鄭銳年 孫成暉 賈筠 林順歡 林欽雄 劉淳 郝艷艷 潘學兵 何宇 邵俊偉

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一[1]。雖然肝癌研究在診斷、治療和基礎(chǔ)研究方面均取得了長足的進步，但肝癌的預(yù)后并沒有得到顯著的改善，易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[2-3]上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在腫瘤轉(zhuǎn)移的多個步驟發(fā)揮了重要的作用[4]。在肝癌細胞轉(zhuǎn)移過程中，轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug、ZEB、Twist通過下調(diào)E-cadherin等黏附分子，并上調(diào)一系列金屬基質(zhì)硫蛋白酶MMP，促進肝癌轉(zhuǎn)移[5]。Wnt/beta-catenin信號通路是肝癌發(fā)生過程中所需的關(guān)鍵信號通路之一[6]。在肝癌中，beta-catenin 的活化可使得Wnt/beta-catenin信號異?；罨痆7-8]?；罨腷eta-catenin/TCF信號在肝癌細胞生長，遷移和轉(zhuǎn)移中都有重要功能[9]。ABT-737作為抗凋亡蛋白的小分子抑制劑，對肝癌細胞有一定的殺傷作用。姜黃素Curcumin是一種植物提取物，對多種腫瘤細胞均有抑制效果，其中包括肝癌。在前期研究中，筆者發(fā)現(xiàn)Curcumin可以協(xié)同ABT737激活JNK信號途徑，促進肝癌細胞的凋亡，從而抑制肝癌細胞HepG2的生長[10]。本研究以肝癌7404細胞為對象，并建立的肝癌動物模型(Alb-Cre；P53f/f；Ras)，探討Curcumin協(xié)同ABT-737作用對肝癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，并探討JNK-beta-catenin信號通路是否參與EMT轉(zhuǎn)化的影響，初步闡明Curcumin協(xié)同ABT-737對肝癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用，以期為肝癌的靶向治療提供一個新的方式。

資料與方法

一、一般資料

胎牛血清購自美國Gibco公司；青霉素和鏈霉素購自北京中山生物公司生物技術(shù)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；Curcumin(分子式C21H20O6，相對分子質(zhì)量368.4，純度≥99%)購自美國Sigma生物試劑公司；ABT-737購自美國Sigma-Aldrich公司；苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl nuoride，PMSF)購自上海浩然生物技術(shù)有限公司；ⅪPA裂解液和考馬斯亮藍G250購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗人Vimentin、N-cadherin、ZEB1、E-cadherin、p-beta-catenin、p-JNK、Snail、Twist和GAPDH多克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗、DAB顯色試劑盒均購自Biotechnology公司；Matrigel基質(zhì)膠購自北大醫(yī)學部細胞生物學實驗室。

二、研究方法

(一) 細胞、細胞培養(yǎng)及實驗動物 肝癌7404細胞由中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室惠贈。

8只4～6周齡肝癌動物模型(Alb-Cre;P53f/f;Ras)小鼠購自中國科學院上海實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2003-0003，平均體質(zhì)量為18～22 g。

(二) 細胞實驗分組及細胞形態(tài)學的改變 取對數(shù)生長期的7404細胞接種于6孔培養(yǎng)板中(2×105個/孔細胞)進行常規(guī)培養(yǎng)，次日細胞融合度達50%～70%時進行實驗。7404細胞實驗分4組：1% DMSO溶劑對照組、2 μmol/L Curcumin作用組、5 μmol/L ABT-737作用組和2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用組。收集藥物處理48 h后的各組細胞，在倒置顯微鏡下觀察各組7404細胞的生長狀態(tài)及形態(tài)學改變，并對其進行定量。

(三)細胞劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力 7404細胞接種于6孔培養(yǎng)板中(2×105個/孔細胞)進行常規(guī)培養(yǎng)24 h，細胞融合度達90%時，移液槍頭在直尺的協(xié)助下做劃痕，PBS洗滌3次，劃痕處未脫落細胞，隨后在顯微鏡下對劃痕進行拍照(0 h)。根據(jù)分組情況，加入相應(yīng)的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后再次置于顯微鏡下對劃痕進行拍照。計算各組劃痕面積修復(fù)率(%)=[劃痕創(chuàng)傷面積(0 h)-劃痕創(chuàng)傷面積(24 h)]/劃痕創(chuàng)傷面積(0 h)×100%，并實驗重復(fù)3次，計算平均值。以對照組劃痕面積修復(fù)率為100%，獲得各組細胞的相對遷移能力。

(四) 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細胞E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和ZEB1蛋白的表達

(1)細胞樣品100 μL含PMSF的RJPA裂解液，搖勻后在冰上放置30 min；離心后收集上清液，用考馬斯亮藍G250結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度。

(2)取總蛋30 μg/孔上樣，進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h。

(3) 洗滌后與特異性一抗：E-cadherin抗體、Vimentin抗體、N-cadherin抗體、ZEB1抗體和GAPDH內(nèi)參37 ℃反應(yīng)2 h后，4℃過夜；二抗孵育室溫2 h，DAB顯色。

(4)結(jié)果用TotalLab 2.0軟件進行灰度值分析，以目的蛋白條帶的灰度值/GAPDH蛋白條帶的灰度表示目的蛋白的相對表達水平,重復(fù)4次。

(五)蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細胞p-beta-catenin、p-JNK、Snail 和 Twist蛋白的表達

(1)細胞樣品100 μL含PMSF的RJPA裂解液，搖勻后在冰上放置30 min；離心后收集上清液，用考馬斯亮藍G250結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度。

(2)取總蛋30 μg/孔上樣，進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h。

(3) 洗滌后與特異性一抗：p-beta-catenin抗體、p-JNK抗體、Snail抗體、Twist抗體和GAPDH內(nèi)參37 ℃反應(yīng)2 h后，4 ℃過夜；二抗孵育室溫2 h，DAB顯色。

(4)結(jié)果用TotalLab 2.0軟件進行灰度值分析，以目的蛋白條帶的灰度值/GAPDH蛋白條帶的灰度表示目的蛋白的相對表達水平,重復(fù)4次。

(六)肝癌動物模型(Alb-Cre;P53f/f;Ras)的建立 通過將Alb-Cre工具鼠與P53f/f;Ras小鼠雜交形成。在Ras基因的前面有一個終止密碼子。在該終止密碼子作用兩側(cè)有兩個Loxp位點。在Alb-Cre作用下，剔除P53 的表達，同時激活Ras的表達，由此誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生。在小鼠4月齡時，通過灌胃的方式，對小鼠進行處理。小鼠分為兩組，每組4只，分別接受Curcumin協(xié)同ABT737[40 mg/(kg·d)+40 mg/(kg·d)]、以及對照生理鹽水藥物處理，共處理30 d。3個月后，處死小鼠，收集小鼠的肝組織，進行HE染色，檢測腫瘤數(shù)量，采用液基薄層制片(TCT)計算肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、Curcumin協(xié)同ABT-373抑制7404細胞遷移

在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，1% DMSO溶劑對照組、2 μmol/L Curcumin作用組、5 μmol/L ABT-737作用組的7404細胞拉長，由多邊形向長梭形轉(zhuǎn)變，細胞間隙增寬，細胞梭形化明顯；2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用組的7404細胞間隙增寬，有些細胞皺縮，細胞內(nèi)顆粒增多，折光性降低，細胞碎片增多。與1% DMSO溶劑對照組(290.25±13.23)、2 μmol/L Curcumin作用組(278.75±5.12)、5 μmol/L ABT-737作用組(269.00±8.83)比較，2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用組(152.00±11.05)7404細胞梭形化明顯減少(P<0.05) (圖1 A)。在細胞劃痕實驗中，2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用組較其他三組細胞的遷移能力顯著降低(P<0.05) (圖1 B)。

A：Curcumin協(xié)同ABT-373抑制7404細胞遷移，并對其進行定量；B：Curcumin協(xié)同ABT-373抑制7404細胞對劃痕面積的修復(fù)，并對其進行定量

二、 Curcumin協(xié)同ABT-373抑制原發(fā)性肝癌細胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)移

給藥治療30次后，取出肝臟，蘇木精伊紅染色并計數(shù)肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量，Curcumin + ABT-737治療組(7.25±4.03)肝癌動物模型(Alb-Cre;P53f/f;Ras)中肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量明顯小于對照組(25.25±6.40)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

Curcumin協(xié)同ABT-373抑制原發(fā)性肝癌細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移，并對在肝臟形成的轉(zhuǎn)移灶進行數(shù)量統(tǒng)計

三、 Curcumin協(xié)同ABT-737調(diào)控EMT相關(guān)分子的表達

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，相比1% DMSO溶劑對照組、2 μmol/L Curcumin作用組、5 μmol/L ABT-737作用組，2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用后，7404細胞中E-cadherin蛋白的表達水平明顯上調(diào)，Vimentin、N-cadherin、ZEB1蛋白的表達水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3 ，表1)。

表1 Curcumin，ABT-737對EMT相關(guān)蛋白的影響

2 μmol/L Curcumin協(xié)同5 μmol/L ABT-373在7404細胞中抑制間質(zhì)細胞標記分子Vimentin、N-cadherin、ZEB1的表達，上調(diào)上皮細胞的標記分子E-cadherin的表達。

四、 Curcumin協(xié)同ABT-737上調(diào)JNK1的磷酸化水平、beta-catenin的磷酸化水平，抑制Snail、Twist的表達

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，相比1% DMSO溶劑對照組、2 μmol/L Curcumin作用組、5 μmol/LABT-737作用組，2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用后，7404細胞中JNK1和beta-catenin的磷酸化水平明顯上調(diào)，Snail、Twist蛋白的表達水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4 ，表2)。

2 μmol/L Curcumin協(xié)同5 μmol/L ABT-373在7404細胞中抑制beta-catenin下游靶基因Snail、Twist的表達，上調(diào)beta-catenin和JNK的磷酸化水平。

表2 Curcumin，ABT-737對beta-catenin和JNK的磷酸化水平的影響

討 論

腫瘤細胞易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，其可以從原發(fā)灶脫落，侵襲基底膜，進而侵入血管、淋巴管或體腔形成微小轉(zhuǎn)移灶[11]。多項研究證實，EMT在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要角色，參與并促進腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移過程。

EMT是指上皮細胞在正常生理和特定病理情況下向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。發(fā)生EMT后，細胞極性喪失，排列變得紊亂；另外，上皮細胞標記物如E-cadherin、ZO-1、claudin-1等表達下調(diào)，而間質(zhì)細胞標記物如N-cadherin、Vimentin等表達升高。處于相對靜止的細胞變得活躍，并且常伴有穿透細胞外基質(zhì)的能力增強，提高了細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力[12]。本研究結(jié)果顯示，相比2 μmol/L Curcumin作用組、5 μmol/L ABT-737作用組，2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用后，7404細胞梭形化明顯減少(P<0.05)，細胞遷移能力顯著降低(P<0.05)，Vimentin、N-cadherin、ZEB1蛋白的表達水平明顯抑制(P<0.05)，E-cadherin蛋白的表達水平明顯上調(diào)(P<0．05)，而且，Curcumin + ABT-737治療組肝癌動物模型(Alb-Cre;P53f/f;Ras)中肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明Curcumin協(xié)同ABT-737能抑制肝癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

最新的研究表明，腫瘤細胞通過EMT還能獲得腫瘤干細胞的特性，而腫瘤干細胞的存在是化療耐藥及化療后腫瘤復(fù)發(fā)的的根本原因之一[13]。EMT過程主要通過調(diào)控Snail、Slug、ZEB、Twist等轉(zhuǎn)錄因子實現(xiàn)，這些轉(zhuǎn)錄因子通過下調(diào)E-cadherin等黏附分子，與肝癌轉(zhuǎn)移的密切相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737處理后，Snail、Twist，Vimentin、N-cadherin、ZEB1蛋白的表達水平明顯下調(diào)，而E-cadherin蛋白的表達明顯上升，而單獨處理這兩種藥物，這些蛋白的表達并沒有明顯改變，說明兩種藥物的聯(lián)用可以顯著抑制肝癌7404細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

在前期研究中，筆者發(fā)現(xiàn)Curcumin可以協(xié)同ABT-737抑制肝癌細胞HepG2的生長，與JNK信號途徑的激活有關(guān)。本研究結(jié)果表明，2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用后，7404細胞中JNK1和beta-catenin的磷酸化水平明顯上調(diào)，說明Curcumin協(xié)同ABT-737激活JNK-beta-catenin信號途徑，下調(diào)Snail、Twist蛋白的表達，進而上調(diào)E-cadherin蛋白的表達，且下調(diào)Vimentin、N-cadherin、ZEB1蛋白的表達，導(dǎo)致肝癌7404細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制，進而說明JNK-beta-catenin可能參與EMT轉(zhuǎn)化的抑制。

綜上所述，Curcumin協(xié)同ABT-737能抑制肝癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，JNK-beta-catenin可能參與EMT轉(zhuǎn)化的抑制。本研究結(jié)果為肝癌靶向EMT的治療提供了一種新的方式。