diǎn)多樣等特點(diǎn)，主要用于胸痹心痛、喘證等的治療，臨床研究表明，鹿紅方能夠有效改善心肌梗死后心力衰竭的臨床癥狀，調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈微循環(huán)[10]，鹿紅方預(yù)處理可以提高小鼠抗氧化應(yīng)激水平[11]。本研究基于機(jī)體內(nèi)抗氧化信號(hào)通路，采用大鼠結(jié)扎前降支復(fù)制心肌缺血再灌注損傷模型及H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，鹿紅方藥物干預(yù)，觀察小鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡率、氧化因子以及Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，在動(dòng)物及細(xì)胞水平探討鹿紅方對(duì)心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)Wistar雄性大鼠40只，體質(zhì)量(220±20)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司上海分公司(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK<滬>2017-00，11；使用動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK<滬>2020-0002)；清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量(220±20)g，購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(使用動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK<滬>2014-0008)。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無(wú)菌級(jí)動(dòng)物房，室溫(23±2)℃，濕度(55±5)%，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)自Lonza公司。將保存于液氮中的H9c2細(xì)胞于37 ℃水浴中震蕩融化，吸出細(xì)胞懸液于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，細(xì)胞傳代4～5代后分裝于凍存管中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

1.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：BCBW5177)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20180115)；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20171203)；心肌肌鈣蛋白I(cTnI)試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20170927)；谷胱甘肽(GSH)試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20180803)；丙二醛(MDA)(購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20180406)；超氧化物歧化酶(SOD)(購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20170916)；亞鐵離子(Fe2+)(購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20180129)；RIPA裂解液(購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司，批號(hào)：P0013C)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司，批號(hào)：P0012)；SLC7A11抗體(購(gòu)自美國(guó)Affinity公司，批號(hào)：AF6139)；GPX4抗體(購(gòu)自美國(guó)Affinity公司，批號(hào)：AF0120)；Nrf2抗體(購(gòu)自美國(guó)Affinity公司，批號(hào)：AF9294)。Annexin V-PE/7-AAD 凋亡檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技，批號(hào)：AD10-2)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 小動(dòng)物呼吸機(jī)[世聯(lián)博研(北京)科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：SAR-830/Ap]；低溫高速離心機(jī)(賽默飛生產(chǎn)，型號(hào)：Sorvall Stratos)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular device公司生產(chǎn)，型號(hào)：pectramax M5)；高速組織研磨儀(武漢谷歌生物科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：IS2000MM)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)，型號(hào)：Powerpac Universal)；電子秤(上海耀壯檢測(cè)儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：PL303-IC)；透射電子顯微鏡(日本JEOL公司生產(chǎn)，型號(hào)：JEM-2000Ex)；熒光顯微鏡(奧林巴斯生產(chǎn)，型號(hào)：CX23BG)。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥物

1.4.1 藥物制備 鹿紅方由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院制劑室提供，由鹿角片、紅花、仙靈脾、補(bǔ)骨脂、女貞子、山萸肉、沉香按15∶9∶30∶20∶30∶15∶6 比例配制。鹿紅方水提物制備方法如下：將藥材置于不銹鋼鍋中，加適量水浸泡1 h，置于電磁爐上，先用大火煮沸后，再用小火保持微沸煎煮1 h，18層紗布過(guò)濾，濾液備用；另外再加適量水同法再煎煮1次，18層紗布濾過(guò)，合并兩次藥液，于60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，在60 ℃真空干燥，干膏稱重，再碾為均勻細(xì)粉，制成干燥浸膏粉備用。

1.4.2 鹿紅方含藥血清的制備 將20只清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，灌服鹿紅方藥液，灌胃藥液各中藥含量為：鹿角0.15 g/mL，紅花0.09 g/mL，補(bǔ)骨脂0.2 g/mL，仙靈脾0.3 g/mL，女貞子0.3 g/mL，山萸肉0.15 g/mL，沉香0.06 g/mL，每次20 mL/kg，每日1次，連續(xù)灌胃5 d，在最后1 d灌胃1 h后用水合氯醛麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，進(jìn)行血清分離，56 ℃水浴加熱30 min滅活，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 造模及干預(yù)方法

1.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模 將40只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、缺血再灌注模型組(模型組)、鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組，每組8只。按大鼠和人的換算量灌胃給予對(duì)應(yīng)藥物(低劑量=人給藥劑量/體重×6.25)，中、高劑量分別為低劑量的2倍及4倍。鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組分別給予鹿紅方干燥浸膏粉劑量2.1 g/kg、4.2 g/kg、8.4 g/kg灌胃，對(duì)照組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，持續(xù)灌胃7 d，最后1次給藥后12 h行缺血再灌注造模。結(jié)扎大鼠前降支30 min后復(fù)灌24 h后結(jié)束造模[12]，對(duì)照組除不結(jié)扎前降支外，余操作同前。

1.5.2 H9c2 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型構(gòu)建 將H9c2心肌細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組。鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組加入6%、12%、18%鹿紅方含藥血清預(yù)處理24 h。缺氧/復(fù)氧處理：將模型組、鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液更換為不含胎牛血清的培養(yǎng)液，將細(xì)胞培養(yǎng)板水平放置，滴入2 mL左右的液體石蠟，分別封閉12 h進(jìn)行缺氧處理后，吸除石蠟，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，更換為含有10%胎牛血清培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h即為復(fù)氧。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 大鼠心肌梗死面積測(cè)定 各組大鼠復(fù)灌24 h結(jié)束造模后，取出大鼠心臟，PBS洗凈，置于-80 ℃冰箱30 min后取出，從心尖向心底部方向連續(xù)切成2 mm左右的薄片，將薄片放入2%TTC溶液中，37 ℃預(yù)熱；放入裝有10%甲醛的離心管中過(guò)夜，將心臟切片按照一定順序拍照，Image J軟件分析心肌梗死面積，紅色區(qū)代表非梗死心肌組織，白色區(qū)代表梗死心肌。心肌梗死面積=梗死心肌面積/左心室面積。

1.6.2 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變 各組取出大鼠心臟，預(yù)冷PBS洗凈，4%的多聚甲醛室溫固定24 h后取出，逐級(jí)乙醇脫水，石蠟包埋并切成6 μm左右的切片。切片烘干后脫蠟、乙醇水化處理。以蘇木精染色10 min，1%伊紅染色3 min，經(jīng)二甲苯透明化、樹脂封片，光鏡下觀察心肌形態(tài)。

1.6.3 DNA 斷裂的原位末端標(biāo)記(TUNEL)染色觀察并檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況 取出大鼠心臟，預(yù)冷PBS洗凈，4%的多聚甲醛室溫固定24 h，冰凍切片，經(jīng)二甲苯浸洗，逐級(jí)乙醇脫水，雙氧水-甲醇浸泡，在0.1%TritonX-100、0.1%緩沖液固定5 min，PBS反復(fù)漂洗3次后加入TUNEL液，反應(yīng)1 h，PBS漂洗，逐級(jí)乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明化、樹脂封片，在熒光顯微鏡下觀察各組心肌細(xì)胞凋亡情況。

1.6.4 血清SOD、MDA、GSH和Fe2+水平檢測(cè) 10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血，靜置后，3 500 r/min離心25 min，-80 ℃保存。采用比色法檢測(cè)各組小鼠血清中SOD、MDA、GSH及Fe2+水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)Nrf2和Keap-1蛋白表達(dá)水平 全自動(dòng)蛋白印跡定量分析系統(tǒng)檢測(cè)主動(dòng)脈組織中Nrf2、Keap-1蛋白表達(dá)水平。取大鼠主動(dòng)脈組織，培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，取上清液，使用蛋白提取試劑盒提取蛋白，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離得到的蛋白通過(guò)濕法轉(zhuǎn)移到疏水性的聚偏二氟乙烯膜；用轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白當(dāng)作抗原，使之與第一抗體相結(jié)合后再與熒光標(biāo)記的第二抗體雜交結(jié)合，最后通過(guò)底物顯色以檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。將導(dǎo)出的圖片用Image J軟件進(jìn)行掃描，得到蛋白條帶灰度值，然后計(jì)算出每個(gè)蛋白條帶對(duì)應(yīng)的蛋白表達(dá)量，將所得數(shù)值用GraphPad Prism軟件繪制出不同蛋白表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)圖。

1.6.6 細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)(CCK-8)法檢測(cè)細(xì)胞存活 PBS清洗培養(yǎng)皿，胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于96孔板上，每孔約100 μL，每孔加入10 μL CCK-8溶液。在37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(波長(zhǎng)45 mm)。

1.6.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清液，胰酶消化細(xì)胞，觀察到貼壁細(xì)胞開始脫落時(shí)終止消化。1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。取細(xì)胞懸液195 μL，加入5 μL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑混勻，1 000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞，加入10 μL 水溶性染色劑4 ℃避光下孵育20 min，流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6.8 H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中MDA、SOD、LDH含量檢測(cè) 低速離心取培養(yǎng)液上清液，采用試劑盒法檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH含量，采用比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)MDA含量，采用黃嘌呤氧化法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)SOD含量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積比較 與對(duì)照組比較，模型組心肌梗死面積明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組心肌梗死面積減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組心肌梗死面積減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較(±s)

2.2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變 HE染色光鏡觀察，對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊清晰，細(xì)胞間質(zhì)無(wú)水腫，橫紋肌規(guī)則且清晰。模型組大鼠心肌細(xì)胞腫脹，排列紊亂，部分核膜破裂、消失，可見心肌細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；鹿紅方低劑量組可見心肌細(xì)胞腫脹，排列不規(guī)則，間質(zhì)水腫及細(xì)胞外基質(zhì)增多，并由炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；鹿紅方中、高劑量組心肌細(xì)胞腫脹減輕，排列較規(guī)則，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，細(xì)胞凋亡狀態(tài)明顯改善。詳見圖1。

2.3 各組大鼠血清氧化因子比較 與對(duì)照組比較，模型組血清SOD、GSH含量減低，血清MDA含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組血清SOD、GSH水平升高，血清MDA含量減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組血清SOD、GSH水平升高，血清MDA含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。提示心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞內(nèi)抗氧化作用減少，細(xì)胞修復(fù)功能受損，脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)。鹿紅方低、中、高劑量預(yù)處理能有效減少心肌缺血再灌注損傷心肌組織中MDA生成，提高SOD、GSH含量，減少細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，維持細(xì)胞氧化和抗氧化水平平衡，以鹿紅方中、高劑量預(yù)處理效果最優(yōu)。

表2 各組大鼠血清SOD、MDA、GSH含量比較 (±s)

2.4 各組大鼠心肌凋亡情況比較 TUNEL染色顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高，實(shí)驗(yàn)造模成功。與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低；與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中、高劑量組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低。詳見圖2。提示心肌缺血再灌注導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，鹿紅方低、中、高劑量預(yù)處理均能減少心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，以鹿紅方中、高劑量效果最明顯。

圖2 鹿紅方H/R誘導(dǎo)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.5 各組H9c2心肌細(xì)胞的存活率比較 通過(guò)CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組H9c2心肌細(xì)胞存活率明顯降低，實(shí)驗(yàn)造模成功。與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組H9c2心肌細(xì)胞存活率均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組H9c2心肌細(xì)胞存活率較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。提示缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致H9c2心肌細(xì)胞存活率下降，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組預(yù)處理均能增加缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞存活率，以鹿紅方中、高劑量組最有效。

表3 各組H9c2心肌細(xì)胞存活率比較 (±s)

2.6 各組H9c2心肌細(xì)胞凋亡情況比較 在流式細(xì)胞散點(diǎn)圖上，以膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V)為橫軸，碘化丙淀(PI)為縱軸，左下象限顯示正常細(xì)胞，右上象限是凋亡中晚期和壞死細(xì)胞，即細(xì)胞凋亡情況。通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組H9c2心肌細(xì)胞凋亡明顯升高，顯示造模成功；與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組H9c2心肌細(xì)胞凋亡均有所降低，以鹿紅方中、高劑量組降低最明顯(見圖3)。提示缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致H9c2心肌細(xì)胞凋亡，鹿紅方低、中、高劑量預(yù)處理均能減低缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞凋亡，以鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組最明顯。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組H9c2心肌細(xì)胞凋亡情況

2.7 各組H9c2心肌細(xì)胞中SOD、MDA含量與H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH含量比較 與對(duì)照組比較，模型組H9c2心肌細(xì)胞中MDA含量升高、SOD含量下降，上清液中LDH含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組MDA含量下降、SOD含量升高，上清液中LDH含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組H9c2心肌細(xì)胞中MDA含量下降，SOD含量升高，上清液中LDH含量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示缺氧/復(fù)氧后H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)抗氧化作用減少，細(xì)胞修復(fù)功能受損，脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)，鹿紅方低、中、高劑量預(yù)處理能有效減少細(xì)胞內(nèi)MDA生成，提高SOD含量及降低上清液中LDH含量，減少細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕心肌細(xì)胞膜受損程度，維持細(xì)胞氧化和抗氧化水平平衡，以鹿紅方中、高劑量預(yù)處理效果最優(yōu)。詳見表4。

表4 各組H9c2心肌細(xì)胞中SOD、MDA，上清液中LDH含量比較 (±s)

2.8 各組大鼠梗死心肌組織及H9c2心肌細(xì)胞中Keap1、Nrf2蛋白表達(dá)比較 通過(guò)對(duì)大鼠梗死心肌組織與H9c2心肌細(xì)胞中蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組Keap1蛋白表達(dá)增高，Nrf2蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組Keap1蛋白表達(dá)降低，Nrf2蛋白表達(dá)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組Keap1蛋白表達(dá)降低，Nrf2蛋白表達(dá)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示小鼠缺血再灌注損傷心肌與缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激水平降低，鹿紅方低、中、高劑量預(yù)處理能增加Nrf2蛋白表達(dá)，增加抗氧化應(yīng)激水平，以鹿紅方中、高劑量組最有效。詳見圖4、表5、表6。

圖4 心肌組織與H9c2心肌細(xì)胞中Keap-1、Nrf2蛋白定量條帶圖

表5 各組大鼠心肌組織中Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)比較 (±s)

表6 各組H9c2心肌細(xì)胞中Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)比較 (±s)

2.9 各組大鼠心肌組織及H9c2心肌細(xì)胞中Fe2+水平比較 與對(duì)照組比較，模型組梗死心肌組織中Fe2+水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組Fe2+水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組Fe2+水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表7。提示心肌缺血再灌注受損心肌組織中Fe2+沉積，可能是導(dǎo)致心肌再灌注損傷的原因，鹿紅方低、中、高劑量預(yù)處理能有效減少梗死心肌組織中Fe2+沉積，以鹿紅方中、高劑量預(yù)處理效果最優(yōu)。

表7 各組大鼠心肌組織中Fe2+濃度比較(±s) 單位：mmol/L

與對(duì)照組比較，模型組缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞中Fe2+水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，鹿紅方低劑量組、鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞Fe2+水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與鹿紅方低劑量組比較，鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量組缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞Fe2+水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表8。提示缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞中Fe2+離子沉積，可能是導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的原因，鹿紅方低、中、高劑量預(yù)處理能有效減少缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞中Fe2+沉積，以鹿紅方中、高劑量預(yù)處理效果最優(yōu)。

表8 各組H9c2心肌細(xì)胞中Fe2+濃度比較(±s) 單位：mmol/L

3 討 論

AMI是臨床上常見的危急重癥，中醫(yī)上歸屬于“胸痹”“真心痛”范疇，基本病因多為本虛標(biāo)實(shí)，正氣虧虛，氣滯、寒凝、痰濁、瘀血等痹阻心脈[12]。鹿紅方由鹿角、紅花、山茱萸、沉香等藥物組成，方中鹿角溫補(bǔ)肝腎、益精養(yǎng)血，紅花活血化瘀、通經(jīng)止痛，共為君藥；山茱萸、補(bǔ)骨脂溫補(bǔ)腎陽(yáng)，女貞子滋補(bǔ)肝腎，寓“陰中求陽(yáng)”之義，為臣藥；少佐沉香溫經(jīng)行氣止痛，增強(qiáng)紅花活血化瘀之功，具有“補(bǔ)中寓行、補(bǔ)而不滯”的作用。前期研究證實(shí)，鹿紅方可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制心肌細(xì)胞凋亡及自噬，從而減輕H9c2心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷[13-14]。

MIRI的病理機(jī)制涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多方面，在MIRI的發(fā)生發(fā)展中都起重要作用。當(dāng)MIRI發(fā)生時(shí)，心肌內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，導(dǎo)致線粒體損傷、鈣超載、細(xì)胞凋亡，所有氧化應(yīng)激是MIRI發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。ROS升高導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和壞死[3，15]。本研究證明，H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型中，與對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞培養(yǎng)基上清液H9c2心肌細(xì)胞中LDH含量明顯升高，心肌細(xì)胞中MDA含量升高，SOD含量降低，而鹿紅方可有效降低細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH及心肌細(xì)胞中MDA含量，升高SOD含量，以鹿紅方中劑量及高劑量組效果最優(yōu)。在MIRI模型中，與對(duì)照組比較，模型組GSH、SOD含量明顯減低，MDA含量明顯升高，而鹿紅方可以有效降低梗死心肌組織MDA含量，升高SOD及GSH活性，以鹿紅方中劑量及高劑量組效果最優(yōu)。此外，HE染色及TUNEL染色表明，鹿紅方低、中、高劑量都能有效緩解MIRI導(dǎo)致的心肌細(xì)胞水腫、壞死及凋亡。流式細(xì)胞檢測(cè)表明，鹿紅方各劑量能抑制H9c2缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡，表明鹿紅方可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而減輕心肌缺血再灌注損傷。

在缺血再灌注損傷過(guò)程中，氧化應(yīng)激過(guò)程是關(guān)鍵環(huán)節(jié)[16]，而Keap-1/Nrf2/ARE信號(hào)通路是機(jī)體中最重要的抗氧化信號(hào)通路，Nrf2因子是機(jī)體內(nèi)維持氧化還原反應(yīng)的主要因子之一[6]，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧自由基增加時(shí)，Nrf2從Keap-1上撤離，移位至細(xì)胞核，與ARE結(jié)合，啟動(dòng)下游抗氧化蛋白及解毒酶，從而發(fā)揮抗氧化作用。本研究表明，在H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型及MIRI模型中，與對(duì)照組比較，模型組Nrf2蛋白表達(dá)水平降低，鹿紅方各劑量都能上調(diào)Nrf2蛋白表達(dá)水平，增強(qiáng)抗氧化作用，以鹿紅方中劑量及高劑量效果最優(yōu)。因此，鹿紅方可以上調(diào)Nrf2抗氧化信號(hào)通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，鹿紅方可以明顯抑制心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕心肌損傷，其機(jī)制可能與上調(diào)Nrf2抗氧化信號(hào)通路有關(guān)。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞及心肌組織中Fe2+含量明顯升高。而Fe2+水平升高導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化可以引起細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。此外，鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)受Nrf2水平調(diào)控[6]。因此，鹿紅方減輕心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制是否與鐵死亡相關(guān)，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證明。