邵 穎，黃 燕，楊 艷，龔柳菲，宋祥軍，涂 健，祁克宗

(安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036)

禽白血病病毒(Avianleukosisvirus，ALV)是可引起家禽的淋巴性白血病和髓樣性白血病等腫瘤疾病的致癌逆轉錄病毒，是給全球范圍內(nèi)家禽產(chǎn)業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失的病原體之一[1-4]。ALV天然條件下僅傳染雞，以垂直傳播為主要的傳播形式，會導致病雞的免疫防控能力降低，進一步造成患病雞多重傳染[5]。依據(jù)病毒包膜糖蛋白的抗原構造、宿主范疇以及不同毒株之間的彼此干擾等，可將ALV劃分為A～K 11個亞群[6]，其中J亞群(ALV-J)危害最大，給全球范圍內(nèi)家禽產(chǎn)業(yè)帶來了不可估計的損失[7-9]。ALV的編碼區(qū)含編碼基因gag、pol和env共 3個，ALV-p27存在于gag基因上并在ALV各亞群中有高度的同源性和保守性，其翻譯的p27蛋白是病毒的核心蛋白，是免疫學方法檢測ALV選擇的主要抗原成分[10-11]。

ALV實驗室常用的檢測方法有病毒分離、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、間接免疫熒光測定(IFA)、聚合酶鏈式反應(PCR)，一般都對專業(yè)操作要求高、操作復雜且儀器昂貴，不適用于大規(guī)模的臨床檢測[12-14]。此外，由于某些內(nèi)源性逆轉錄病毒(例如EAV-HP家族)可能表達p27蛋白，因此它會導致檢測的假陽性高[15]，所以，迫切需要一種用于診斷ALV的快速和準確的方法。

即時檢驗(Point-of-care testing，POCT)是在現(xiàn)場使用便攜式分析儀和快速診斷套件進行的實時檢查，相比實驗室檢查的繁瑣，其操作簡便、耗時短、不需要專業(yè)技術人員操作，可實現(xiàn)樣本的快速檢測[16-18]。目前，POCT技術已研發(fā)出一系列產(chǎn)品在多個領域得到初步推廣，未來發(fā)展前景良好[19]。熒光免疫層析技術(Lateral flow immunoassay，LFIA)是基于抗原抗體特異性免疫反應的新型膜檢測技術。其基本原理是將特異性識別待檢物質(zhì)的抗原(或抗體)和二抗分別固定在硝酸纖維素膜(NC膜)上，形成檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)，以ALV的p27蛋白制備多克隆抗體，從而建立熒光微球免疫層析試紙條檢測，檢測過程操作簡單，靈敏度高[20]。

因此，本研究通過制備禽白血病病毒p27多克隆抗體為基礎，初步建立了POCT熒光微球免疫層析定性檢測ALV的方法，旨在為禽白血病的檢測提供一種更為簡便的方法，為基層獸醫(yī)臨床檢測提供便利。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

pGEX-6P-1質(zhì)粒、pET-32a(+)質(zhì)粒、大腸桿菌、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞、禽白血組織樣品均由獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室保存，山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG均購于上海碧云天生物科技有限公司。

試驗動物，1只2 kg左右的新西蘭白兔，6只BALB/c小鼠飼養(yǎng)在動物科技學院動物房。

硝酸纖維素膜(NC膜)、PVC底板、吸水紙、樣品墊均為必歐瀚生物技術(合肥)有限公司提供。

主要試劑：2×Taq Master Mix、Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase、SYBR Green Ⅰ熒光染料，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HRP標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗鼠IgG、Protein A+G Agarose購自上海碧云天生物科技有限公司；未標記羊抗小鼠IgG購自博士德生物有限公司。

1.2 p27基因的擴增和重組質(zhì)粒的構建

參考本實驗室保存的pGEX-6p-1、pET-32a線性化質(zhì)粒，利用Oligo軟件設計帶同源臂的p27的特異性引物，送到上海生工生物工程技術服務有限公司合成，以本實驗室保存的ALV-p27基因為模板，PCR擴增目的片段。引物序列如下(劃線部分為同源臂序列)：

32a-p27-F：CAAGGCCATGGCTGATATCATGCCTGT

AGTGATTAAGACAG；32a-p27-R：CGGAGCTCGAATTCG

GATCTTAGGCCGCGGCTATGCCT。

6P-1-p27-F：TCCCGGGTCGACTCGAGATGCCTG

TAGTGATTAAGACAG；6P-1-p27-R：TCCCGGGTCGA

CTCGAGTTAGGCCGCGGCTATGCCT。

反應完成后，回收帶同源臂的目的片段，與本實驗室保存的線性化pGEX-6P-1、pET-32a質(zhì)粒載體分別進行連接，配成10 μL體系。再將PCR管置于冰上冷卻5 min后，加入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，混勻加入700 LB培養(yǎng)基，5 000 r/min離心3 min。取沉淀涂布在含有Amp抗性的LB平板上。PCR篩選出的陽性質(zhì)粒，抽提質(zhì)粒，將提取質(zhì)粒的DNA轉化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，用含Amp的平板進行過夜培養(yǎng)，挑取單菌落擴增培養(yǎng)后，PCR鑒定后由公司測序，驗證序列的正確性。

1.3 誘導表達重組蛋白

分別取1 mL經(jīng)鑒定過的含陽性重組質(zhì)粒pET-32a-p27和pGEX-6P-1-p27的BL21菌液轉接到含Amp(1 μg/mL)LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、200 r/min的搖床振蕩培養(yǎng)3～4 h，至OD值達到0.4～0.6即可；加入誘導劑(IPTG)至終濃度為0.5 mmol/L，放入16 ℃、120 r/min的搖床培養(yǎng)16 h。空質(zhì)粒菌液作為對照菌。離心收集菌體，PBS重懸菌體后超聲破碎至澄清，分別收集全菌液、沉淀、上清進行SDS-PAGE電泳，對其表達情況與可溶性進行分析。

16 ℃下IPTG誘導16 h的空載質(zhì)粒溶液、未誘導陽性重組菌溶液、誘導后陽性重組菌溶液、誘導后的上清和沉淀進行SDS-PAGE凝膠電泳后，進行考馬斯亮藍染色。

1.4 重組蛋白的純化

分別將帶有His標簽的p27蛋白和帶有GST標簽的重組蛋白，按照His柱標簽蛋白純化試劑盒和GST柱標簽蛋白純化試劑盒說明書進行純化操作，用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。

1.5 多克隆抗體的制備與鑒定

免疫之前分別對小鼠、白兔進行采血，分離出陰性血清-80 ℃保存?zhèn)溆?。然后按照BCA試劑盒測定His-p27蛋白與GST-p27蛋白的濃度，用PBS進行稀釋處理。首次免疫，His-p27融合蛋白與弗氏完全佐劑等量混合，振蕩儀振蕩乳化，不會分層即可，免疫BALB/c小鼠7只，每只小鼠100 μg，背部多點皮下注射；14 d后第2次免疫，融合蛋白與弗氏不完全佐劑等容量混合，同樣處理后，每只小鼠50 μg，背部注射；每隔14 d免疫1次，一共免疫5次。最后一次向腹腔注射融合蛋白。結束后分離陽性血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。GST-p27蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混勻后，注射新西蘭大白兔1只，7 d 1次，共5次。心臟采血，分離陽性血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 血清型效價的測定

首先確定GST-p27蛋白與His-p27蛋白最佳包被濃度，根據(jù)最佳稀釋比例分別測定鼠源多克隆抗體和兔源多克隆抗體的血清效價。分別將純化后的GST-p27蛋白與His-p27蛋白用包被液進行梯度稀釋，置于37 ℃恒溫箱2 h。每孔加入 PBST、封閉液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱 2 h。棄去封閉液，洗滌3次。分別向酶標板中加入100 μL按梯度稀釋的鼠血清和兔血清作為待測樣品，以鼠陰性血清、兔陰性血清作為陰性對照，37 ℃恒溫箱放置1 h。鼠血清中加入100 μL按1∶5 000稀釋的HRP標記山羊抗鼠IgG，兔血清中加入100 μL按1∶5 000稀釋的HRP標記山羊抗兔IgG，37 ℃恒溫箱放置1 h。避光加入100 μL TMB顯色液，避光反應30 min。每孔加入100 μL反應終止液終止反應。使用酶標儀在450 nm波長下讀數(shù)。計算分析 P/N值確定融合蛋白最佳包被濃度。根據(jù)最佳包被濃度測定抗體效價。陽性血清與陰性血清按照 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800梯度稀釋。按照上述試驗步驟，最后得到數(shù)值計算分析P/N值，確定多克隆抗體效價。

1.7 多克隆抗體的Western Blot鑒定

用pGEX-6p-1空載質(zhì)粒菌液作為對照，對鼠源多克隆抗體GST-p27蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳。轉印到PVDF膜，加入封閉液37 ℃ 2 h，用一抗稀釋液1∶500稀釋鼠血清，以1∶5 000稀釋HRP標記的山羊抗鼠IgG 為二抗，充分洗滌后，ECL避光顯色。用pET-32a空質(zhì)粒菌液作為對照，對兔源多克隆抗體His-p27蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳。轉印到 PVDF 膜，加入封閉液37 ℃ 2 h，以1∶500稀釋的兔血清為一抗，以加入1∶5 000稀釋HRP 標記的山羊抗兔IgG 為二抗。充分洗滌后，用ECL避光顯色。

1.8 POCT試紙條的制備

按照 Protein A/G說明書對兔源多克隆抗體與鼠源進行純化，確定用鼠源多克隆抗體偶聯(lián)熒光微球，取500 μL的初洗緩沖液對熒光微球進行初洗、活化后，取沉淀加入含鼠源多克隆抗體偶聯(lián)緩沖液混勻，進行偶聯(lián)，超聲重懸2 min，恒溫搖床2 h，1 h超聲重懸1次。偶聯(lián)結束后取沉淀依次加入微球封閉液和微球稀釋液超聲重懸2 min，即為熒光微球包被的鼠源多克隆抗體，4 ℃避光保存。利用三維噴點平臺將稀釋好的鼠源多克隆抗體標記微球溶液噴涂到5 mm的玻璃纖維膜上，37 ℃烘箱過夜。將純化后的兔源多克隆抗體IgG、山羊抗兔用抗體稀釋液分別稀釋，用劃膜儀將稀釋好的兔源多克隆抗體和的山羊抗兔劃到NC膜上，作為T線和C線，再進行試紙條的組裝。

1.9 POCT試紙的初步應用

用待測樣品滴加至不同pH值的試紙上，確定多克隆抗體包被的最適pH值。收集的不同禽白血病的陽性樣本、禽腺病毒的血清、組織稀釋液PBS，分4組檢測。向樣品孔加入80 μL待檢樣品，每隔30 s加另一個樣本，15 min后，將試紙條插入熒光讀數(shù)儀，在電腦上觀察結果，對NC膜上T峰和C峰的面積進行匯總，計算T/C值。

2 結果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構建與鑒定

2.1.1 32a-p27同源臂和6P-1-p27同源臂的擴增 帶pET-32a同源臂特異性引物，擴增出pET-32a-p27基因片段，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在730 bp附近出現(xiàn)明顯條帶，與預期目的條帶大小一致(圖1)。

M.DL2000 plus Marker；1，2.pET-32a-p27目的片段。M.DL2000 plus Marker；1，2.pET-32a-p27 target fragment.

帶pGEX-6P-1同源臂特異性引物，擴增出pGEX-6P-1-p27基因片段PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在730 bp左右出現(xiàn)目的片段，與預期目的條帶大小一致(圖2)。

2.1.2 pET-32a-p27和pGEX-6P-1-p27重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-p27的篩選 重組質(zhì)粒菌液經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在720 bp附近出現(xiàn)明顯條帶，與預期目的條帶大小一致，符合預期結果(圖3)。

重組質(zhì)粒pET-32-p27的菌液經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在720 bp附近出現(xiàn)明顯條帶，與預期目的條帶大小一致(圖4)。

M.DL2000 plus Marker；1，2.pGEX-6P-1-p27目的片段。M.DL2000 plus Marker；1，2.pGEX-6P-1-p27 target fragment.

M.DL2000 plus Marker；1—3.pGEX-6P-1-p27重組質(zhì)粒。M.DL2000 plus Marker；1—3.pGEX-6P-1-p27 DNA recombinant plasmid.

M.DL2000 plus Marker；1—3.pET-32a-p27重組質(zhì)粒。M.DL2000 plus Marker；1—3.pET-32a-p27 DNA recombinant plasmid.

2.2 重組質(zhì)粒原核表達產(chǎn)物分析

2.2.1 His-p27和GST-p27融合蛋白的誘導表達 如圖5所示，當誘導溫度16 ℃，IPTG 0.5 mmol/L，經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳顯示，His-p27融合蛋白表達產(chǎn)物主要以可溶性上清的形式存在。

10%的SDS-PAGE電泳表明，誘導溫度在28 ℃，IPTG為0.5 mmol/L時，可溶性目的蛋白的表達含量較高(圖6)。

M.蛋白分子量標準；1.pET-32a空質(zhì)粒；2.His-p27未誘導；3—5.His-p27全菌蛋白、上清和沉淀。

M.蛋白分子量標準；1—3.0.5 mmol/L IPTG，誘導溫度分別為16，28，37 ℃的上清蛋白；4—6.0.5 mmol/L IPTG，誘導溫度分別為16，28，37 ℃的包涵體；7—9.0.5 mmol/L IPTG，誘導溫度分別為16，28，37 ℃的全菌蛋白。

2.2.2 His-p27和GST-p27融合蛋白的純化 當溫度

為16 ℃，IPTG 濃度為0.5 mmol/L，His-p27融合蛋白純化的條帶清晰且無雜帶，達到預期效果(圖7)。

M.蛋白分子量標準；1.上清；2—3.流穿液；4—9.洗脫蛋白。圖8同。M.Protein Marker weight standard；1.Supernatant；2—3.Protein flow-through fluid；4—9.Eluted protein.The same as Fig.8.

對GST-p27融合蛋白進行純化，12.5%的SDS-PAGE電泳分析純化效果，如圖8所示，在28 ℃，IPTG 0.5 mmol/L，目的條帶明顯且無雜帶，洗脫結果良好。

4—8.洗脫蛋白。4—8.Eluted protein.

2.3 多克隆抗體的鑒定

2.3.1 鼠源多克隆抗體血清效價的測定 用間接ELISA方法檢測最后一次免疫后小鼠的血清，結果顯示(表1)，抗原最佳稀釋度為1∶1 600；在該抗原稀釋濃度下測定鼠源多克隆抗體血清效價，結果(表2)顯示，當血清稀釋比例為1∶819 200時P/N為5.81>2，1∶1 638 400時P/N為1.10<2，所以鼠源多克隆抗體血清效價為1∶819 200。試驗證明，制備鼠源多克隆抗體的免疫原活性良好，可刺激小鼠產(chǎn)生免疫反應，可用于后續(xù)試驗。

表1 鼠源抗原稀釋度Tab.1 Mouse-derived antigen dilution

2.3.2 兔源多克隆抗體血清效價的測定 兔血清進行間接ELISA試驗，結果顯示(表3)，抗原最佳稀釋度為1∶1 600；在該抗原稀釋濃度下測定兔源多克隆抗體血清效價，結果顯示(表4)，當血清稀釋比例為1：409 600時P/N為4.33>2，1∶819 200時P/N為1.95<2，所以兔源多克隆抗體血清效價為1∶409 600。試驗證明，制備兔源多克隆抗體的免疫原活性良好，可刺激兔產(chǎn)生免疫反應，從兔血清分離出良好的多抗用于后續(xù)試驗。

表2 鼠源多克隆抗體血清效價Tab.2 Mouse-derived polyclonal antibody serum titer

表3 兔源抗原稀釋度Tab.3 Rabbit-derived antigen dilution

表4 兔源多克隆抗體血清效價Tab.4 Rabbit-derived polyclonal antibody serum titer

2.3.3 鼠源多克隆抗體Western Blot鑒定 如圖9所示，鼠源多克隆抗體與GST-p27融合蛋白在52 ku結合良好，表明鼠源多克隆抗體的反應性和特異性良好。

1.pGEX-6P-1；2.GST-p27蛋白。1.pGEX-6P-1；2.GST-p27 protein.

2.3.4 兔源多克隆抗體Western Blot鑒定 如圖10所示，兔源多克隆抗體與His-p27融合蛋白在44 ku結合良好，表明兔源多克隆抗體的反應性和特異性良好。

1.pET-32a；2.His-p27蛋白。1.pET-32a；2.His-p27 protein.

2.4 禽白血病病毒POCT檢測方法的建立

2.4.1 鼠源多克隆抗體-微球包被條件的確定 熒光免疫分析儀測定儀測定結果讀數(shù)如表5所示，微球偶聯(lián)鼠源多克隆抗體的最適pH值為6.2。

2.4.2 POCT試紙條的臨床檢驗及其圖譜分析 將收集來的不同樣本用試紙條進行檢測，熒光免疫分析儀分析結果，將電腦顯示的T、C面積數(shù)據(jù)進行整理。圖11中T峰為直線，該檢測樣本與T線上的兔源多克隆抗體無免疫反應，該樣本為陰性；圖12中T峰有明顯的起峰，證明樣本中與T線上兔源多克隆抗體反應，該樣本為陽性；圖13中 T峰有微弱的起峰，證明樣本中與T線上兔源多克隆抗體反應，但是樣本中抗原含量不高。

2.4.3 POCT試紙條臨床檢測數(shù)據(jù)分析 表6顯示，該POCT試紙條的特異性良好，禽白血的陽性樣品與熒光微球包被的鼠源多克隆抗體結合良好，其T/C數(shù)據(jù)比其他樣本高，而其他樣本與微球上的鼠源多克隆抗體不結合，無T峰，T/C趨近于0。穩(wěn)定性良好，重復4組，每組數(shù)據(jù)差異不大。

表5 POCT試紙條讀數(shù)結果Tab.5 POCT test paper reading results

2.4.4 POCT試紙條臨床檢驗 圖14-A是試紙條的內(nèi)部結構；圖14-B是組裝完畢的試紙條。取病禽組織樣本滴入樣品孔中，靜置 15 min后，用紫外聚光燈照射試紙條，可見熒光條帶，圖14-C表明，無論滴入的樣本是否和熒光微球包被的鼠源多克隆抗體結合，C線(質(zhì)控線)在紫外燈的照射下均有熒光條帶；僅有陽性樣本和熒光微球包被的鼠源多克隆抗體結合后，在紫外燈的照射下，C線(質(zhì)控線)和T線(檢測線)才均會有熒光條帶。

圖11 陰性結果Fig.11 Negative result

圖12 陽性結果Fig.12 Positive result

圖13 弱陽性結果Fig.13 Weak positive

表6 POCT試紙條讀數(shù)結果Tab.6 POCT test paper reading results

3 結論與討論

禽白血病是腫瘤性疾病，其主要導致髓細胞瘤病和生理血管瘤。自1988年，ALV-J首次從患有髓樣白血病的肉型雞中分離出來，這種新型的ALV迅速在世界各地傳播。因為尚無針對ALV的有效藥物和疫苗，因此，目前的預防主要取決于檢測和淘汰，建立無外源ALV的家禽群。目前，針對ALV-p27抗原建立的ELISA試劑盒價格昂貴，不適合大規(guī)模檢驗，所以建立一種新型快速便捷的檢測方法至關重要。POCT是在醫(yī)學實踐中使用便攜式分析儀和快速診斷工具進行的實時檢查，是當前在臨床實驗室檢驗市場中發(fā)展最快的新型檢測方法。

A.試紙條組裝；B.試紙條成品；C.加入樣本后紫外燈照射下試紙條結果。A.Test strip assembly；B.Test strip finished product；C.Add sample after ultraviolet lamp irradiation test strip result.

本研究成功擴增出ALV-p27的目的片段，克隆至pET-32a和pGEX-6P-1質(zhì)粒，構建2個重組質(zhì)粒，轉化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中表達目的蛋白。重組蛋白的表達量與溫度、時間、IPTG的濃度以及轉速都有關，本試驗通過摸索不同的表達條件，最終使得2種融合蛋白均在上清中得到了良好的表達。將純化后的His-p27融合蛋白與佐劑等容量混合后作為免疫原免疫BALB/c小鼠，制備鼠源多克隆抗體，并用GST-p27蛋白交叉檢測小鼠的血清效價以及進行Western Blot檢測。同理，將純化后的GST-p27蛋白作為免疫原免疫新西蘭白兔，制備兔源多克隆抗體，并用His-p27蛋白交叉檢測新西蘭白兔的血清效價以及進行Western Blot檢測，以此避免標簽蛋白的表達造成的假陽性結果。選擇制備2個不同的多抗來代替單克隆抗體進行POCT試紙條的組裝，是由于與制備單克隆抗體相比，制備多克隆抗體所花的時間和成本更少，且多克隆抗體的“多”克隆性允許結合靶標的多個抗原決定簇，這使得多克隆抗體在某些測定中對多種靶蛋白、細胞或生物體更加敏感[21]。

本試驗選擇鼠源多克隆抗體和熒光微球偶聯(lián)噴涂到結合墊，兔源多克隆抗體IgG作為檢測線包被到NC膜上；其次，要選擇合適pH值的包被稀釋液包被鼠源多克隆抗體，使熒光微球更容易和鼠源多克隆抗體結合，提高包被的成功率；兔源多克隆抗體作為檢測線(T線)，要摸索最佳的劃線濃度，濃度太低，導致熒光微球-鼠源多克隆抗體-抗原無法與兔源多克隆抗體結合，紫外燈下產(chǎn)生假陰性效果；最后，羊抗鼠IgG作為測試線(C線)，是評判試紙條質(zhì)量的好壞重要標準，所以確定最佳劃線濃度尤為重要。濃度太低，無法顯色，直接判斷試紙條無法使用；濃度太高，導致大部分熒光微球-鼠源多克隆抗體和羊抗鼠IgG結合，只有小部分熒光微球-鼠源多克隆抗體和兔源多克隆抗體結合，在紫外燈下，T線亮度很低，C線過亮，電腦結果顯示，與T/C面積比值小，造成弱陽性甚至假陰性結果。肉眼觀察，無論滴入的樣本是否和熒光微球包被的鼠源多克隆抗體結合，C線在紫外燈的照射下均發(fā)出熒光；僅有陽性樣本和熒光微球包被的鼠源多克隆抗體結合后，在紫外燈的照射下，C線和T線才均會發(fā)出熒光；若C線未發(fā)出熒光，而T線發(fā)出熒光，表明試紙條損壞，檢測結果不具有說服力。

本研究基于多抗包被在試紙條，組織研磨液作為待檢樣本，靈敏度和特異性有待提高，而且作為現(xiàn)場檢測的便攜式儀器，可以將多抗轉換成單抗或者提高包被濃度和劃線濃度以提高檢測的靈敏度和特異性。