劉軍霞 王德好 諶海燕 郭 明 謝佳燁 李 玲 廖俊堯 廖 婧 丁曉慶△

(1.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院血液科，北京 100078；2.北京中醫(yī)藥大學2021級博士研究生，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學2019級碩士研究生，北京 100029)

急性白血病(acute leukemia，AL)臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染和發(fā)熱[1]。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者治療過程中常病情復發(fā)導致治療效果不佳，縮短了患者的生存時間，因此找出與預后相關的基因，對于預測患者生存周期，進而分層治療具有重要意義[2]。WT1基因最早在Wilms瘤中被發(fā)現(xiàn)，分子質量約為50×103Da，位于人類染色體11p13，與瘤體病變密切相關。WT1基因在白血病中呈高表達，被稱為“泛白血病”基因標志[3]。

AL疾病惡性程度較高，其在發(fā)病過程中容易并發(fā)感染、出凝血異常等疾病，導致患者預后較差，其中廣泛出血以及形成微血栓表現(xiàn)的彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)是出凝血異常并發(fā)癥造成高死亡率和出血的重要原因，而大多數(shù)的AL患者均伴有不同程度的 DIC[4-7]?；颊甙l(fā)生DIC時治療難度較大，因此早期診斷、早期治療是AML并發(fā)DIC 治療的關鍵，臨床中迫切需要有優(yōu)勢的 DIC 早期診斷指標。

本研究以老年AML患者為研究對象，回顧性探究中醫(yī)證型分布規(guī)律及不同證型的預后特點，結合患者的基因及核型資料與住院期間的實驗室檢查結果，以期為AML的診斷和治療提供指導。

1 資料與方法

1.1 病例來源 收集2009—2020年北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院血液科老年AML患者59例，男34例，女25例；在本院化療26 例，未在本院化療33例；在本院化療患者中位年齡74.5歲，未在本院化療患者中位年齡80歲。

1.2 病例選擇

1.2.1 診斷標準 參照《血液病診斷及療效標準》[8]中AML的診斷標準，分型標準參照AML 的法、美、英分型系統(tǒng)(French-American-British classification systems，F(xiàn)AB)分型[9]及世界衛(wèi)生組織(WHO)分型(2016)[10]。中醫(yī)證型標準參照《老年急性髓系白血病(非急性早幼粒細胞白血病)中西醫(yī)結合診療專家共識》[11]，預后及分層參照《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細胞白血病)中國診療指南(2017年版)》[12]。

1.2.2 納入標準 年齡>60歲；資料完整者。

1.2.3 排除標準 資料完整度不足以支撐完成后續(xù)分析者；FAB分型為M3型者。

1.3 治療情況

1.3.1 中醫(yī)治療 化療期予北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院血液科協(xié)定處方血證膏方。藥物組成：炙黃芪 30 g，白術 15 g，陳皮15 g，茯苓15 g，生地黃15 g，白芍15 g，當歸15 g，川芎15 g，黨參15 g，何首烏15 g，枸杞子15 g，菟絲子15 g，紅景天10 g。休療期予骨髓增殖膏方。藥物組成：炙黃芪30 g，白術15 g，陳皮15 g，茯苓15 g，生地黃15 g，白芍15 g，當歸15 g，川芎15 g，黨參15 g，丹參30 g，桃仁10 g，紅花10 g，水蛭10 g，土鱉蟲10 g，三棱10 g，莪術10 g，白花蛇舌草30 g，半枝蓮30 g，山慈菇30 g，夏枯草10 g，青黛10 g。日 1 劑，水煎2次取汁300 mL，分早、晚2次服。

1.3.2 西醫(yī)治療 ≤75歲的老年患者，一般狀況良好，預后及分層評估為良好者，一般選用“3+7”方案中的DA 方案(柔紅霉素聯(lián)合阿糖胞苷)、IA 方案(去甲氧柔紅霉素聯(lián)合阿糖胞苷)或 MA方案(米托蒽醌聯(lián)合阿糖胞苷)。年齡>75歲的老年患者，一般狀況差，預后及分層評估為不良的患者一般采用低強度化療方案，主要有超小劑量地西他濱、小劑量CAG(阿克拉霉素、阿糖胞苷、粒細胞集落刺激因子)、阿扎胞苷、小劑量阿糖胞苷等。緩解后可繼續(xù)原方案治療，或使用阿糖胞苷中劑量或標準劑量鞏固治療。

1.3.3 隨訪 隨訪至2021年2月，時間終點為患者死亡。

1.4 西醫(yī)療效標準 參照《血液病診斷及療效標準》[8]，完全緩解：無貧血出血，無感染等，男性血紅蛋白(Hg)含量≥100 g/L，女性Hg含量≥90 g/L，骨髓中原始細胞≤5%，血小板計數(shù)(PLT)≥100×109/L，中性粒細胞絕對值>1.5×109/L，日常生活基本恢復；部分緩解：臨床癥狀、體征及血細胞均有所改善，原始細胞在骨髓中達到5%～20%；未緩解：未達到以上標準?？傆行?(完全緩解例數(shù)+部分緩解例數(shù))/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用 SPSS 20.0軟件統(tǒng)計處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，小樣本量采用Fisher精確概率法，計量資料首先進行正態(tài)分布分析，符合正態(tài)分布的根據(jù)資料是否為配對。中西醫(yī)結合治療老年AML回顧性研究37例分別采用獨立樣本t檢驗及配對樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布的根據(jù)數(shù)據(jù)采用配對樣本的秩和檢驗或獨立樣本的秩和檢驗。應用Kaplan- Meier 法繪制生存曲線，同時采用Log-rank 檢驗比較不同組之間的差異。

2 結果

2.1 基本資料 本研究患者59例，其中化療聯(lián)合中藥治療26例，未化療33例?；熃M患者中位年齡 74.5(63，88)歲，中位總生存期(overallsurvival, OS)為8個月。未化療組患者中位年齡 80(60，95)歲，中位OS為1個月。年齡>75歲患者中位OS為6個月，年齡≤75歲患者中位OS為13個月，比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.040)。

2.2 緩解時間 患者在 4 個療程內能得到總緩解(overall response，OR)的中位生存期為 16 個月，而在4個療程內未得到OR的中位生存期為4 個月，比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。

2.3 中醫(yī)證候分析 59例老年AML患者中，邪盛正虛證35例(59%)，邪熱熾盛證1例(2%)，氣血兩虛證19例(32%)，痰瘀互結證3例(5%)，痰瘀互結證兼邪熱熾盛證1例(2%)。首次就診患者中行基因檢測者共40例，其中未突變患者 10 例(25%)，1 種及以上突變患者 30 例(75%)。分析檢出基因突變與未檢出突變基因的中醫(yī)證型差異，未突變患者氣血兩虛證4 例(40%)，邪盛正虛證4例(40%)，痰瘀互結證1例(10%)，痰瘀互結證兼邪熱熾盛證1例(10%)；突變患者氣血兩虛證11例(36.7%)，邪盛正虛證19例(63.3%)。WT1 突變 17 例(42.5%)，未突變患者 23 例(57.5%)，WT1突變患者氣血兩虛證8例，邪盛正虛證9例；WT1未突變患者氣血兩虛證7例，邪盛正虛證14例，痰瘀互結證1例，痰瘀互結證兼邪盛正虛證1例。使用 Fisher 精確概率法計算P值分別為0.687、0.509。其中 1 種、2 種、3 種及以上基因突變者氣血兩虛證及邪盛正虛證人數(shù)比分別為2/3、3/5 及2/5。其他突變有富絲氨酸/精氨酸剪接因子-2基因(serine and arginine rich splicing factor 2，SRSF2)突變 1 例，Runt相關轉錄因子1基因(runtrelated transcription factor 1，RUNX1)突變 3 例，額外性梳樣基因(additional sex combs-like gene，ASXL)突變 5 例，CCAAT /增強子結合蛋白α基因(CCAAT/enhancer binding protein alpha，CEBPA)突變5 例，10-11易位基因 2 (ten-eleven translocation gene 2,TET2 )突變 5 例，核仁磷酸蛋白基因(nucleophosmin，NPM)突變 1 例，DNA甲基轉移酶3α基因(DNA methyltransferase 3 alpha，DNMT3A)突變 4 例，黑色素瘤特異性抗原基因(preferentially expressedantigen of melanoma，PRAME)突變 3 例，異位病毒整合位點1基因(ecotropic viral integration site 1，EVI1)突變 3 例，植物同源結構域指蛋白6基因(the plant homeodomain finger protein 6，PHF6)突變 4 例，F(xiàn)MS樣酪氨酸激酶 3 基因內部串聯(lián)重復突變 3 例，Kit 原癌基因突變2例，神經(jīng)纖維瘤蛋白1基因(neurofibromin 1，NF1)突變1例，集落刺激因子3受體基因(colony stimulating factor 3 receptor，CSF3R)突變1例，急性粒細胞白血病基因1/第8號染色體的ETO基因(myeloid leukemia 1, AML1/eight twenty one, ETO)融合1例，混合細胞系白血病部分串聯(lián)重復基因(mixed-lineage leukemiapartial tandem duplication，MLL-PTD)高表達1例，髓系分化主要反應蛋白88基因(myeloid differentiation primary response 88，MYD88)突變1例，脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine triad ，F(xiàn)HIT)/toll-白細胞介素1 受體域接頭蛋白基因(toll-interleukin 1 receptor domain containing adaptor protein，TIRAP)融合1例，集落刺激因子3受體基因(colony stimulating factor 3 receptor，CSF3R)突變1例，U2 小核糖核蛋白輔助因子1(U2 small nuclear RNA auxiliary factor 1，U2AF1)突變1例，GATA結合蛋白2基因(GATA2)變異1例，信號轉導因子和轉錄激活因子 5B(signal transducer and activator oftranscription 5B，STAT5B)突變1例。

納入患者中行染色體檢查者 34 例，0種突變人數(shù) 14 例(41%)，其中氣血兩虛證9例(26%)，邪盛正虛證4 例(12%)，痰瘀互結證1 例(3%)；1種及以上突變人數(shù)20例，其中氣血兩虛證3 例，邪盛正虛證16例，痰瘀互結證兼邪熱熾盛證1例。8號染色體三體(+8)7 例，其中氣血兩虛證1 例，邪盛正虛證5例，痰瘀互結證兼邪熱熾盛證1例；無8號染色體三體(+8)26 例，其中氣血兩虛證11 例，邪盛正虛證15 例，痰瘀互結證1 例。使用 Fisher 精確概率法計算P值分別為 0.004、0.370(見表1)。

表1 老年AML氣血兩虛證、邪盛正虛證遺傳學分布

2.4 遺傳學與生存期分析 通過 Log-rank 檢驗對 26 例化療患者進行生存期分析。共納入完整基因檢測患者 24 例，其中 1 種及以上基因突變患者 19 例，基因檢測未發(fā)現(xiàn)突變5例，結果顯示2組患者生存期比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.729)；其中 WT1 突變陽性者 10 例，突變陰性者 14 例，結果提示 WT1 突變是影響老年 AML 患者生存期的因素(P=0.049)(見圖1)；DNMT3A 及 RUNX1 突變患者生存期均未見明顯差異(見表2)。共納入完整檢測染色體患者 20 例，其中發(fā)現(xiàn)染色體突變患者 9 例，未發(fā)現(xiàn)突變患者 11 例，結果顯示2組患者生存期比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；預后危險度中，預后不良組和預后良好及中等組、危險度評分中<9 分組及≥9 分組患者生存期均未見明顯差異(P>0.05)。

表2 基因與生存期關系表

注：0代表無突變，1代表有突變

2.5 凝血與生存期分析 統(tǒng)計26例化療患者入院后國際血栓與止血協(xié)會(ISTH)評分，將患者分為<5分組(22 例)及≥5分組(4例)，Log-rank 檢驗結果顯示2組生存期比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.037)；將患者分為<4 分組(13例)及≥4 分組(13例)，Log-rank 檢驗結果顯示2組生存期比較差異有統(tǒng)計學差異(P=0.003)。根據(jù)D-二聚體(D-D)水平分為≤1 mg/L組(13例)及>1 mg/L組(13例)，結果顯示2組生存期比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.021)；發(fā)生出凝血異常12例，占接受化療人數(shù)46%，未發(fā)生出凝血異常14例，占接受化療人數(shù)54%，2組生存期比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.037)。見表3、圖2～5。

表3 凝血與生存期關系表

注：0代表<5分，1代表≥5分

注：0代表<4分，1代表≥4分

注：0代表≥1 mg/L,1代表<1 mg/L

注：0=無，1=有

3 討論

在AML患者中，<60歲患者的5年總生存率為40%～50%，>60歲患者的中位生存期<1年[13]。治療方案結合患者的耐受性、危險分層和其他臨床因素綜合選擇尤為重要。現(xiàn)有風險分層依賴于細胞遺傳學研究和基因突變的分子檢測，如FLT3-ITD、NPM1、CEBPA和KIT[14]。

本研究結果顯示，老年AML患者中醫(yī)證型分布存在氣血兩虛、邪盛正虛、痰瘀阻滯、邪熱熾盛四種類型，其中氣血兩虛和邪盛正虛占比最大，這可能與本研究中選擇的病例均為>60歲老年人有關。老年人普遍陰陽失衡，臟腑衰竭，臨床以虛證為主，而正虛也可導致邪盛，即“因虛致實”。在本研究接受化療的26例患者中，8個月的中位生存期與萬偉等[15]研究結果近似。此外，是否存在染色體突變在氣血兩虛和邪盛正虛患者中存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，存在染色體突變患者在邪盛正虛患者中占比更大，這或許可以成為AML患者邪盛正虛和氣血兩虛的辨證的依據(jù)之一。而是否存在基因突變、基因突變的具體類型、是否存在+8突變在氣血兩虛和邪盛正虛患者中未見差異。方偉禎發(fā)現(xiàn)基因突變的數(shù)量在AML患者不同證型中存在差異，且氣陰兩虛型預后良好基因組(CEBPA、NPM1)比例顯著增多，本研究在基因突變與其結果差異或許為本研究納入病例數(shù)較少，每組基因突變樣本不足導致。在接受化療的26例病例中，不同證型間的生存期無明顯統(tǒng)計學差異，而WT1基因突變陽性和陰性患者中位生存期分別為6個月和19個月，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明WT1基因突變與不良預后相關，具備老年AML患者臨床危險分層的意義，這也與竇翠云等[2]研究結論相一致。而DNMP3A突變、RUNX1突變對生存期的影響不存在統(tǒng)計學差異(P>0.05)。46%的接受化療的患者在治療過程中發(fā)生出凝血異常，而ISTH評分≥4分，D-D>1 mg/L時，預后明顯不良。以往研究證實，D-D水平可評價患者凝血及纖溶系統(tǒng)問題，是AL并發(fā)癥評定的重要指標[16]。另有研究指出，D-D能及時有效地反映AML患者高凝狀態(tài)或纖溶亢進狀態(tài)[17]。本研究可被其他研究結果支持，具備參考價值。

WT1 基因可調節(jié)造血干細胞的數(shù)量、生長分化及生存，是雙向轉錄因子，能抑制幼稚細胞的分化，同時也具有癌基因的特性[18]。目前有研究表明，在惡性造血系統(tǒng)疾病中，WT1 基因均異常高表達，在 AML 中表達最明顯，相比其他類型惡性血液腫瘤有更重要的臨床意義[19]。另有研究表明，超過70%的AML患者 WT1 高表達[20-21]。在骨髓增生異常綜合征(MDS)中，WT1的表達與較高的原始細胞數(shù)和AML進展的風險增加相關[22]。多項研究表明，AML中WT1水平的增加與治療抵抗、較高的復發(fā)率和總體生存率低有關[23-25]。此外，未能將WT1轉錄水平降低到可檢測限度以下與AML復發(fā)率較高有關[26]。WT1對于微小殘留病變的預后存在價值[27]。部分研究表明，更高的WT1表達對AML預后具有更大的預測意義[19, 23,27-29]，而另一些研究表明，更低的WT1表達對預后具有更大的預測意義[30-34]。目前部分研究表明，AML患者WT1基因突變后無病生存期(disease-free survival,DFS)和OS顯著降低,WT1基因突變是AML不良預后的獨立因素[35]。而WT1 基因的高表達也是異基因造血干細胞移植前后預后不良的因素[26]。本研究提示，WT1突變可影響老年患者的生存期，然而由于本研究樣本量的限制，WT1對各型非M3，即非急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的AML預后的影響有待于進一步的探究。

白血病患者在治療過程中常發(fā)生出凝血異常，1/3的非APL的AML患者發(fā)生DIC，大約15%非APL的AML患者在誘導緩解化療開始不久后發(fā)生DIC[36]，APL患者發(fā)生血栓事件(thromboticevents,TE)的患病率高于其他AL患者，報告的患病率在2%～15%[37]。AL合并DIC具有較高的病死率，可誘發(fā)致命性出血，導致患者預后較差[38]。

本研究一方面驗證了出凝血異常常隨AML進展而出現(xiàn)，一方面發(fā)現(xiàn)D-D>1 mg/L或ISTH評分≥4分時常與不良的臨床結局相關。我們認為，D-D水平與ISTH評分在臨床中可提示出凝血是否存在異常，進而可輔助出凝血異常相關疾病的診斷。血漿D-D被認為是鑒別原發(fā)性和繼發(fā)性纖溶及監(jiān)測溶栓治療等方面的重要指標[39]，此指標已被大量研究證實可有效應用于多種惡性腫瘤疾病并發(fā)癥的輔助診斷[40-41]。也有研究證實，該指標對AL患者并發(fā)癥凝血及纖溶系統(tǒng)問題具有較高的診斷價值[42-43]。當發(fā)生纖維蛋白溶解過度時，91%的AML患者檢測到D-D水平升高[44]。盡管單次檢測不足以證實或否認DIC的診斷，但D-D仍被視為DIC診斷參考[45]。一項研究表明，D-D和可溶性p選擇素作為生物標志物，與惡性血液病靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism,VTE)相關，二者具有用于風險預測的可能[46]。

血液病合并DIC根據(jù)病程可分為3期：早期機體處于高凝狀態(tài)，凝血活性增高，臟器微循環(huán)障礙形成微血栓，部分患者可能無明顯癥狀，導致早期不易發(fā)現(xiàn)，檢出難度高；中期為消耗性低凝期，患者已經(jīng)出現(xiàn)不同程度的出血癥狀，可能形成臟器功能障礙，血小板減少，凝血因子消耗；晚期表現(xiàn)為嚴重的出血癥及休克。惡性血液腫瘤導致的DIC有以下多個方面：促凝活性增強，纖維蛋白溶解的激活，腫瘤細胞溶解。

目前，已有多項AML中血栓與止血分子標志物的研究，在現(xiàn)有研究中，D-D和纖維蛋白原的臨床預測能力最為突出，盡管研究結果參差不一。最近的研究發(fā)現(xiàn)，白血病細胞釋放的核內蛋白，如組蛋白H3和HMGB1與腫瘤溶解相關DIC的發(fā)展之間可能存在聯(lián)系；開始緩解誘導化療后，血漿中這些血栓前核內蛋白水平增加，隨后纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)和D-D水平增加，并診斷為DIC[47]。樣本量最大的研究報告了AML、骨髓瘤和淋巴瘤患者在基線期時D-D的高水平(>4.0 mg/L或>1.4 μg/mL)與VTE之間存在相關性，但在AML中D-D的升高高于正常上限幾乎是普遍的，學界對于其成為預示不良預后的明確分界點沒有共識[48]，分界點的確定有待于更多研究結果的出現(xiàn)。而當顯性 DIC 出現(xiàn)時，提示完全失代償階段，難以治療，常用于診斷DIC的ISTH評分可能不適用于AML疾病，因為它取決于PLT，而PLT受抗白血病治療或輸血的影響[36]，但其具有包含項目少，便于計算的優(yōu)勢[49]，在臨床中亦存在價值。早期識別出凝血異常具有重要的臨床意義，對AML患者出凝血異常具有特異性及敏感性的早期理想指標仍有待于發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，對于老年AML患者，早期診斷、分層治療有助于控制病情發(fā)展，降低死亡率，改善遠期預后。是否存在染色體突變有助于老年AML患者中醫(yī)證型的診斷，WT1基因對判斷老年AML患者臨床預后具有一定價值，ISTH評分及D-D水平可協(xié)助診斷AML合并出凝血異常。