劉風(fēng)翔，何 帥，張禮豪，黃 霞，宋一之

中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所醫(yī)用檢驗(yàn)技術(shù)研究室，江蘇 蘇州 215163

引 言

微生物在自然界中廣泛存在，具有個(gè)體小、分布廣、種類多、生長(zhǎng)繁殖速度快等特點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)、環(huán)保等諸多領(lǐng)域扮演著重要角色。隨著基因組學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)以及顯微技術(shù)等學(xué)科與技術(shù)日益成熟，微生物的研究?jī)r(jià)值越發(fā)凸顯。在幾萬種微生物中，只有一少部分微生物會(huì)造成人和動(dòng)物感染繼而引發(fā)疾病，這部分微生物被稱為病原微生物，由病原微生物感染而引發(fā)的疾病在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域極為常見[1]。由于其種類具有多樣性，加之不時(shí)出現(xiàn)新的病原體，給臨床診斷帶來了巨大困難[2]?？股厥侵委煾腥拘约膊〉闹匾幬铮陌l(fā)現(xiàn)有效控制了病原微生物的感染，挽救了數(shù)以億計(jì)的生命[3]。與此同時(shí)，抗生素的長(zhǎng)期使用和濫用會(huì)使病原菌的藥物敏感性降低，甚至消失。微生物檢驗(yàn)是對(duì)感染性疾病進(jìn)行臨床診斷的重要依據(jù)，傳統(tǒng)的臨床病原菌診斷主要依賴于細(xì)菌培養(yǎng)。這種檢驗(yàn)方法耗時(shí)較長(zhǎng)，在無法快速鑒別致病菌及檢測(cè)其藥物敏感性的情況下使用抗生素，加速了病原菌耐藥性的產(chǎn)生，甚至導(dǎo)致耐藥菌株不斷蔓延傳播。有研究指出：2000年至2015年期間，各國(guó)平均抗生素消費(fèi)率從每天每1千名居民16.4次已增長(zhǎng)至20.9次[4]。由于抗生素的濫用，導(dǎo)致了對(duì)多種抗生素耐藥的“超級(jí)細(xì)菌”產(chǎn)生，并且已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。世界衛(wèi)生組織在2016年引用Mullard[5]的報(bào)告指出，因耐藥細(xì)菌感染導(dǎo)致死亡人數(shù)約每年70萬例，至2050年，每年將有超過100萬人死于耐藥菌感染。盡管圍繞病原微生物檢測(cè)的技術(shù)已有大量的研究報(bào)道，但目前已有的檢測(cè)方法尚不能實(shí)現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)。因此，病原微生物的高靈敏度無損檢測(cè)與鑒定一直都是微生物相關(guān)行業(yè)的主要研究方向。

拉曼光譜技術(shù)是一種對(duì)樣品進(jìn)行原位、非侵入性、無標(biāo)記的檢測(cè)技術(shù)，可快速、無損地對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行表征及鑒定。通過對(duì)特定光譜信息進(jìn)行識(shí)別，可以高特異性的對(duì)細(xì)胞內(nèi)分子變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，同時(shí)由于水幾乎沒有拉曼峰，對(duì)檢測(cè)結(jié)果干擾性極小，因此該技術(shù)非常適合用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究[6]。拉曼光譜在單細(xì)胞水平上提供了微生物細(xì)胞中不同生物分子的指紋圖譜信息，通過這些信息可以確定微生物的種類、生理特征和突變表型等。此外，拉曼光譜技術(shù)對(duì)樣本的狀態(tài)沒有限制，固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)樣本均可以進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)，且可以對(duì)微量樣本進(jìn)行檢測(cè)，可用于鑒別生物組織微小變化。

本文對(duì)病原微生物檢測(cè)技術(shù)及現(xiàn)狀進(jìn)行調(diào)研分析，簡(jiǎn)單概述了拉曼光譜技術(shù)的原理，并在文章第四部分進(jìn)一步對(duì)拉曼光譜技術(shù)在病原微生物檢測(cè)中的研究進(jìn)展展開討論，就其在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 病原微生物檢測(cè)的意義及現(xiàn)狀

傳統(tǒng)的臨床微生物檢測(cè)方法通常需要數(shù)個(gè)小時(shí)，極大降低了臨床病原微生物的快速檢測(cè)和鑒定的有效性與實(shí)用性。由于廣譜抗菌藥物的濫用，病原微生物的耐藥率逐年遞增[7]。

在實(shí)際的臨床檢驗(yàn)中，病原微生物的分離、鑒定均需要培養(yǎng)，而培養(yǎng)時(shí)間往往需要數(shù)天，甚至數(shù)周。并且有些病原微生物的培養(yǎng)條件極其苛刻，甚至無法被培養(yǎng)[2]。所以，微生物快速精準(zhǔn)檢測(cè)是臨床醫(yī)學(xué)重要研究方向。

目前，主要的病原微生物檢測(cè)方法包括分子遺傳學(xué)、表型鑒定法和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)法(MALDI-TOF)等。分子遺傳學(xué)鑒定法可以達(dá)到核酸層面的鑒定，它主要針對(duì)的是質(zhì)粒DNA或病原菌染色體的檢測(cè)，包括堿基含量測(cè)定、基因芯片、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、核酸分子雜交以及全基因組測(cè)序等[8]。這些方法都有各自獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，但存在檢測(cè)過程中不穩(wěn)定、檢測(cè)結(jié)果容易受外界條件干擾、檢測(cè)步驟繁瑣、檢測(cè)敏感程度低、檢測(cè)操作水平要求高和檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng)等缺點(diǎn)[9]。表型鑒定法能夠達(dá)到細(xì)胞組分、蛋白質(zhì)、生理生化和形態(tài)這3個(gè)層面的鑒定，目前MALDI-TOF和全自動(dòng)生化鑒定都被臨床大量應(yīng)用。MALDI-TOF是一種軟電離質(zhì)譜技術(shù)，該技術(shù)采用軟件和參考數(shù)據(jù)庫相結(jié)合的方法對(duì)病原微生物進(jìn)行檢測(cè)[10]。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)一般依靠細(xì)菌的參考圖譜對(duì)細(xì)菌的種類進(jìn)行鑒定，但是存在少部分遺傳背景相似的菌株較難判斷的情況。全自動(dòng)病原微生物生化鑒定系統(tǒng)需要將細(xì)菌過夜培養(yǎng)形成菌落才能夠滿足檢測(cè)分析的基本條件，且數(shù)據(jù)庫中的病原菌種類有限進(jìn)而導(dǎo)致了該系統(tǒng)應(yīng)用上的局限性[11]。全自動(dòng)藥敏分析也是基于表型的病原菌診斷方法，與手工藥敏相比縮短了檢測(cè)時(shí)間并提高了檢測(cè)通量，但病原菌培養(yǎng)和增殖步驟的檢測(cè)流程仍然緩慢。因此，研發(fā)新的病原微生物快速檢測(cè)和鑒定技術(shù)具有重要意義。

2 拉曼光譜技術(shù)原理

為了對(duì)微生物進(jìn)行更加深入的探究，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家研究了許多光譜技術(shù)，其中最具代表的為拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)[12]。拉曼光譜的概念由印度物理學(xué)家Raman在1928年首次提出，隨著激光技術(shù)的迅速發(fā)展，拉曼光譜技術(shù)也隨之得到了廣泛應(yīng)用。當(dāng)光照射到物質(zhì)表面時(shí)會(huì)發(fā)生散射現(xiàn)象，有部分光波頻率發(fā)生了變化產(chǎn)生非彈性散射，這種非彈性散射光被稱為拉曼光譜。在散射過程中，入射光與物質(zhì)相互作用，物質(zhì)內(nèi)部分子與光子發(fā)生了能量交換，改變了出射光的能量，即光子的頻率發(fā)生了改變，此頻率變化的差值稱為拉曼位移[13]。拉曼位移僅取決于散射分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，可為分子定性分析提供依據(jù)[14]。生物大分子(如糖類、蛋白質(zhì)、脂類、核酸等)中不同化學(xué)鍵及官能團(tuán)的振動(dòng)頻率，對(duì)應(yīng)著不同的拉曼位移，這就意味著拉曼光譜可以提供待測(cè)樣品分子成分和結(jié)構(gòu)的指紋圖譜，可用于分析檢測(cè)生物組織生化成分以及探索生物分子結(jié)構(gòu)。

拉曼光譜通過提供待測(cè)樣品中各成分分子的振動(dòng)光譜信息，對(duì)樣品成分進(jìn)行精確分析，以此鑒別不同的細(xì)胞組織。近年來，圍繞拉曼光譜技術(shù)衍生發(fā)展出許多亞技術(shù)，如表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)、傅里葉變換拉曼光譜(FT-Raman)、激光共振拉曼光譜(RRS)、共聚焦顯微拉曼光譜等相關(guān)技術(shù)。傅里葉變換拉曼光譜技術(shù)[15](FT-Raman)是在傳統(tǒng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)收集到的拉曼信號(hào)進(jìn)行了傅里葉變換處理，此技術(shù)對(duì)樣品本身熒光干擾進(jìn)行了改善，并且具有檢測(cè)速度快、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)。表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)[16](SERS)主要針對(duì)于拉曼信號(hào)較弱的不足進(jìn)行了改進(jìn)，將待測(cè)物分子吸附在金、銀等貴重金屬膠?；虼植诘募{米金屬表面，使待測(cè)物的拉曼信號(hào)增強(qiáng)了106～1015倍，大大提高了檢測(cè)靈敏度。激光共振拉曼光譜技術(shù)(RRS)是當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)與待測(cè)物分子電子躍遷波長(zhǎng)相同時(shí)發(fā)生的，該分子的某幾個(gè)特征帶的拉曼信號(hào)強(qiáng)度比常規(guī)散射要高出約106倍，靈敏度得到了極大的提升，更加適用于生物大分子的檢測(cè)[17]。共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)[18](CRM)是將共焦光學(xué)顯微技術(shù)與拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)結(jié)合起來的一種新技術(shù)，利用光學(xué)顯微物鏡將激光光束聚焦至待測(cè)樣品表面上一點(diǎn)，從而減小了外部環(huán)境對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，還可以通過調(diào)節(jié)激光聚焦深度的檢測(cè)模式，分析不同深度的物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。這些技術(shù)憑借著其無破壞性、非接觸性、穩(wěn)定且可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展迅速。作為一種多功能的生物醫(yī)學(xué)分析工具，拉曼光譜技術(shù)在細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀察、疾病的診斷及檢測(cè)、病原微生物的鑒定及藥物敏感性檢測(cè)等方面具有極大潛力。拉曼光譜技術(shù)能夠?qū)ι倭课⑸飿颖具M(jìn)行快速、準(zhǔn)確、無損的檢測(cè)，在病原微生物檢測(cè)、疾病診斷等領(lǐng)域得到了迅速發(fā)展。全細(xì)胞拉曼光譜指紋圖譜包括了細(xì)胞內(nèi)所有的生物信息，包括蛋白質(zhì)、脂類以及糖類等，可以通過對(duì)這些生物大分子的含量與結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定分析，確定微生物種類、生理特征以及突變表型，最終完成對(duì)病原微生物的鑒定[19]。

3 拉曼光譜應(yīng)用于病原微生物檢測(cè)的研究進(jìn)展

拉曼光譜技術(shù)作為一種對(duì)物質(zhì)結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成以及生長(zhǎng)代謝過程進(jìn)行分析檢測(cè)的手段，被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)的研究領(lǐng)域中。隨著以拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)為核心的亞技術(shù)誕生，改善了以往拉曼光譜技術(shù)信號(hào)強(qiáng)度弱的不足，實(shí)現(xiàn)了對(duì)微生物高精度的快速檢測(cè)分析。

3.1 病原微生物的分類與鑒定

近年來，在細(xì)菌分類和鑒定的臨床醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域涌現(xiàn)了許多以細(xì)菌培養(yǎng)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)技術(shù)，如質(zhì)譜法、熒光法、PCR技術(shù)等，但這些方法均存在操作繁瑣、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)等問題。拉曼光譜蘊(yùn)含著細(xì)胞中豐富的生化信息，如核酸、糖類、蛋白質(zhì)等，可作為“生化指紋”解釋細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)構(gòu)組成、代謝活性以及生理狀態(tài)。大量的研究表明拉曼光譜技術(shù)可直接對(duì)細(xì)菌感染的臨床樣品進(jìn)行非接觸快速檢測(cè)，這也使其成為了病原微生物無損分析檢測(cè)領(lǐng)域的焦點(diǎn)。

陳雪萍[20]構(gòu)建了無標(biāo)記的基于AgNPs+的表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(SERS)檢測(cè)方法，結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行種屬鑒定。并對(duì)耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌與甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌的差異特征進(jìn)行分析。得出結(jié)論：基于AgNPs+的SERS檢測(cè)方法可探測(cè)到單個(gè)細(xì)菌的信號(hào)；耐藥菌株與敏感菌株的拉曼光譜譜峰的位置、強(qiáng)度和相對(duì)強(qiáng)度比例均有差異。陶站華[21]等利用光鑷?yán)庾V技術(shù)研究吲哚對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞中葡萄球菌黃素合成的抑制作用。結(jié)果表明：光鑷?yán)庾V技術(shù)可作為分析葡萄球菌黃素含量的有效方法。針對(duì)耐藥白色念球菌的鑒別與對(duì)不同機(jī)理抗菌藥的快速分類研究，李皓[22]對(duì)SERS進(jìn)行了改進(jìn)，提出了動(dòng)態(tài)表面增強(qiáng)拉曼光譜法(D-SERS)，即當(dāng)納米溶膠與待測(cè)分子溶液混合時(shí)就開始進(jìn)行光譜采集，完成濕態(tài)到干態(tài)的動(dòng)態(tài)采集過程，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此檢測(cè)方法準(zhǔn)確度較高，對(duì)臨床用藥具有很大意義。董金穎[23]在實(shí)驗(yàn)中選用10株標(biāo)準(zhǔn)純菌株，利用共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析，得出結(jié)論：拉曼光譜可以應(yīng)用于同種病原菌水平上的鑒定。此外，還利用共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)對(duì)等比例混合培養(yǎng)的鮑曼不動(dòng)桿菌與大腸埃希菌進(jìn)行了檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)物與純標(biāo)準(zhǔn)菌株的拉曼光譜存在細(xì)微差別。邵琳[24]等對(duì)腸炎沙門氏菌的高效檢測(cè)方法進(jìn)行研究，將其分別與三條適配體結(jié)合，選用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行信號(hào)采集，結(jié)果可以看出光譜在735 cm-1處有峰形尖銳的明顯特征峰，此處特征峰歸屬為胞嘧啶與尿嘧啶的代謝產(chǎn)物。對(duì)5種細(xì)菌混合培養(yǎng)后進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，通過特征峰強(qiáng)度的對(duì)比能夠在混合樣品中準(zhǔn)確檢測(cè)出目標(biāo)細(xì)菌腸炎沙門氏菌。得出結(jié)論：這種檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于腸炎沙門氏菌的高效檢測(cè)。單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)還可用于鑒定血液透析用水中的病原微生物，Montanari[25]等選用288份血液透析用水中分類出的146株酵母菌，采用單細(xì)胞拉曼技術(shù)結(jié)合經(jīng)典微生物檢測(cè)技術(shù)的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定分析，并與標(biāo)準(zhǔn)菌株的拉曼光譜進(jìn)行了比較，成功鑒定出了待測(cè)樣本中的菌株。蘇永波[26]等使用便攜式拉曼儀器對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及變形桿菌分別進(jìn)行了信號(hào)采集，得出結(jié)論：三種細(xì)菌特征峰位置及強(qiáng)度均有明顯差異，因此SERS可用于此三類細(xì)菌的鑒別。有研究表明，表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)可為鑒別大腸桿菌與志賀氏菌病原體研究與應(yīng)用提供依據(jù)。呂璞等[27]曾選擇大腸桿菌與志賀氏菌作為研究樣本，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，在600～700 cm-1拉曼圖譜范圍內(nèi)兩種菌的光譜圖可見明顯差異，且重現(xiàn)性良好。Stockel[28]等人對(duì)26種不同的分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)分類，每種待測(cè)樣本菌選用50～100個(gè)完整的細(xì)胞進(jìn)行研究，通過單細(xì)胞拉曼技術(shù)檢測(cè)并根據(jù)拉曼信號(hào)特征峰差異進(jìn)行分析，成功區(qū)分了26種樣本，且準(zhǔn)確率高達(dá)94%?？梢娎庾V技術(shù)可為鑒定密切相關(guān)菌提供有效的鑒定方法。宋一之等[29]將單細(xì)胞拉曼光譜與機(jī)器學(xué)習(xí)模型結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了免培養(yǎng)和免染色的細(xì)菌革蘭氏染色分類鑒定預(yù)測(cè)，準(zhǔn)確率甚至可高達(dá)100%，并且可以在尿液和血液感染樣品中成功應(yīng)用。

3.2 病原微生物藥物敏感性研究

病原菌藥敏試驗(yàn)是對(duì)病原菌進(jìn)行抗生素敏感度檢測(cè)，根據(jù)其對(duì)不同抗生素的藥敏檢測(cè)結(jié)果，有選擇性地指導(dǎo)患者用藥。目前，臨床診斷藥敏試驗(yàn)需要檢測(cè)病原微生物抗生素最小抑制濃度，此過程往往需要2～5 d的時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)及分析。拉曼光譜技術(shù)具有超強(qiáng)的分辨能力，可以快速、非破壞性的對(duì)病原菌代謝活性進(jìn)行檢測(cè)。相較于傳統(tǒng)方法，該技術(shù)無需制備樣品、無需進(jìn)行微生物培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，使其成為了最適用于微生物耐藥性檢測(cè)的重要方法。

Berry[30]等發(fā)現(xiàn)，具有代謝活性的細(xì)菌可以被重水標(biāo)記，其單細(xì)胞拉曼光譜中出現(xiàn)碳-氘化學(xué)鍵的特征峰(C-D峰)，因此首次提出了重水標(biāo)記結(jié)合拉曼光譜技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌代謝活性的檢測(cè)。2017年，宋一之等[31]提出：耐藥菌的識(shí)別可以通過檢測(cè)重水和抗生素同時(shí)作用后細(xì)菌單細(xì)胞拉曼的C-D峰實(shí)現(xiàn)，這一方法不需要對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化和增殖，因此可用于耐藥菌的原位識(shí)別。Tao等[32-33]采用該方法，對(duì)導(dǎo)致齲齒的口腔微生物樣本在抗菌藥物作用后進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，能夠無損且定量的對(duì)口腔藥物的藥效進(jìn)行評(píng)價(jià)，并提出了細(xì)菌代謝活性最小活性抑制劑濃度這一藥敏評(píng)價(jià)的指標(biāo)，但也發(fā)現(xiàn)氨芐西林等抗生素盡管抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但不抑制細(xì)菌單細(xì)胞代謝活性。Yang[34-35]等將該技術(shù)用于評(píng)價(jià)尿液病原菌的藥敏，發(fā)現(xiàn)僅需檢測(cè)40倍最小抑菌濃度抗生素作用后細(xì)菌單細(xì)胞的C-D峰強(qiáng)度特征，就可以快速判斷病原菌對(duì)該抗生素的敏感性。Hong[36]等將氘標(biāo)記與受激拉曼光譜技術(shù)結(jié)合，檢測(cè)與萬古霉素混合培養(yǎng)的腸球菌對(duì)含氘葡萄糖進(jìn)研攝取后細(xì)胞內(nèi)的C-D鍵拉曼強(qiáng)度，判斷細(xì)胞代謝活性。宋一之團(tuán)隊(duì)[29]發(fā)現(xiàn)將抗生素與重水在不同時(shí)間點(diǎn)加入菌液或標(biāo)本，可以減小氨芐西林等抗生素對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和代謝活性抑制效果的差異，提高了該技術(shù)在藥敏檢測(cè)中的準(zhǔn)確率，建立了快速拉曼藥敏(FSAST)檢測(cè)方法。通過采集3 000多個(gè)實(shí)驗(yàn)組的拉曼光譜，該團(tuán)隊(duì)證明FRAST方法可直接用于真實(shí)尿液和血液標(biāo)本，其藥敏結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)總體一致率大于88%，尿液和血液藥敏檢測(cè)的時(shí)間可以分別縮短至3和21 h。上述研究證明了重水標(biāo)記拉曼光譜術(shù)具有普遍適用性，可推廣至所有微生物細(xì)胞及對(duì)細(xì)胞代謝水平產(chǎn)生影響的藥物的檢測(cè)。

非同位素標(biāo)記拉曼光譜技術(shù)也被應(yīng)用于微生物藥敏檢測(cè)。付世杰[37]通過體外拉曼光譜檢測(cè)與體內(nèi)成像動(dòng)物檢測(cè)模型實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌對(duì)抗生素敏感性的快速評(píng)價(jià)，研究采用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)快速評(píng)價(jià)了不同濃度種類的抗生素對(duì)細(xì)菌活性的影響。此外，還發(fā)現(xiàn)了抗生素在低濃度的條件下不能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，反而會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌增多的現(xiàn)象，這對(duì)臨床藥物評(píng)價(jià)具有指導(dǎo)意義。Germond[38]等通過實(shí)驗(yàn)篩選出11株對(duì)不同抗生素產(chǎn)生抗體的大腸桿菌作為研究對(duì)象，采用非標(biāo)記的方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，預(yù)測(cè)了大腸桿菌獲得性耐藥的拉曼光譜標(biāo)識(shí)，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，耐藥基因的表達(dá)與拉曼特征峰強(qiáng)度具有明顯相關(guān)性(p<0.05)。Kelly[39]等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌發(fā)酵代謝產(chǎn)生的氣體在金銀納米粒子表面會(huì)解離為甲基硫，吸附在表面形成的金硫鍵或者是銀硫鍵都可以產(chǎn)生極強(qiáng)的拉曼信號(hào)。采用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)氣體產(chǎn)生量，可以間接的檢測(cè)出細(xì)菌活性。蘇藍(lán)[40]對(duì)兩種常見致病菌進(jìn)行了光譜檢測(cè)與分析。采用SERS技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，可以根據(jù)特征峰的位置與強(qiáng)度對(duì)其進(jìn)行區(qū)分。此外，還將SERS技術(shù)應(yīng)用于對(duì)致病菌以及其耐藥菌株的快速鑒別，為臨床病原菌快速檢測(cè)以及個(gè)體化用藥提供了理論依據(jù)。對(duì)于拉曼檢測(cè)技術(shù)的可靠性驗(yàn)證，劉曉瑩[7]在其研究中利用抗生素誘導(dǎo)篩選了金黃色葡萄球菌的耐藥菌株，并且結(jié)合最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)、藥敏紙片、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、SERS技術(shù)以及激光共聚焦顯微拉曼技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行了耐藥性鑒定以及方法學(xué)驗(yàn)證。得出結(jié)論：SERS技術(shù)在檢測(cè)抗生素敏感菌與致病菌方面具有很高的有效性和可靠性，為SERS技術(shù)在臨床病原微生物耐藥性檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

以上研究均可表明：拉曼光譜技術(shù)作為一種快速、準(zhǔn)確和靈敏的微生物表型表征方法，在病原微生物快速鑒定以及藥敏檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。近年來，隨著光譜技術(shù)的迅速發(fā)展，對(duì)拉曼檢測(cè)技術(shù)的研究逐漸步入成熟期，但將其廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)，仍存在一定的改進(jìn)空間，隨著光譜技術(shù)的發(fā)展和更精確靈敏光學(xué)元件的開發(fā)，病原微生物的快速精準(zhǔn)檢測(cè)也將指日可待。

4 總結(jié)與展望

拉曼光譜技術(shù)在生物領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其是在病原微生物檢測(cè)方面優(yōu)點(diǎn)突出。拉曼光譜技術(shù)可直接對(duì)細(xì)菌感染的臨床樣品進(jìn)行非接觸快速檢測(cè)。相較于傳統(tǒng)方法，拉曼光譜技術(shù)具有無需制備樣品、無需進(jìn)行微生物培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，使其成為了適用于微生物耐藥性檢測(cè)的重要方法。拉曼光譜檢測(cè)方法將臨床標(biāo)準(zhǔn)藥敏所需的48 h縮短至2.5 h內(nèi)完成，為臨床快速診斷與精準(zhǔn)用藥提供了依據(jù)。拉曼光譜檢測(cè)成功克服傳統(tǒng)檢測(cè)的缺點(diǎn)，所需的樣品量少、標(biāo)本鑒定預(yù)處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)能力強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)特異性強(qiáng)、對(duì)于被測(cè)物無損傷、分離和鑒定可以同時(shí)進(jìn)行。首先，大量生物學(xué)信息的處理需要更加智能化的分析系統(tǒng)和數(shù)據(jù)庫。目前大量光譜數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)模型的建立仍需依賴專業(yè)的生物信息團(tuán)隊(duì)。近年來不同的光譜分析軟件和數(shù)據(jù)庫的紛紛涌現(xiàn)，這代表著智能化、便捷的分析方法已經(jīng)成為研發(fā)人員關(guān)心的問題，隨著研究成果的逐漸成熟將極大推動(dòng)該方法的臨床應(yīng)用。其次，單細(xì)胞拉曼技術(shù)各項(xiàng)操作的標(biāo)準(zhǔn)化有待進(jìn)一步建立。目前拉曼光譜檢測(cè)方法不統(tǒng)一，不同類型樣本背景信號(hào)對(duì)不同檢測(cè)方法的干擾存在差異，導(dǎo)致樣本的前期處理、參數(shù)設(shè)置等存在一定差異，這些差異極大地限制了在拉曼光譜技術(shù)臨床應(yīng)用中的標(biāo)準(zhǔn)化。同種拉曼檢測(cè)方法的操作標(biāo)準(zhǔn)化、不同種檢測(cè)方法的結(jié)果差異比對(duì)將是拉曼光譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床的最大問題。綜上所述雖然拉曼光譜技術(shù)存在一些問題但它在臨床病原微生物檢測(cè)上具有非培養(yǎng)、高保護(hù)性、高特異性、快速性、高效性、低成本和高效分離細(xì)胞建立微生物表型的優(yōu)勢(shì)，使其在臨床微生物檢測(cè)領(lǐng)域具有極大的發(fā)展?jié)撃?，值得深入研究?/p>