陳旭升，趙 亮，狄佳春

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江下游棉花與油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

轉(zhuǎn)Bt基因的研究最先為Schnepf等[1]的報(bào)道。1989年Monsanto公司基于不改變殺蟲晶體蛋白氨基酸序列的前提下，采用人工合成與點(diǎn)突變的方法，對(duì)來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的Bt基因進(jìn)行改造，然后將改造的Bt基因?qū)朊藁ǎ罐D(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗蟲能力得以極大提升[2]。1996年Monsanto公司與棉花育種公司合作，育成商用轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉即保鈴棉33B，并開始在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用。我國緊跟國際轉(zhuǎn)基因抗蟲棉研究的前沿，郭三堆等[3-4]設(shè)計(jì)并自主合成了具有高活性表達(dá)的GFM Cry1A殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)基因，并將人工合成的Bt基因?qū)胧荏w棉花，成功獲得轉(zhuǎn)基因植株；經(jīng)與國內(nèi)育種單位合作，選育出一系列國產(chǎn)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉。

隨著分子標(biāo)記技術(shù)[5-6]的發(fā)展，有關(guān)抗蟲棉不同類型Bt基因的鑒定及其染色體定位的研究也取得很大進(jìn)展[7-10]。業(yè)已研究表明：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗性維系，既取決于棉花群體的抗蟲性純度，也與棉花受體中毒蛋白表達(dá)劑量密切相關(guān)[11]。陳旭升等[12]報(bào)道，在陸地棉資源中篩選到一個(gè)Bt基因低毒蛋白表達(dá)的種質(zhì)系WG-20，其葉樣品的Bt毒蛋白含量為88.8 ng/g，對(duì)棉鈴蟲的生物學(xué)平均抗性值PK為1.67，表現(xiàn)為低抗；對(duì)雜交F1的抗性鑒定顯示，該低毒Bt基因?qū)Ω叨綛t基因呈顯性表達(dá)。

本研究擬在分子水平上對(duì)該Bt基因類型進(jìn)行鑒定，并構(gòu)建定位遺傳圖譜，分析該遺傳轉(zhuǎn)化事件與高毒表達(dá)Bt基因轉(zhuǎn)化事件的關(guān)系，旨在為轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉育種提供多樣化視角。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用的試驗(yàn)材料為：轉(zhuǎn)Bt基因低毒蛋白表達(dá)種質(zhì)系WG-20、國產(chǎn)抗蟲棉GK-19，非轉(zhuǎn)基因棉花海島棉勝利1號(hào)與陸地棉泗棉3號(hào)。配置海陸雜交F1組合：WG-20×勝利1號(hào)，在江蘇省農(nóng)科院南京試驗(yàn)田種植雜交F1，開花期進(jìn)行自交，獲得F2分離群體作為Bt基因的定位群體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子DNA的提取 取親本W(wǎng)G-20與勝利1號(hào)以及(WG-20×勝利1號(hào))F1、(WG-20×勝利1號(hào))F2的種子。將每粒種子作為1個(gè)個(gè)體，剝離種殼得種仁。采用單粒棉花種子DNA 快速提取方法提取DNA[13]。

1.2.2 Bt基因類型鑒定 通過設(shè)計(jì)特異性引物做PCR檢測，可以鑒定國產(chǎn)Bt基因與美國Bt基因。特異性引物序列如下[7]：F-1： 5′-CATCTTCACTCGG

TAACATCG-3′(456 bp)；F-2： 5′-AGGGAACCTTCAT

CGTGG-3′(310 bp)；R： 5′-ATACGTGCCAAGTGCCA

ACC-3′。利用以上引物進(jìn)行混合PCR擴(kuò)增，國產(chǎn)Bt基因可獲得456 bp大小的特征片段，美國Bt基因?qū)@得310 bp大小的特征片段。對(duì)WG-20、GK-19的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以清水、非轉(zhuǎn)基因棉花泗棉3號(hào)為對(duì)照。在恒壓90 V條件下，使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小通過凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄。

1.2.3 群體Bt基因檢測與統(tǒng)計(jì) 取雙親、F1、F2分離群體的種子DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。采用8.0%的非變性聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠，電泳緩沖液為1×TBE，在200 V恒壓條件下，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，利用銀染法進(jìn)行染色，觀察統(tǒng)計(jì)各群體具有Bt基因的個(gè)體、無Bt基因的個(gè)體數(shù)量；而后對(duì)分離群體進(jìn)行χ2適合性測驗(yàn)。

1.2.4 Bt基因染色體定位 農(nóng)業(yè)部長江下游棉花與油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期利用來自Cotton Marker Database(https：//www.cottongen.org)提供的SSR引物序列，獲得分布于棉花26對(duì)染色體上的234對(duì)SSR核心引物[14]。在F2群體選取有Bt、無Bt個(gè)體各10個(gè)，將等量DNA混合。利用234對(duì)核心引物，先篩選F2近等基因混池的多態(tài)性標(biāo)記，而后檢測F2群體中各個(gè)體的基因型。以數(shù)字標(biāo)注多態(tài)性條帶：與無Bt基因親本帶型相同的標(biāo)注為1，與有Bt基因親本帶型相同的標(biāo)注為2，共顯性雜合帶型標(biāo)注為3，缺失標(biāo)注為0。而后采用Join Map 4.0軟件進(jìn)行連鎖分析，以確定低毒Bt基因在染色體上的位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 WG-20的Bt基因來源的分子鑒定

采用檢測Bt基因的特異引物，對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因材料進(jìn)行分子鑒定，以清水、泗棉3號(hào)為空白對(duì)照，PCR檢測結(jié)果見圖1。由圖1可知，國產(chǎn)抗蟲棉GK-19的PCR擴(kuò)增條帶，擬合國產(chǎn)Bt基因的特征引物設(shè)計(jì)長度456 bp，顯示其為轉(zhuǎn)國產(chǎn)Bt基因抗蟲棉。種質(zhì)系WG-20的Bt基因片段大小擬合美國 Bt 基因設(shè)計(jì)引物的特征片段長度 310 bp，顯示W(wǎng)G-20所含的為美國Bt基因。泳道3，4均未見特征擴(kuò)增條帶。

M.DNA Marker；1.GK-19；2.WG-20；3.清水；4.泗棉3號(hào)。M.DNA Marker；1.GK-19；2.WG-20；3.Distilled water；4.Simian No.3.

2.2 低毒Bt基因的分離規(guī)律

利用PAGE凝膠電泳，對(duì)低毒Bt基因親本W(wǎng)G-20、海島棉親本勝利1號(hào)以及雜交F1、F2進(jìn)行Bt基因特征條帶鑒定。圖2為F2群體部分單株鑒定結(jié)果，從圖2可以看出，有Bt基因的P1、F1以及F2的大部分個(gè)體在310 bp處均出現(xiàn)明顯的特征條帶；無Bt基因的P2以及編號(hào)5，6，20，27，28，35泳道的F2個(gè)體則沒有出現(xiàn)特征條帶。

M.Marker；P1.WG-20；P2.勝利1號(hào)；F1.WG-20×勝利1號(hào)；1—36.F2群體部分單株。M.Marker；P1.WG-20；P2.Shengli No.1；F1.WG-20×Shengli No.1；1—36.Partial plants of F2 population.

依據(jù)電泳的特征條帶，統(tǒng)計(jì)各群體Bt基因的分離情況見表1。由表1可見，種質(zhì)系WG-20的43個(gè)個(gè)體均含有Bt基因，而勝利1號(hào)的45個(gè)個(gè)體都沒有Bt基因；雜交F1中均檢測到Bt基因特征條帶，顯示該Bt基因呈顯性表達(dá)。分離F2群體中有Bt基因的個(gè)體數(shù)為143、無Bt基因個(gè)體數(shù)為35，采用χ2檢測符合3∶1的孟德爾理論分離比例，顯示該Bt基因是受1對(duì)顯性基因控制的質(zhì)量性狀，即該外源基因是以單個(gè)位點(diǎn)的方式插入陸地棉受體。因此，可采用SSR分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行基因定位。

表1 WG-20與勝利1號(hào)雜交后代的Bt基因分離情況Tab.1 Isolation of Bt gene from the offspring of WG-20 crossing Shengli No.1

2.3 低毒Bt基因染色體定位

利用本實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的234對(duì)核心引物，通過對(duì)定位群體F2的有Bt和無Bt兩近等基因混池進(jìn)行差異標(biāo)記篩選，有40對(duì)引物具有多態(tài)性。而后采用這40對(duì)多態(tài)性引物對(duì)F2作圖群體中的每個(gè)個(gè)體的基因型進(jìn)行檢測，并采用Join Map 4.0軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中的1對(duì)引物BNL1665與Bt基因緊密連鎖，二者的初始遺傳距離為7.8 cM。查閱Guo等[15]2007年發(fā)表的棉花分子標(biāo)記遺傳圖譜，顯示引物BNL1665位于棉花第10號(hào)染色體上。據(jù)此查找并合成在第10號(hào)染色體上距離該標(biāo)記上下50 cM區(qū)間的所有SSR引物。利用親本W(wǎng)G-20與勝利1號(hào)的DNA再篩選其中的多態(tài)性引物，并以多態(tài)性引物檢測F2作圖群體中的每個(gè)個(gè)體的基因型。試驗(yàn)結(jié)果采用Join Map 4.0軟件進(jìn)行連鎖遺傳分析，顯示共有14對(duì)引物與目的基因Bt相連鎖，分別是NAU5166、NAU3574、NAU456、BNL256、cgr6745、cgr5406、cgr6546、NAU7110、HAU3201、BNL1665、dPL0468、NAU5316、BNL2960、NAU3122?；駼t位于SSR標(biāo)記NAU7110和HAU3201之間，其遺傳距離分別為0.9，4.4 cM(圖3)。由此將該Bt基因定位在棉花第10號(hào)染色體上。

3 結(jié)論與討論

20世紀(jì)80年代在美國出現(xiàn)植物轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)。然而，將外源基因?qū)胫参锸荏w只是遺傳轉(zhuǎn)化的第一步，只有外源基因在受體中穩(wěn)定整合和有效表達(dá)，才能培育出具有新遺傳性狀的轉(zhuǎn)基因品種，最終才可能在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。然而許多外源基因轉(zhuǎn)化體，其目的基因在受體中的表達(dá)活性弱、產(chǎn)量低。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由轉(zhuǎn)基因沉默或位置效應(yīng)所致。

圖3 低毒Bt基因位于Chr.10的連鎖遺傳圖譜Fig.3 Genetic linkage map of low-toxic Bt gene in Chr.10

已有許多途徑與方法可以誘導(dǎo)基因沉默[16-18]；但關(guān)于基因表達(dá)的位置效應(yīng)研究報(bào)道則較少[19]。所謂位置效應(yīng)(Position effect)是指外源基因在受體中插入的位置不同所引起的基因表達(dá)程度的差異。外源基因整合到宿主染色體后會(huì)受到宿主染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控元件的影響[20]。在不同染色體區(qū)域，轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率不同，有的強(qiáng)烈表達(dá)，有的則表現(xiàn)為基因沉默。一般來說，外源基因整合到甲基化程度高、轉(zhuǎn)錄活性低的異染色質(zhì)區(qū)時(shí)，則趨向沉默；而外源基因整合到富含轉(zhuǎn)錄活性的常染色質(zhì)區(qū)時(shí)，則趨向活躍表達(dá)[21]。

已知國產(chǎn)抗蟲棉GK-19的Bt基因插入棉花第20染色體，美國抗蟲棉33B中的外源Bt基因則插入棉花第26染色體[10]。曾檢測GK-19、33B葉組織的Bt毒蛋白表達(dá)量分別高達(dá)1 032.7，1 123.9 ng/g，且對(duì)棉鈴蟲均表現(xiàn)為高抗；而種質(zhì)系WG-20，其葉組織的Bt基因毒蛋白表達(dá)量僅88.8 ng/g，且對(duì)棉鈴蟲表現(xiàn)為低抗[10-12]。染色體定位結(jié)果顯示：WG-20中的外源Bt基因插入到棉花第10號(hào)染色體上，與GK-19、33B中的外源Bt基因整合的染色體完全不同。由此推測：陸地棉種質(zhì)系WG-20中的Bt毒蛋白量呈低水平表達(dá)，可能是該外源Bt基因整合到棉花Chr.10的異染色質(zhì)區(qū)域，因位置效應(yīng)導(dǎo)致外源基因趨向沉默。