李嬌嬌 師豆豆 黃啟超 陶梅

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)目前是全球第六大最常見的癌癥和第三大癌癥死因[1]。由于肝癌的生物學(xué)特性，放射治療和化學(xué)療法不敏感，手術(shù)切除仍是最有效的肝癌治療方法，但幾乎70%的患者在切除后發(fā)展為復(fù)發(fā)性HCC[2]。因此,發(fā)現(xiàn)新的預(yù)后靶點(diǎn)，將有助于提高HCC患者生存率。

哺乳動(dòng)物體內(nèi)一共有26種脂酰輔酶A合成酶，其中長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶(ACSLs)主要負(fù)責(zé)活化最豐富的長(zhǎng)鏈脂肪酸(C12 ～ C20脂肪酸)，活化的脂酰輔酶A通過參與脂質(zhì)合成或脂質(zhì)氧化來(lái)發(fā)揮生物作用。ACSL1是ACSLs家族中第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的亞基，肝臟的ACSL1含量占ACSLs家族總含量的50%以上[3]。越來(lái)越多的研究表明，組織ACSL1的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中占據(jù)重要作用。比如，在結(jié)腸癌[4-5]、甲狀腺癌[6]、卵巢癌[7]中，ACSL1促進(jìn)癌細(xì)胞不受抑制的增殖，開啟不受調(diào)控的癌癥代謝，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移；在食管癌[8]、IDH1突變膠質(zhì)瘤[9]中，ACSL1與腫瘤的生存率和預(yù)后存在密切聯(lián)系。ACSL1在HCC中的作用尚不明確,且ACSL1在HCC中的表達(dá)情況尚存在爭(zhēng)議[10-11]。因此該研究通過檢測(cè)臨床HCC組織樣本ACSL1的表達(dá)并分析ACSL1對(duì)HCC患者預(yù)后的影響,在細(xì)胞層面觀察ACSL1對(duì)癌細(xì)胞增殖、凋亡、能量代謝的影響，初步探討ACSL1與HCC的關(guān)系及其對(duì)臨床診療的意義。

資料與方法

一、一般材料

(一)組織樣本及臨床病理資料 HCC手術(shù)組織及臨床資料來(lái)自空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院和唐都醫(yī)院2010年1月至2016年12月的HCC隊(duì)列，334例在肝膽外科診斷為HCC的癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織石蠟包埋組織。癌組織的石蠟包埋組織均經(jīng)病理檢查確認(rèn)，術(shù)前無(wú)放化療，不伴有其他惡性疾病。臨床資料包括患者的6年隨訪資料。該研究獲得空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

(二)主要材料及試劑 人HCC細(xì)胞株 SNU739由空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室贊助；胎牛血清、RPMI培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；ACSL1過表達(dá)的慢病毒質(zhì)粒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司；ACSL1抗體、MTS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海艾博抗貿(mào)易有限公司；β-actin 抗體和兔二抗購(gòu)自Cell Signaling Technology；免疫組化試劑盒、蛋白上樣Marker購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher 公司；DAB 顯色試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司；青鏈霉素混合液、Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、乳酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；XF測(cè)定培養(yǎng)基購(gòu)自Seahorse Bioscience公司；24孔海馬測(cè)定板購(gòu)自安捷倫科技公司。

二、研究方法

(一)免疫組化檢測(cè)癌組織與癌旁組織中ACSL1的表達(dá) 病理切片60 ℃恒溫箱烤片20 min；二甲苯浸泡脫蠟；無(wú)水乙醇和3種由高到低濃度酒精依次浸泡水化；自來(lái)水沖洗；檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)；PBS洗滌；H2O2水封閉內(nèi)源性過氧化物酶；PBS洗滌；山羊血清阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；ACSL1 抗體(1∶50)孵育，4 ℃過夜；PBS洗滌；生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG靜置孵育15 min；PBS洗滌；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液孵育20 min；PBS洗滌；鏡下DAB顯色觀察；蘇木精復(fù)染；自來(lái)水沖洗；1%鹽酸酒精分化；自來(lái)水返藍(lán)；酒精和無(wú)水乙醇依次浸泡脫水；二甲苯浸泡透明；中性樹膠封片；鏡下觀察：細(xì)胞染色強(qiáng)度判斷：陰性0分，弱陽(yáng)性1分，陽(yáng)性2分，強(qiáng)陽(yáng)性3分；細(xì)胞陽(yáng)性率判斷：<10%為0分，10%～30%為1分，31%～60%為2分，>60%為3分；細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性率的乘積為免疫結(jié)果，總分<2分為低表達(dá)，≥2分為高表達(dá)。

(二)細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染 配置含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素混合液的RPMI培養(yǎng)基，用于孵育SNU739細(xì)胞。把對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用Trypsin-EDTA消化；細(xì)胞計(jì)數(shù)；6孔板種植轉(zhuǎn)染(4×105/孔)：對(duì)照組(control)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒慢病毒，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染ACSL1過表達(dá)慢病毒；待細(xì)胞長(zhǎng)到50%時(shí)轉(zhuǎn)染慢病毒：948 μL常規(guī)RPMI培養(yǎng)基 +40 μL感染增強(qiáng)P液 +12 μL病毒液(病毒濃度為 108/mL)；8 h后更換培養(yǎng)基；72 h后用1 μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行抗嘌呤霉素細(xì)胞篩選，將其傳代培養(yǎng)。

(三)Western blot檢測(cè)SNU739癌細(xì)胞ACSL1的表達(dá) 提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞總蛋白；BCA法檢測(cè)樣本蛋白濃度；5×蛋白上樣緩沖液使蛋白變性；取35 μg蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳；250 mA、90 min恒流將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；10%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉 3 h；ACSL1 抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜；1×PBST 洗膜3次；二抗室溫孵育1 h；PBST 再次洗滌3次；HRP-ECL化學(xué)發(fā)光液顯影。

(四)MTS法檢測(cè)ACSL1對(duì)SNU739細(xì)胞增殖能力的影響 取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期癌細(xì)胞，Trypsin-EDTA消化；細(xì)胞計(jì)數(shù)使細(xì)胞懸液濃度為 2×104個(gè)/ mL，加入96孔板，100 μL/孔；37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育過夜，鏡下觀察；每孔加入20 μL的MTS(5 mg/mL)，孵育1 h；酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞吸光度值，記錄為起始值；同樣的方法分別在24、48、72、96 h檢測(cè)吸光度值。每組采用5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，記錄數(shù)據(jù)并繪制細(xì)胞增殖曲線。

(五)流式細(xì)胞儀檢測(cè)ACSL1對(duì)SNU739細(xì)胞凋亡的影響 取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期癌細(xì)胞，Trypsin-EDTA消化；細(xì)胞計(jì)數(shù)使細(xì)胞懸液濃度約為1×106個(gè)/mL；1 000 r/min，4 ℃離心10 min后收集細(xì)胞，棄培養(yǎng)基；用冷PBS 輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1 000 r/min， 4 ℃離心10 min后收集細(xì)胞，該步驟重復(fù)2次；200 μL 1×Binding Buffer 緩沖液懸浮細(xì)胞；向上述細(xì)胞懸液中加入10 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，4 ℃避光孵育30 min；加入20 μL PI輕輕混勻，4 ℃避光孵育15 min；1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

(六)Seahorse XF24分析儀檢測(cè)ACSL1對(duì)SNU739細(xì)胞OCR的影響 Seahorse XF24分析儀檢測(cè)前一天，在探針板中加入校正液后，放入37 ℃、無(wú)CO2的培養(yǎng)箱過夜進(jìn)行活化；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的癌細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種到24孔板中，在37 ℃、CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；第二天，細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，記錄時(shí)間，用XF測(cè)定培養(yǎng)基替換原來(lái)的培養(yǎng)基，將細(xì)胞板置于37 ℃無(wú)CO2的培養(yǎng)箱中1 h；正式測(cè)定前，進(jìn)行預(yù)測(cè)試以發(fā)現(xiàn)每種抑制劑的最佳濃度：寡霉素(oligomycin)3 μmol/L，三氟甲氧基羰基氰化物苯腙(FCCP)1 μmol/L，魚藤酮(ROT)4 μmol/L，抗霉素A 4 μmol/L；XF24細(xì)胞外通量分析儀上測(cè)量OCR，XF Cell Mito Stress Test Generator軟件分析整理數(shù)據(jù)結(jié)果。

(七)乳酸試劑盒檢測(cè)ACSL1對(duì)SNU739細(xì)胞乳酸的影響 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的癌細(xì)胞Trypsin-EDTA消化；PBS重懸，1 000 r/min，離心10 min，棄上清，留細(xì)胞沉淀；加入PBS緩沖液清洗1～2次，同樣1 000 r/min，離心10 min，棄上清液，留細(xì)胞沉淀；加入1%～2%的TritonX-100細(xì)胞裂解液0.2～0.3 mL, 4 ℃條件下裂解30～40 min，裂解好的液體不離心直接進(jìn)行測(cè)定；取96孔板和乳酸試劑盒，將裂解液和測(cè)試試劑于EP管內(nèi)混合，移入到96孔板；酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)510 nm測(cè)定吸光度值，計(jì)算各組細(xì)胞內(nèi)乳酸含量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)整理后，用SPSS 26.0和Graph Pad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料分析用χ2檢驗(yàn)；生存分析用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ACSL1在HCC癌組織及癌旁組織中的表達(dá)及癌組織中ACSL1與HCC患者臨床病理特征關(guān)系

免疫組化檢測(cè)顯示，癌組織中ACSL1染色大多為弱陽(yáng)性，而癌旁組織中大多為陽(yáng)性至強(qiáng)陽(yáng)性。癌組織及癌旁組織中 ACSL1 的免疫組化結(jié)果分別為3.02±2.57和7.60±3.34,癌組織的ACSL1表達(dá)顯著低于癌旁組織(t=20.040,P=0.000),見圖1。通過6年的隨訪資料，發(fā)現(xiàn)HCC中ACSL1表達(dá)與不同年齡存在相關(guān)性(P<0.000)，而與性別(P>0.05)、臨床分期(P>0.05)均無(wú)關(guān)，見表1。

圖1 HCC癌組織及癌旁組織ACSL1的表達(dá)

表1 ACSL1蛋白表達(dá)與HCC臨床病理特征關(guān)系

二、HCC預(yù)后單因素和多因素Cox分析

首先將已知的可能影響HCC預(yù)后的臨床資料進(jìn)行Cox單因素分析，發(fā)現(xiàn)ACSL1蛋白表達(dá)、TNM分期與HCC的預(yù)后有相關(guān)性(均P<0.1)，而性別、年齡與預(yù)后無(wú)關(guān)(均P>0.5)；再將與HCC預(yù)后相關(guān)的因素作為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)ACSL1蛋白表達(dá)水平是HCC患者生存的危險(xiǎn)因素(HR=1.642,P=0.012)，見表2。

表2 肝細(xì)胞癌患者預(yù)后單因素及多因素Cox分析

三、ACSL1對(duì)SNU739細(xì)胞增殖和凋亡的影響

Western blot驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組ACSL1蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組ACSL1蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，見圖2A；MTS法檢測(cè)ACSL1對(duì)SNU739細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組細(xì)胞顯著減弱(F=45.056 ，P=0.003)，見圖2B；Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測(cè)ACSL1對(duì)SNU739細(xì)胞凋亡影響，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)顯著高于對(duì)照組(t=13.886，P=0.000)，見圖2C、2D。

A.Western blot驗(yàn)證SNU739細(xì)胞過表達(dá)ACSL1；B.MTS法檢測(cè)ACSL1對(duì)HCC細(xì)胞增殖的影響；C.Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組ACSL1對(duì)HCC細(xì)胞凋亡的影響；D. Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測(cè)對(duì)照組ACSLI對(duì)HCC細(xì)胞凋亡的影響

四、ACSL1對(duì)SNU739細(xì)胞能量代謝的影響

Seahorse XF24分析儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞線粒體OCR，發(fā)現(xiàn)在加入FCCP后，隨著時(shí)間進(jìn)展，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞基礎(chǔ)氧耗速率(F=83.429,P=0.001)、最大氧耗速率(F=859.792,P=0.000)明顯高于對(duì)照組，解偶聯(lián)呼吸較對(duì)照組增強(qiáng)(F=11.579,P=0.027)，見圖3；乳酸試劑盒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞乳酸含量，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞乳酸含量低于對(duì)照組的(t=4.585，P=0.010)。

圖3 Seahorse XF24分析儀檢測(cè)ACSL1對(duì)HCC OCR的影響

討 論

HCC是由感染以及與慢性壞死性炎癥相關(guān)代謝物和毒物誘發(fā)的癌癥范例。盡管這些發(fā)現(xiàn)已轉(zhuǎn)為一級(jí)和二級(jí)預(yù)防措施，以及疾病的模型系統(tǒng)，但臨床上特征明顯的HCC預(yù)后仍然很差[1,12]。因此,發(fā)現(xiàn)新的HCC預(yù)后標(biāo)志物，將更有利于改善HCC患者的預(yù)后。生理?xiàng)l件下，ACSL1以ATP依賴的方式將特定的游離長(zhǎng)鏈脂肪酸活化為脂酰輔酶A，作為代謝變阻劑調(diào)節(jié)肝臟[13]、心臟[14]、骨骼肌[15]和脂肪組織[16]的脂質(zhì)代謝。研究表明，當(dāng)肝臟中ACSL1表達(dá)異常時(shí)，可使肝臟的脂質(zhì)代謝失調(diào)，導(dǎo)致肝臟功能異常，甚至發(fā)生肝惡變[17-18]。本研究旨在探討ACSL1在HCC中的表達(dá)及對(duì)HCC預(yù)后、HCC細(xì)胞株SNU739增殖和凋亡的影響，并且初步探究ACSL1在HCC中的作用機(jī)制。

Cui等[10]在探究肝癌中特異性過度表達(dá)的lncRNA(Highly upregulated in liver cancer ，HULC)對(duì)HCC脂質(zhì)代謝紊亂的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)ACSL1可被HULC顯著上調(diào)，并且免疫組化檢測(cè)ACSL1在臨床HCC組織樣本的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ACSL1在HCC癌組織中的表達(dá)強(qiáng)于癌旁組織。Muir等[11]報(bào)道，在磷酸酶和張力蛋白同系物(phosphatase and tensin homolog，Pten)誘導(dǎo)的小鼠HCC和小鼠非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)模型中，對(duì)小鼠HCC組織和NASH組織進(jìn)行廣泛質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)Pten缺失的HCC中，ACSL1 mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，并且與癌旁NASH組織相比，ASCL1在腫瘤組織中的表達(dá)也顯著降低。本研究通過免疫組化分析334例HCC患者癌組織及癌旁正常組織中ACSL1表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)癌組織中ACSL1的表達(dá)要較癌旁組織低；進(jìn)一步分析HCC中ACSL1表達(dá)與HCC臨床病理特征關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ACSL1的表達(dá)與HCC患者的年齡和臨床分期顯著相關(guān)，與其他臨床病理無(wú)相關(guān)；在 HCC預(yù)后單因素和多因素Cox分析中,發(fā)現(xiàn)ACSL1低表達(dá)的HCC患者預(yù)后更差，ACSL1蛋白表達(dá)水平是HCC患者生存的危險(xiǎn)因素。

Guo等[6]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌中小核仁RNA宿主基因7表達(dá)上調(diào)，可降低miR-449a表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)ACSL1促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和遷移，抑制癌細(xì)胞凋亡。Chen等為了驗(yàn)證ACSL1對(duì)大腸癌的致癌作用和對(duì)肺癌的抑制作用，將兩種表達(dá)ACSL1 shRNA的慢病毒顆粒分別導(dǎo)入大腸癌HCT116細(xì)胞和肺A549細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)ACSL1 shRNA抑制HCT116細(xì)胞的增殖，但促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖[19]。本研究在慢病毒構(gòu)建的ACSL1過表達(dá)SNU739細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)ACSL1可減弱SNU739細(xì)胞增殖能力，而顯著促進(jìn)其凋亡，說(shuō)明ACSL1在HCC的進(jìn)展中可能介導(dǎo)一種特定機(jī)制。

Cassim等證實(shí)HCC表現(xiàn)出普遍的糖酵解代謝，但在葡萄糖缺乏的情況下，脂肪酸氧化(fatty acid oxidation，F(xiàn)AO)被激活，可以為癌細(xì)胞供應(yīng)能量并促進(jìn)增殖[20]。 Sangineto等[8]報(bào)道，癌細(xì)胞中FAO被激活后，電子傳輸鏈的過度活性可能產(chǎn)生活性氧和氧化損傷，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。而在缺氧誘導(dǎo)因子-1α介導(dǎo)的FAO抑制，有利于肝癌細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)，但是在常氧條件下增強(qiáng)的FAO對(duì)肝癌的生長(zhǎng)沒有影響[21-22]?？梢姡現(xiàn)AO在HCC進(jìn)展中的作用和HCC所處的背景有很大的相關(guān)性，需要更廣泛的研究來(lái)了解癌癥代謝重新編程對(duì)FAO的影響。線粒體是細(xì)胞的能量加工廠，產(chǎn)生的 ATP為機(jī)體的基本生命活動(dòng)提供能量。本研究通過檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞的線粒體OCR和乳酸含量，初步探究ACSL1對(duì)HCC能量代謝的影響，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞線粒體OCR明顯高于對(duì)照組，而乳酸含量明顯低于對(duì)照組。提示與對(duì)照組細(xì)胞的糖酵解供能相比，ACSL1過表達(dá)的肝癌細(xì)胞能量供應(yīng)主要來(lái)源線粒體的三羧酸循環(huán)。

本研究的不足之處是未能進(jìn)一步明確ACSL1異常表達(dá)對(duì)HCC能量代謝重編程的具體機(jī)制。但結(jié)合前文描述，我們推測(cè)，ACSL1可能通過FAO途徑參與線粒體三羧酸循環(huán)，進(jìn)而參與HCC的發(fā)生、發(fā)展。下一步我們將結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步深入探討ACSL1在HCC中的具體機(jī)制，并且借ACSL1相關(guān)研究進(jìn)一步揭示FAO異常在HCC參與的新途徑。