周鎮(zhèn)中，羅 彪，駱 鷹，夏 敏，汪啟明，饒力群

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，道地藥用植物規(guī)范化栽培與綜合利用湖南省工程實驗室，湖南 長沙 410128)

水稻(OryzasativaL.)作為重要糧食作物，穩(wěn)產(chǎn)是世界糧食安全和社會經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。全球氣候變暖，高溫導(dǎo)致水稻花粉育性降低、退穎、籽粒品質(zhì)降低等，高溫成為影響水稻生長和產(chǎn)量的主要限制因素[1-3]。水稻中UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GSA1)可通過催化單糖和黃酮類化合物的糖基轉(zhuǎn)移，改變黃酮類糖基的組成和苯丙素的代謝途徑，來調(diào)節(jié)和適應(yīng)高溫脅迫[4]。糖基的轉(zhuǎn)移在糖基轉(zhuǎn)移酶催化完成，從反應(yīng)數(shù)量上講，糖基的轉(zhuǎn)移是植物體內(nèi)最多的一類生化反應(yīng)[5]。非生物脅迫會導(dǎo)致植物產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，過量的活性氧導(dǎo)致生物大分子過度氧化而造成生理生化損傷[6]。植物在應(yīng)對ROS的機(jī)制中除了常見的抗氧化酶類，還有許多抗氧化劑。如谷胱甘肽(GSH)、黃酮類化合物和類胡蘿卜素等[7]。黃酮類化合物是植物中最具活性的代謝物之一。在黃酮類化合物參與清除ROS的反應(yīng)中都有UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶參與催化，生成具有抗氧化活性的各種衍生物[8]。如花青素3-O-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、花青素3-O-葡萄糖基的轉(zhuǎn)移酶和UDP-葡萄糖醛糖基轉(zhuǎn)移酶的功能主要是涉及黃酮類化合物糖基的轉(zhuǎn)移[9-10]。研究表明，通過黃酮類次生代謝物的產(chǎn)生能有效提升植物對逆境的抗性[11]，糖基轉(zhuǎn)移酶參與非生物脅迫和生物脅迫應(yīng)激產(chǎn)物的糖基化反應(yīng)[12]。在擬南芥中過表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶AtDGD1提高了擬南芥對高溫的耐受性，且擬南芥中AtDGD1的沉默導(dǎo)致擬南芥耐高溫能力下降[13-14]。因此，糖基轉(zhuǎn)移酶在植物應(yīng)對非生物脅迫時起到了重要作用。

隨著全基因組測序和生物信息學(xué)的發(fā)展，在水稻中鑒定出769個轉(zhuǎn)錄本是糖基轉(zhuǎn)移酶，可細(xì)分為41個家族[15]。水稻中作為脂質(zhì)、蔗糖等合成酶類的糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(GT Ⅰ)基因家族全基因組鑒定及功能分析尚未有研究報道。

本研究通過生物信息學(xué)分析在粳稻中鑒定出30個GT Ⅰ基因家族成員。通過進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘等分析，了解了粳稻GT Ⅰ基因家族成員的結(jié)構(gòu)特征和響應(yīng)高溫的表達(dá)情況，最后對GT Ⅰ 基因家族成員的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模，旨在為了解粳稻GT Ⅰ家族成員的功能研究奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步了解粳稻中GT Ⅰ基因家族成員在水稻抗高溫方面的研究提供方向，以及在水稻生產(chǎn)中對高溫的耐受性具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 GT Ⅰ基因家族的全基因組鑒定

EnsemblPlants(http：//plants.ensembl.org/index.html)下載粳稻(OryzasativaJaponica)、秈稻(OryzasativaIndica)、高粱(Sorghumbicolor)、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)全基因組序列、CDS 序列、蛋白質(zhì)序列以及全基因組注釋文件。Pfam 數(shù)據(jù)庫(http：//pfam.xfam.org)下載 GT Ⅰ 基因家族(PF 00534)保守結(jié)構(gòu)域(HMM)配置文件。HMMER 3.0 和 BlastP 檢索本地數(shù)據(jù)庫水稻及其他物種的基因組中GT Ⅰ 基因家族候選成員。候選成員的蛋白質(zhì)序列放入NCBI-CDD(Https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)、EMBL-EBI(http：//pfam.xfam.org/search#tabview=tab1)和SMART(http://smart.embl.de/smart/set_mode.cgi?GENOMIC=1)確認(rèn)GTⅠ基因家族成員保守結(jié)構(gòu)域，確定GTⅠ基因家族成員[16]。ExPASy(Http：//web.expasy.org/protparam/)對家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)分析[17]，CELLO v2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)在線分析家族成員亞細(xì)胞定位。

1.2 粳稻GT Ⅰ基因家族成員系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域分析

各物種GT Ⅰ 基因家族成員蛋白序列在 MEGA 7.0 軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，用NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹(自檢值為1 000)[17]。根據(jù)基因組注釋文件將粳稻GT Ⅰ 基因家族成員進(jìn)行外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)可視化[18]。GT Ⅰ 基因家族成員蛋白序列放入在線網(wǎng)站MEME(http：//meme.sdsc.edu/meme/)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析[19]。

1.3 GT Ⅰ基因家族成員染色體定位、啟動子分析和miRNA-GT Ⅰ基因家族成員預(yù)測

水稻基因組注釋文件獲得GT Ⅰ基因家族成員的位置及結(jié)構(gòu)信息。MapChart 2.2 軟件可視化水稻GT Ⅰ 基因家族成員的位置信息。GT Ⅰ 基因家族成員的啟動子序列(基因起始轉(zhuǎn)錄位點開始選取上游1 500 bp的序列)在PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)進(jìn)行分析，軟件TBtools 啟動子分析結(jié)果可視化。預(yù)測miRNA在GT Ⅰ 基因家族成員潛在的靶位點，GTⅠ基因家族成員cDNA在psRNATarget(http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/)預(yù)測miRNA前體[20]，軟件Cytoscape可視化[21]。

1.4 粳稻GT Ⅰ基因家族成員組織表達(dá)分析和高溫脅迫處理以及轉(zhuǎn)錄組測序分析

RiceXPro網(wǎng)站(https：//ricexpro.dna.affrc.go.jp/)下載GTⅠ家族成員組織表達(dá)公共RNA-Seq樣本[22]，TBtools數(shù)據(jù)可視化[23]。粳稻GTⅠ基因家族成員響應(yīng)非生物脅迫表達(dá)情況，日本晴幼苗在28 ℃人工物候箱中生長，光照14 h，黑暗10 h。14 d后選取長勢一致的幼苗進(jìn)行高溫處理。在45 ℃人工物候箱進(jìn)行高溫孵育。處理取樣時間為0，1，3，6，12，24，48 h，采集莖和葉組織轉(zhuǎn)錄組測序。RNA-Seq數(shù)據(jù)訪問號為SRP190858[24]。TBtools軟件數(shù)據(jù)可視化。

1.5 GT Ⅰ基因家族成員高溫表達(dá)的實時熒光定量驗證

用上述非生物脅迫處理方法對日本晴處理，處理取樣時間為0，3，6，12，24，36 h。TRIzol試劑按說明提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 2 μg 總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，稀釋備用。SYBR 預(yù)混Ex Taq在BIO-RAD品牌的CFX Connect進(jìn)行 Real-time PCR。體系 20 μL，10 μL SYBR Green PCR mix，上下游引物 各0.5 μL，2 μL cDNA，7 μL ddH2O。qRT-PCR 的反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s；循環(huán)階段：94 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，45個循環(huán)；溶解曲線階段：94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s，4 ℃保存。以Actin作為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計算GT Ⅰ家族基因的相對表達(dá)量[25]，每個時期，每個基因的表達(dá)反應(yīng)有 3 個生物重復(fù)和 3 個技術(shù)重復(fù)。基因引物見表1。

表1 實時熒光定量引物Tab.1 Real-time fluorescence quantitative primers

1.6 粳稻GT Ⅰ基因家族蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)同源建模

蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)對了解其功能具有重要意義，將GTⅠ基因家族成員蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)建模分析[26]，使用網(wǎng)站SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive/)同源建模[27-28]，其中模板建模評分(TM-score)的值均大于0.5，說明三維建模可信[29]。PROCHECK(https：//www.rcsb.org/alignment)檢驗三維結(jié)構(gòu)的可靠性[30]，其三維結(jié)構(gòu)均方根差(RMSD)小于1，說明結(jié)果可靠[31]。三維建模在軟件VMD可視化[32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 粳稻GT Ⅰ基因家族成員及其染色體分布

粳稻全基因組鑒定出30個GT Ⅰ家族成員(表2)，由水稻GT Ⅰ基因家族成員蛋白質(zhì)理化分析結(jié)果可知30個GTⅠ基因家族成員的氨基酸組成存在一定的差異，其蛋白質(zhì)長度為256～1 066 aa，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為29.06～118.72 ku，預(yù)測的等電點(pI)變化為5.14～9.91。

表2 粳稻GT Ⅰ基因家族編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及其亞細(xì)胞定位Tab.2 Physicochemical properties and subcellular localization of proteins encoded by the GT Ⅰ gene family in japonica rice

表2(續(xù))

由亞細(xì)胞定位預(yù)測可知，GT Ⅰ基因家族成員的蛋白質(zhì)主要在胞質(zhì)和葉綠體，部分成員定位在質(zhì)膜和線粒體。由基因染色體定位得知，GT Ⅰ基因家族成員在水稻全基因組12條染色體上均有分布(圖1)，30個家族成員中，在3號染色體分布有5個，在1，6，7號染色體各有4個，在2，4號染色體均有3個，在11號染色體有2個。在5，8，9，10，12號染色體均只存在1個家族成員。

圖中編號代表染色體編號；綠色長條長度根據(jù)基因組染色體長度顯示；染色體上左邊數(shù)字是基因在染色體上的位置，右邊的數(shù)字是成員名稱。The numbers in the diagram represent chromosome numbers and the length of the long green bar is shown based on the length of the genomic chromosome;the number on the left of the chromosome is the position of the gene on the chromosome，and the number on the right is the member name.

2.2 粳稻、秈稻及其他物種的GT Ⅰ基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

為得知水稻GT Ⅰ基因家族與其他物種的GT Ⅰ基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和進(jìn)化模式，粳稻30個GT Ⅰ基因家族成員、秈稻21個GT Ⅰ基因家族成員、高粱7個GT Ⅰ 基因家族成員、雷蒙德氏棉12個GT Ⅰ基因家族成員和擬南芥15個GT Ⅰ基因家族成員構(gòu)建進(jìn)化樹(圖2)。根據(jù)遺傳距離將所有GT Ⅰ家族成員分為3個亞家族，其中，亞家族Ⅰ包含了10個基因(4個粳稻GT Ⅰ成員、2個秈稻GT Ⅰ成員、1個高粱GT Ⅰ成員和3個擬南芥GT Ⅰ成員)，亞家族Ⅱ包含了32個基因(16個粳稻GT Ⅰ成員、13個秈稻GT Ⅰ成員、3個擬南芥GT Ⅰ成員)，亞家族Ⅲ包含了43個基因(10個粳稻GT Ⅰ成員、6個秈稻GT Ⅰ成員、6個高粱GT Ⅰ成員、9個擬南芥GT Ⅰ成員和12個雷蒙德氏棉GT Ⅰ成員)。這3個亞家族中都有擬南芥的GT Ⅰ家族成員。雷蒙德氏棉GT Ⅰ家族成員只存在第Ⅲ亞家族中。粳稻30個GT Ⅰ家族成員和秈稻21個GT Ⅰ家族成員主要分部在第Ⅰ亞家族和第Ⅱ亞家族中，與其他物種相比，它們具有更近的親緣關(guān)系。

★.粳稻； ●.秈稻；■.高粱；▲.擬南芥；√.雷蒙德氏棉。進(jìn)化樹分支的顏色代表不同的亞家族(紅色代表亞家族Ⅰ、綠色代表亞家族Ⅱ和藍(lán)色代表亞家族 Ⅲ)。★.Japonica rice；●.Indica rice；■.Sorghum bicolor；▲.Arabidopsis thaliana；√.Gossypium raimondii. The colors of the evolutionary tree branches represent the different subfamilies(red for subfamily I，green for subfamily Ⅱ and blue for subfamily Ⅲ).

根據(jù)序列的相似性和系統(tǒng)發(fā)育分析，在粳稻中獲得了GT Ⅰ基因的同源對。粳稻中總共發(fā)現(xiàn)了6對同源組，5個同源基因。利用ClustalW分析計算粳稻GT Ⅰ基因家族的同源基因Ka/Ks值，探究基因進(jìn)化選擇壓力(表3)?；騉S-GT28和OS-GT29與OS-GT30、OS-GT24和OS-GT25存在著基因進(jìn)化選擇壓力。OS-GT29和OS-GT30的Ka/Ks值為0.919(Ka/Ks<1)，說明它們之間存在著基因受純化選擇。OS-GT29和OS-GT24的Ka/Ks值為1.088(Ka/Ks>1)，OS-GT29和OS-GT25的Ka/Ks值為1.087(Ka/Ks>1)，說明OS-GT29與它們之間存在基因受正向選擇。另外OS-GT-28和OS-GT30的Ka/Ks值為0.937(Ka/Ks<1)，說明它們之間存在著基因受純化選擇。OS-GT28和OS-GT24的Ka/Ks值為1.075(Ka/Ks>1)，OS-GT28和OS-GT25的Ka/Ks值為1.078(Ka/Ks>1)，說明OS-GT-28與它們之間存在基因受正向選擇。

2.3 粳稻GT Ⅰ基因家族成員結(jié)構(gòu)與保守序列特征

外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)是基因進(jìn)化的重要特征，也是基因功能多樣化的重要因素。進(jìn)一步分析GT Ⅰ 基因家族成員的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域(圖3)。GT Ⅰ基因家族成員經(jīng)過聚類分析，把具有保守基序的成員聚類到一塊。圖3-A顯示， GT Ⅰ基因家族成員通過遺傳距離分析可以把30個基因家族成員分成六大類。圖3-B顯示，GT Ⅰ 基因家族成員通過MEME軟件分析出保守基序得到了10個Motif，所有基因家族成員都含有Motif 2這個保守的基序。聚類分析中，第Ⅰ類家族成員OS-GT24、OS-GT25、OS-GT26、OS-GT27、OS-GT28、OS-GT29和OS-GT30含有的Motif是相對保守的，含有7類Motif；家族的保守結(jié)構(gòu)域建樹，通過保守基序分析得到10個Motif，不同顏色代表不同的Motif類別。圖3-C藍(lán)色代表UTR，黃色代表CDS；間隔區(qū)代表內(nèi)含子。每個GT Ⅰ 家族成員的CDS、UTR和內(nèi)含子的分布都按基因上的比例分布。

表3 粳稻中GT Ⅰ基因家族同源基因進(jìn)化壓力選擇Tab.3 Evolutionary pressure selection of GT Ⅰgene family homologous genes in japonica rice

Conservative structural domain building tree of the family，10 Motifs were obtained by conserved motif analysis，different colors represent different Motif categories.In Fig.3-C blue represents UTR，yellow represents CDS；spacer region represents intron.The distribution of CDSs，UTRs and introns of each GT I family member is scaled genetically.

第 Ⅱ 類家族成員中OS-GT21和OS-GT23均含有Motif 2和Motif 1；第Ⅲ和Ⅳ類家族成員中大多只含有Motif 2；第Ⅴ和Ⅵ 類家族成員中大多數(shù)含有3個Motif。圖3-C顯示，除OS-GT04和OS-GT13沒有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)外，其余基因家族成員都含有較多的內(nèi)含子，基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。

2.4 粳稻GT Ⅰ家族基因啟動子和相關(guān)miRNA預(yù)測

進(jìn)一步闡明粳稻GT Ⅰ家族基因在非生物脅迫中可能存在的調(diào)控機(jī)制，對啟動子中序列進(jìn)行了分析，結(jié)果共獲得38類順式作用元件(圖4)，其中TATA-box、CAT-box等核心啟動子元件在30個GT Ⅰ 家族成員中均有發(fā)現(xiàn)。這些啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了大量與激素相關(guān)的作用元件，30個GT Ⅰ 家族成員都預(yù)測到脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)，在7個家族成員中預(yù)測到赤霉素響應(yīng)元件(CARE)，在18個家族成員中預(yù)測到水楊酸響應(yīng)元件(TCA)，在10個家族成員中預(yù)測到茉莉酸甲酯響應(yīng)敏感基序(CGTCA和TGACG)。30個家族成員中沒有出現(xiàn)4種激素都響應(yīng)的成員，但30個家族成員均預(yù)測出響應(yīng)光的作用元件，如ACE、G-box、I-box等。也有部分成員預(yù)測出參與低溫反應(yīng)的順式作用元件(LTR)和MYB結(jié)合位點參與干旱反應(yīng)的順式作用元件(MBS)。30個家族成員中有少數(shù)幾個成員沒有直接參與植物苯丙烷類次生代謝途徑調(diào)節(jié)的MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。

圖4 GT Ⅰ基因家族成員啟動子順式作用元件Fig.4 Cis-acting elements of promoters of GT Ⅰ gene family members

靶向GT Ⅰ 家族成員miRNA預(yù)測(圖5)。miRNA可以通過剪切或者抑制翻譯來調(diào)控靶基因的表達(dá)，依據(jù)其與靶基因序列的互補(bǔ)程度，miRNA靶基因的數(shù)目可能是一個或者多個，有些靶基因受到多個miRNA的調(diào)控。在數(shù)據(jù)庫中獲得了49個不同類型的相關(guān)miRNA，靶向29個GT Ⅰ 基因家族成員，只有OS-GT04沒有匹配到對應(yīng)的miRNA，說明OS-GT04從某種程度可以說不會被miRNA通過剪切或者抑制翻譯。osa-miR1857-5p這個miRNA靶向OS-GT26、OS-GT19和OS-GT10，說明這3個家族成員可以被其調(diào)控。osa-miR1858a的靶標(biāo)是OS-GT13和OS-GT22。osa-miR5075、osa-miR1853-3p、osa-miR5809、osa-miR444a-3p.1和osa-miR810b.1也對應(yīng)2個家族成員，預(yù)測出的miRNA是大多數(shù)靶向1個GT Ⅰ 基因家族成員，靶向GT Ⅰ 基因家族成員的miRNA預(yù)測網(wǎng)絡(luò)見圖5。miR1857是參與果實成熟和非生物逆境調(diào)控的miRNA，其對應(yīng)的靶基因主要是花青素合成和非生物逆境應(yīng)答等。這說明miRNA與GT Ⅰ 基因家族成員之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能為它們的功能提供了重要的線索，同時也有利于選擇候選基因進(jìn)行未來的研究。

2.5 GT Ⅰ 基因家族成員組織特異性表達(dá)和高溫脅迫響應(yīng)

利用網(wǎng)絡(luò)公共數(shù)據(jù)對GT Ⅰ 基因家族成員在不同組織部位表達(dá)進(jìn)行了分析(圖6)，結(jié)果顯示，GT Ⅰ 基因家族成員在組織中表達(dá)具有較強(qiáng)的組織特異性，其中OS-GT21、OS-GT06、OS-GT18、OS-GT29、OS-GT03、OS-GT24、OS-GT11、OS-GT15和OS-GT25在莖部位高表達(dá)，在葉片、葉鞘和根的表達(dá)表現(xiàn)為低表達(dá)；OS-GT17和OS-GT02在葉片中呈現(xiàn)高表達(dá)，OS-GT07、OS-GT30、OS-GT28和OS-GT26在葉片中呈現(xiàn)低表達(dá)；在葉鞘中，OS-GT27、OS-GT16和OS-GT01呈現(xiàn)高表達(dá)，在根中低表達(dá)的成員有OS-GT08、OS-GT05和OS-GT09。

通過日本晴高溫脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，GT Ⅰ 家族成員的表達(dá)模式如圖7所示，大部分家族成員在高溫脅迫第3小時開始響應(yīng)高溫脅迫，在高溫處理6 h開始表達(dá)量變化明顯。OS-GT14、OS-GT09和OS-GT22高溫脅迫開始前3 h表達(dá)量高，隨著脅迫時間延長，表達(dá)量下降。這3個成員高溫脅迫呈負(fù)調(diào)控。OS-GT24高溫脅迫第6小時開始表達(dá)。OS-GT07和OS-GT28高溫脅迫沒有發(fā)生表達(dá)量變化，這2個成員不響應(yīng)高溫脅迫。

◆.GT Ⅰ 家族成員；●.miRNA?！?GT Ⅰ family members；●.miRNA.

縱坐標(biāo)是GT Ⅰ 家族成員。紅色表示高表達(dá)、藍(lán)色表示低表達(dá)。Vertical coordinates are GT Ⅰ family members.Red indicates high expression，blue indicates low expression.

橫坐標(biāo)代表高溫脅迫時間節(jié)點，分別代表0，1，3，6，12，24，36，48 h；縱坐標(biāo)是GT Ⅰ家族成員。紅色表示表達(dá)上調(diào)，藍(lán)色表示表達(dá)下調(diào)。

2.6 粳稻GT Ⅰ基因家族成員高溫脅迫表達(dá)分析

經(jīng)高溫處理后的材料中10個GT Ⅰ 基因家族成員的差異表達(dá)如圖8所示，GT Ⅰ 基因家族成員的表達(dá)量隨著高溫處理時間的變化而改變。高溫處理3 hOS-GT09的表達(dá)量達(dá)到最高，隨后其表達(dá)量隨著處理時間的延長逐漸降低；高溫處理0～6 hOS-GT01和OS-GT03基因的表達(dá)量不斷升高，發(fā)現(xiàn)6 h表達(dá)量達(dá)到最高；處理6 h后隨著處理時間的增加迅速減少。高溫處理3 hOS-GT19的表達(dá)量無明顯升高，在處理6 h開始表達(dá)量迅速上升，在處理24 h達(dá)到最高。高溫處理前6 hOS-GT29的表達(dá)量變化不大，隨著時間的延長表達(dá)量開始上升。OS-GT07和OS-GT11的表達(dá)量沒有因為高溫處理出現(xiàn)表達(dá)量明顯變化。有趣的是OS-GT16的表達(dá)量從高溫處理開始便開始逐步上升，處理12 h后趨于穩(wěn)定。OS-GT14和OS-GT22隨著高溫處理時間的延長，其相對表達(dá)量下降，其中OS-GT22在高溫處理第3小時開始，其表達(dá)被抑制。

圖8 GT Ⅰ基因家族成員在高溫處理的表達(dá)水平Fig.8 Expression levels of GT Ⅰ gene family members under high temperature treatment

2.7 粳稻GT Ⅰ 基因家族成員蛋白保守性分析

結(jié)構(gòu)決定功能，GT Ⅰ基因家族成員進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測和同源建模(圖9)。從圖9可以看出，GT Ⅰ基因家族成員蛋白質(zhì)具有一個保守的序列，相似的三維結(jié)構(gòu)。保守結(jié)構(gòu)的中心是6個β-折疊，其周圍分別由7個α-螺旋環(huán)繞。OS-GT24、OS-GT25、OS-GT26、OS-GT27、OS-GT28、OS-GT29和OS-GT30的蛋白質(zhì)作為蔗糖合成酶類，它們的三維結(jié)構(gòu)高度保守。其中OS-GT10、OS-GT11和OS-GT12建模之后的評估值反映出建模是成功的，結(jié)合三維結(jié)構(gòu)建模來看，它們之間的結(jié)構(gòu)是相當(dāng)保守且含有保守蛋白結(jié)構(gòu)。GT Ⅰ基因家族成員在進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測時，參與建模的GT Ⅰ 基因家族成員與對應(yīng)的同源模板重疊后參數(shù)見表4，其三維結(jié)構(gòu)的均方根差(RMSD)小于1，說明GT Ⅰ建模結(jié)果可靠。其中模板建模評分(TM-score)的值均大于0.5，說明GT Ⅰ 基因家族成員的三維建模是可信的。OS-GT11和OS-GT12的TM-score值為1，說明蛋白與模型完美匹配。這些蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型為它們的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

圖9 GT Ⅰ家族成員蛋白三維結(jié)構(gòu)Fig.9 Three-dimensional structure of GT Ⅰ family members proteins

表4 粳稻GT Ⅰ 基因家族建模預(yù)測比對參數(shù)Tab.4 Predicted alignment parameters by modeling the GT Ⅰ gene family in japonica rice

3 結(jié)論與討論

糖基轉(zhuǎn)移酶作為生物體內(nèi)催化糖基化關(guān)鍵酶，在植物體的能量轉(zhuǎn)移、物質(zhì)轉(zhuǎn)化，以及非生物脅迫響應(yīng)等方面發(fā)揮了重要作用[43]。鑒定出粳稻GT Ⅰ 基因家族的成員在生長發(fā)育中起到了重要作用。OS-GT18在編碼的硫代異鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶參與類黃酮代謝的糖基化反應(yīng)且影響水稻分蘗和結(jié)實。OS-GT26、OS-GT27、OS-GT28、OS-GT29和OS-GT30編碼的酶參與纖維素的合成，在水稻伸長組織中起重要作用，如根的伸長、葉和節(jié)間的發(fā)育等。且這些成員在逆境脅迫中起作用，在脅迫中表達(dá)量上升。另外OS-GT27和OS-GT28水稻灌漿過程中在穎果里強(qiáng)勢表達(dá)，這2個成員在灌漿時起重要作用。與水稻產(chǎn)量提升相關(guān)的GT Ⅰ 基因家族成員是OS-GT19，功能涉及水稻光系統(tǒng)Ⅱ、株高和分蘗等，在一定程度上影響了過氧化物積累，在葉片衰老過程中響應(yīng)光照的調(diào)控。GT Ⅰ基因家族成員大部分發(fā)揮的功能是UDP-糖基的轉(zhuǎn)移和糖原的磷酸化，為各種代謝途徑提供UDP-葡萄糖和果糖。OS-GT10是控制直鏈淀粉合成的主要基因，直接影響花粉和水稻種子胚乳的淀粉含量。由以上家族成員功能可知，GT Ⅰ基因家族在水稻發(fā)育和抗逆上有重要作用。在今后面對全球變暖所帶來的挑戰(zhàn)，GT Ⅰ基因家族其他成員在今后水稻改良農(nóng)藝性狀和提高水稻抗逆性方面成為可能。

GT Ⅰ基因家族成員在水稻12條染色體上均有分布，其蛋白產(chǎn)物長度雖然相差較大，但家族成員蛋白質(zhì)的定位主要在葉綠體、線粒體和胞質(zhì)，而這些部位為能量轉(zhuǎn)化以及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹饕獔鏊纱送茰y，GT Ⅰ基因家族在能量物質(zhì)轉(zhuǎn)化中起到了作用。如在擬南芥中有與OS-GT14同源的β-二半乳糖二酰基甘油合酶的缺失導(dǎo)致葉綠體膜脂成分改變，和光合復(fù)合體不穩(wěn)定導(dǎo)致光合作用減弱[44]。在GT Ⅰ 基因家族遺傳距離分析中，水稻GT Ⅰ 基因家族中存在5個同源基因，它們在進(jìn)化過程中均發(fā)生點突變，OS-GT28、OS-GT29和OS-GT30基本上還是保持穩(wěn)定的進(jìn)化。因此，它們之間的功能也是相似的，均屬于水稻蔗糖合成酶。同時這幾個家族成員的基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域也極為相似，有趣的是整個家族中保守基序都比較少(除去隸屬于水稻蔗糖合成酶類的成員)。不同物種的GT Ⅰ 基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系把它們分為3個亞家族。亞家族 Ⅰ 中，AT-GT01、AT-GT02和AT-GT03屬于UDP-甘油轉(zhuǎn)移酶基因，這3個基因在擬南芥生長發(fā)育過程中淀粉代謝、花粉發(fā)育和抗逆上發(fā)揮了作用[45-46]。第 Ⅰ 亞家族中粳稻GT Ⅰ 基因家族成員OS-GT01、OS-GT02、OS-GT03與擬南芥GT Ⅰ 基因家族成員的遺傳距離最近，且OS-GT01、OS-GT02、OS-GT03也是屬于UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。相關(guān)研究也表明，OS-GT03 在水稻花粉內(nèi)壁的形成和花粉成熟上發(fā)揮了作用[45-46]。在第 Ⅲ 亞家族中，AT-GT11和OS-GT26的遺傳關(guān)系很近，且均屬于蔗糖合成酶類，在植物體中都起到了纖維素合成的作用[47]。由此可以推測，GT Ⅰ 基因家族在各個植物中存在一定的保守性，這為植物GT Ⅰ 基因家族成員的功能研究提供了方向。

經(jīng)過啟動子分析得知，家族成員均響應(yīng)調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和響應(yīng)脅迫脫落酸(ABA)[48]，這進(jìn)一步表明，GT Ⅰ 基因家族成員在水稻生長發(fā)育和抵抗脅迫方面起到了重要作用。本研究通過水稻不同組織表達(dá)分析得知，GT Ⅰ 基因家族在水稻的各個部位的表達(dá)具有特異性。OS-GT27、OS-GT16和OS-GT01在葉鞘中呈現(xiàn)高表達(dá)，在擬南芥中與OS-GT01同源的基因LEW3的功能體現(xiàn)在缺失這一基因?qū)е轮仓甑挠越档?、纖維素的合成受損、另外次生細(xì)胞壁出現(xiàn)缺陷，木質(zhì)部塌陷[49]。根據(jù)OS-GT27蔗糖合成酶參與纖維素的合成推測，OS-GT01、OS-GT16和OS-GT27在水稻拔節(jié)期提高表達(dá)讓水稻在生長過程中滿足纖維素的合成，維持次生細(xì)胞壁的穩(wěn)定。在高溫處理中，OS-GT14和OS-GT22在高溫脅迫下呈現(xiàn)負(fù)調(diào)控，其表達(dá)量是隨著高溫處理的時間下降，說明這2個成員的表達(dá)是受高溫抑制的。與OS-GT14同源的擬南芥AtDGD1基因主要參與葉綠體內(nèi)囊體薄膜成分合成，過表達(dá)AtDGD1基因提升擬南芥耐高溫能力[50-51]。OS-GT26、OS-GT29在高溫脅迫處理第6小時開始高表達(dá)，這2個成員作為蔗糖合成酶確實在抵抗逆境脅迫上起作用。通過對日本晴GT Ⅰ基因家族成員在高溫脅迫下的表達(dá)模式探究，發(fā)現(xiàn)GT Ⅰ基因家族的成員中OS-GT07和OS-GT11不響應(yīng)高溫脅迫。OS-GT29和OS-GT22作為蔗糖合成酶基因在高溫處理6 h后持續(xù)高表達(dá)，OS-GT14隨著處理時間的延長表達(dá)量下降?？芍狦T Ⅰ基因家族的大部分成員在水稻應(yīng)對高溫脅迫的分子機(jī)制中發(fā)揮了作用，一定程度上為GT Ⅰ基因家族成員在水稻耐高溫機(jī)制研究上提供了方向。

本研究通過GT Ⅰ基因家族成員蛋白質(zhì)建模可知，家族成員的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是保守的，與系統(tǒng)發(fā)育、保守基序和基因結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果較一致。結(jié)構(gòu)決定功能，這30個家族成員中蔗糖合成酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)高度相似，其建模的評分反映著蛋白與模型之間完美重合，說明這種建模的方法是可行的。通過已知蛋白的結(jié)構(gòu)來匹配筆者研究的蛋白，為更好地研究GT Ⅰ 基因家族成員的生物學(xué)功能提供了重要線索。