李俊雯，朱明明，吳夢(mèng)琪，周旭東，張文清

（華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237）

羅漢菜（Thlaspi arvense L.）為十字花科遏藍(lán)菜屬植物，學(xué)名菥蓂，別名遏藍(lán)菜、敗醬草、苦芥子、瓜子草等，分布廣泛，因其蓮座葉生長(zhǎng)像疊羅漢而得名。羅漢菜全株和種子均可藥用，全株具有清肝明目、和中解毒的功能，用于治療目赤腫痛、消化不良、脘腹疼痛等病癥，其種子還可治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰痛、急性結(jié)膜炎、胃痛等病癥[1]。研究表明，羅漢菜籽中富含亞油酸、亞麻酸、神經(jīng)酸等脂肪酸，其中神經(jīng)酸對(duì)中樞系統(tǒng)疾病、腦血管疾病都有積極作用[2]。但神經(jīng)酸無(wú)法通過(guò)人體自身產(chǎn)生，需從外界攝取獲得[3]。由于羅漢菜籽油中含有豐富的神經(jīng)酸，可達(dá)到3.66%左右，因此可作為神經(jīng)酸開(kāi)發(fā)的原料[4]。

目前常見(jiàn)的分離混合脂肪酸的方法有，尿素包合法[5-6]，超臨界 CO2萃取技術(shù)[7]，低溫結(jié)晶法[8]、分子蒸餾法[9-10]等。尿素分子在結(jié)晶過(guò)程中能與直鏈脂肪酸分子形成六面體結(jié)晶體，飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸易于形成尿素包合物；高不飽和脂肪酸因不飽和度高，空間結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，不易形成尿素包合物。尿素包合法具有操作簡(jiǎn)便，試劑可回收等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于混合脂肪酸分離。分子蒸餾又叫短程蒸餾，是一種特殊的液-液分離技術(shù)，極高真空度下，依據(jù)混合物分子運(yùn)動(dòng)的平均自由程差別，在遠(yuǎn)低于其沸點(diǎn)的溫度下將其分離。與普通真空蒸餾相比，分子蒸餾能避免熱分解，精準(zhǔn)精餾，減少了重要成分的損失。尿素包合法與分子蒸餾法聯(lián)用被越來(lái)越多地應(yīng)用于混合脂肪酸的純化[11-12]。

本研究以羅漢菜籽為研究對(duì)象，以有機(jī)溶劑提取法提取油脂，皂化后得到混合脂肪酸。通過(guò)對(duì)分子蒸餾溫度的單因素探究，確定最佳的分子蒸餾工藝。在此基礎(chǔ)上，用正交試驗(yàn)探究尿素包合法的主要因素（尿脂比、料液比、包合溫度）對(duì)神經(jīng)酸含量和回收率的影響，分析分子蒸餾與尿素包合法聯(lián)用對(duì)混合脂肪酸中神經(jīng)酸富集的影響。研究旨在為神經(jīng)酸生產(chǎn)利用提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅漢菜籽：上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，除雜、浮選去除品質(zhì)較差的菜籽，干燥后粉碎，過(guò)40目篩，放入干燥器內(nèi)備用；甲醇（分析純）：上海阿拉丁試劑有限公司；尿素、氫氧化鈉、乙醇、鹽酸、乙酸乙酯、正庚烷（均為分析純）、甲醇（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；硫酸（優(yōu)級(jí)純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R213B）：上海申生科技有限公司；油浴鍋（DF-101S）：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；冷凍干燥機(jī)（Scient2-10N）：寧波新芝生物科技股份公司；分析天平（ME104）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超純水儀（Master-15）：上海和泰儀器有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS，6890N-5975）：美國(guó)安捷倫有限公司；分子蒸餾裝置（VKL70-5）：德國(guó)VTA公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酸提取

以石油醚（60℃～90℃）為提取溶劑，將50 g羅漢菜籽加入到 400 mL 石油醚中[料液比為 1∶8（g/mL）]，加熱回流75 min，提取2次，過(guò)濾后將溶劑回收（110℃常壓蒸餾），得到油脂，出油率[13]按式（1）計(jì)算。

式中：m為混合脂肪酸質(zhì)量，g；M為羅漢菜籽油脂質(zhì)量，g。

1.3.2 脂肪酸組分分析

1.3.2.1 GC-MS條件

GC條件：HP-5MS型毛細(xì)管柱；載氣為高純氦氣（99.999%），柱前壓119.4kPa，柱內(nèi)載氣流量0.5mL/min；升溫程序：從180℃開(kāi)始，以3℃/min升溫到280℃，汽化室溫度為250℃；樣品進(jìn)樣量為1μL；分流比為50∶1。

MS條件：采用EI離子源，離子源溫度230℃，接口溫度270℃，溶劑延時(shí)3 min，電子能量70 eV，掃描范圍 30 amu～550 amu，分辨率 1 000。

1.3.2.2 配制樣品溶液

在2 g油樣中加入10 mL 2.5 mol/L的CH3ONa溶液，磁力攪拌并80℃加熱回流至溶液澄清透明，再加入15 mL 0.5 mol/L的H2SO4甲醇溶液煮沸10 min。樣品冷卻后加入25 mL蒸餾水混勻，采用少量多次的方式，每次加入20 mL正庚烷萃取后得到正庚烷的脂肪酸甲酯溶液。最后去離子水洗滌樣品至洗滌液呈中性，用無(wú)水硫酸鈉干燥，濾液旋蒸濃縮后得到混合脂肪酸甲酯溶液，稀釋100倍得供試液。

1.3.2.3 神經(jīng)酸含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：精密稱(chēng)取0.102 3 g神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇為溶劑，配制濃度約為4 mg/mL的神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確移取 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL 神經(jīng)酸

式中：γ為出油率，%；m為提取油質(zhì)量，g；M為投入原料質(zhì)量，g。

取100 g油脂于1 000 mL燒杯中，加入0.5 mol/L NaOH乙醇溶液800 mL，緩慢升溫至80℃，水浴攪拌1 h。待溫度降至室溫（25℃）后加入適量蒸餾水至溶液澄清，加入20%鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，轉(zhuǎn)入分液漏斗，加入乙酸乙酯，充分振蕩，靜置分層，保留乙酸乙酯層。將乙酸乙酯層加水洗至中性，去除水層，再加入適量無(wú)水硫酸鈉脫水，45℃旋蒸，回收乙酸乙酯，得到混合脂肪酸液，稱(chēng)重計(jì)算混合脂肪酸得率。標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行甲酯化處理，0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后再進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)。以神經(jīng)酸質(zhì)量（m）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，繪制神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.3 分子蒸餾法最適溫度的確定

稱(chēng)量250 g混合脂肪酸，在刮膜速度300 r/min、進(jìn)料速度5%、蒸餾壓力0.01 kPa、冷凝溫度40℃的條件下，考察蒸餾溫度從110℃～160℃對(duì)神經(jīng)酸含量和重組分得率的影響。選擇的兩個(gè)溫度作為一級(jí)蒸餾和二級(jí)蒸餾的蒸餾溫度并收集二級(jí)蒸餾產(chǎn)物。

1.3.4 尿素包合法純化神經(jīng)酸的條件優(yōu)化

稱(chēng)取分子蒸餾后所得混合脂肪酸1 g于三口燒瓶中，加入20 mL甲醇，并加入4 g尿素，80℃加熱回流至尿素溶解。待溶液澄清透明后停止回流，冷卻到室溫（25℃）。采用正交試驗(yàn)的設(shè)置條件，混合脂肪酸在-20℃下包合12 h，從冷凍層取出，迅速抽濾，用少量蒸餾水溶解濾餅，加入20%鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，通過(guò)石油醚少量多次萃取，并水洗石油醚層至中性，最后無(wú)水硫酸鈉干燥后過(guò)濾，濾液旋蒸濃縮后得富集脂肪酸。以神經(jīng)酸含量和回收率為指標(biāo)探究尿脂比、料液比及包合溫度對(duì)尿素包合法的影響，并驗(yàn)證其重復(fù)性。神經(jīng)酸回收率按式（3）計(jì)算。

式中：m1為包合后混合脂肪酸中神經(jīng)酸質(zhì)量，g；m2為包合前混合脂肪酸中神經(jīng)酸質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用GraphPad Prism 6.01軟件進(jìn)行作圖，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸組分分析

氣相色譜分析得到神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)品甲酯的保留時(shí)間為26.23 min，神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為A=57.476m+7.239 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，表明建立的神經(jīng)酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在2.046 mg～32.768 mg線(xiàn)性關(guān)系良好。

按1.3.1條件提取油脂，根據(jù)公式（1）計(jì)算出油率為22.38%，皂化后得到混合脂肪酸，根據(jù)公式（2）計(jì)算混合脂肪酸的得率為85.90%。羅漢菜籽油中的脂肪酸組成測(cè)定總離子流圖如圖1，各個(gè)脂肪酸的含量總結(jié)如表1。

圖1 羅漢菜籽油脂肪酸甲酯總離子流色譜圖Fig.1 The total ion chromatograms（TIC）of solvent extracted Thlaspi arvense Linn seed oils fatty acid methyl esters

表1 羅漢菜籽油中脂肪酸的種類(lèi)及含量Table 1 The Composition and content of solvent extracted Thlaspi arvense Linn seeds oil fatty acids

由表1可知，羅漢菜籽油中主要有6種脂肪酸，含量最高的為芥酸，其次為亞麻酸和亞油酸，神經(jīng)酸的含量達(dá)到6.40%。而神經(jīng)酸在元寶楓油中含量為5.52%，在其余草本植物種籽油中含量＜3%[14-15]。羅漢菜籽油原料的神經(jīng)酸含量還略高于已經(jīng)市場(chǎng)化的元寶楓油原料，故將以此法所得的混合脂肪酸作為后續(xù)分子蒸餾-尿素包合法聯(lián)用的原料。

2.2 分子蒸餾法純化神經(jīng)酸

按1.3.3中的條件，探究不同的蒸餾溫度對(duì)神經(jīng)酸含量和重組分得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同溫度下一級(jí)分子蒸餾對(duì)神經(jīng)酸含量和重組分得率的影響Fig.2 Effects of first level molecular distillation at different temperature on content of nervonic acid and yield of heavy component

由圖2可知，在110℃時(shí)分子蒸餾沒(méi)有進(jìn)行，原料全部進(jìn)入了重組分，并沒(méi)有達(dá)到分離的效果。110℃～140℃時(shí)神經(jīng)酸含量隨著溫度的升高而升高，當(dāng)140℃～160℃時(shí)隨著溫度的增加而下降，在140℃時(shí)神經(jīng)酸含量達(dá)到最大值14.18%，而重組分得率一直隨著溫度的增加而減少，在120℃～130℃和150℃～160℃時(shí)迅速下降。綜合神經(jīng)酸含量和重組分得率考慮，140℃時(shí)兩者都較高，為最佳的蒸餾條件，可以作為一級(jí)分子蒸餾的溫度；而150℃與160℃相比，雖然神經(jīng)酸含量的差距不大，但是重組分得率在160℃有較大下降，故選用150℃作為二級(jí)蒸餾條件。綜上所述，選用140℃和150℃作為一級(jí)分子蒸餾和二級(jí)分子蒸餾的溫度，進(jìn)行二次分子蒸餾對(duì)神經(jīng)酸進(jìn)行富集。

二次蒸餾后混合脂肪酸GC-MS總離子流圖如圖3所示，結(jié)果如表2所示。

“有，有，有！”蔣老一邊答應(yīng)，一邊跑進(jìn)房里，在衣柜中亂翻一氣，找出一件淡紅色連衣裙。敲響衛(wèi)生間的門(mén)，門(mén)開(kāi)了，紫云不小心探出半個(gè)身子。蔣老一陣眩暈，頓時(shí)覺(jué)得地板在搖晃。顧不得那么多，紫云索性沖出來(lái)，一下把他抱住，要不，他非倒地不可。

圖3 二次分子蒸餾前后脂肪酸甲酯總離子流色譜圖對(duì)比Fig.3 The comparison of TIC of methyl esters of fatty acids by two-levels molecular distillation

表2 分子蒸餾后的脂肪酸種類(lèi)和含量Table 2 The composition and content of fatty acids molecular distillation

對(duì)比表1和表2可知，經(jīng)過(guò)二次分子蒸餾后，重組分中相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)較小的組分大幅度減少，棕櫚酸含量降低至0.06%；神經(jīng)酸含量大幅度提高，從6.40%提高到了20.77%。

2.3 尿素包合法最佳工藝

以二次分子蒸餾的重組分作為尿素包合法的原料，探究尿脂比、料液比和包合溫度三者的影響，進(jìn)行正交試驗(yàn)。參考文獻(xiàn)[11-13]中相關(guān)條件，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表L9（33），正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表3。以純化后的神經(jīng)酸含量為考察指標(biāo)，探究最優(yōu)試驗(yàn)方案，結(jié)果如表4所示。

表3 正交試驗(yàn)的因素水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment

極差R的大小反映各因素對(duì)指標(biāo)的影響程度，由表4可知，對(duì)于神經(jīng)酸含量和回收率而言，極差均為RA＞RC＞RB，表明尿脂比對(duì)二者影響最大，其次是包合溫度，料液比對(duì)二者的影響相對(duì)較小。在方案A3B3C2下，其回收率為70.66%，神經(jīng)酸的含量為26.10%；而在方案A1B2C2下，回收率達(dá)96.45%，神經(jīng)酸的含量為21.00%。方案A1B2C2雖然回收率很高，但是相比于原料中神經(jīng)酸含量的20.77%，該工藝對(duì)神經(jīng)酸幾乎沒(méi)有富集效果。方案A3B3C2的回收率雖然略低于方案A1B2C2，但神經(jīng)酸含量提升較大，綜合二者考慮，選擇最佳條件為尿脂比 1.25∶1，料液比 1∶12（g/mL），包合溫度-10 ℃。在最優(yōu)方案的條件下平行做了3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The Results of orthogonal experiment

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The Results of verification experiment

由表5可知，神經(jīng)酸含量可達(dá)26.23%，回收率可達(dá)70.82%，結(jié)果說(shuō)明通過(guò)尿素包合法可以對(duì)分子蒸餾后混合脂肪酸中的神經(jīng)酸進(jìn)一步富集。

3 結(jié)論

本文采用有機(jī)溶劑法從羅漢菜籽中提取粗油，出油率為22.38%，采用分子蒸餾-尿素包合聯(lián)用的方法富集神經(jīng)酸。分子蒸餾試驗(yàn)中考察了蒸餾溫度對(duì)分離效果的影響，尿素包合試驗(yàn)中探究了尿脂比、料液比和包合溫度對(duì)分離效果的影響。分子蒸餾能去除與神經(jīng)酸相對(duì)分子質(zhì)量差異較大的物質(zhì)，而尿素包合法能去除飽和脂肪酸和一些低不飽和度的脂肪酸，兩者結(jié)合能使原料中的各類(lèi)物質(zhì)更好地分離。通過(guò)分子蒸餾結(jié)合尿素包合法也將神經(jīng)酸含量從6.40%提高至26.23%。本研究為羅漢菜的油脂工藝開(kāi)發(fā)提供了可靠的技術(shù)支持，為提高羅漢菜的綜合利用率提供了新思路。