劉春增, 張 夢(mèng),3*, 史鵬飛, 郭曉彥, 聶良鵬, 呂玉虎, 凌敬偉, 潘滋亮, 鄭春風(fēng), 李本銀

(1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所， 河南 鄭州 450002； 2. 信陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 河南 信陽(yáng) 464000；3. 河南省作物分子育種研究院， 河南 鄭州 450002)

紫云英(Astragalussinicus)是豆科黃耆屬越年生草本植物，是我國(guó)南方稻田重要的冬季綠肥，具有培肥地力、降低化肥依賴、提升稻米產(chǎn)量和品質(zhì)的作用[1-2]。隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)向高質(zhì)量發(fā)展方向邁進(jìn)，紫云英種植面積逐年增加，對(duì)其種子的需求量也隨之增大。報(bào)道顯示，氣候條件[3]、播種時(shí)期[4]、施肥[5]影響紫云英種子產(chǎn)量。但是作為無(wú)限花序豆科作物，紫云英由下而上逐漸開(kāi)花結(jié)莢[9]，不同枝位花序開(kāi)花時(shí)間相差30天，成熟時(shí)間相差20天[3]，最佳收獲期一般在65%～75%莢果成熟時(shí)[6]。但受品種和氣候的影響，收獲時(shí)紫云英莖稈貪青現(xiàn)象普遍存在，較高的含水率影響紫云英莢果的機(jī)械化收割以及莢果脫離分選。此外，紫云英成熟過(guò)程中莢果發(fā)生自然脫落，脫落率可達(dá)3.3%～24.1%[7]，且主要發(fā)生在底部高成熟度莢果[6]，對(duì)繁種產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。貪青造成機(jī)械收割不便、過(guò)熟導(dǎo)致莢果損失，已成為紫云英規(guī)?；狈N面臨的技術(shù)問(wèn)題。

化學(xué)催枯劑已廣泛用于油菜(Brassicanapus)、棉花(Gossypiumherbaceum)、水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)等作物，可有效促進(jìn)作物成熟，快速降低植株和籽粒水分，降低機(jī)械收獲損失[8-9]。王正偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)百草枯可加快紫花苜蓿(Medicagosativa)植株干燥脫水過(guò)程，而紫花苜蓿種子產(chǎn)量和千粒重并未降低。然而，百草枯因其生物毒性，已在我國(guó)全面禁用。目前，敵草快(Diquat)被廣泛用于作物催枯[10]。喬醒等[8]研究發(fā)現(xiàn)，敵草快在油菜上脫水效果顯著，殘留量符合國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)。紫云英作為豆科綠肥作物，花莢及種子性狀是否受催枯劑影響，后茬作物萌發(fā)生長(zhǎng)對(duì)殘留敵草快的敏感性尚不清楚，制約了敵草快作為催枯劑在綠肥種子生產(chǎn)中的應(yīng)用。本研究通過(guò)在紫云英成熟期人工噴施不同濃度敵草快，連續(xù)測(cè)定不同部位莖稈含水率及莢果性狀，分析了敵草快的催枯效應(yīng)及對(duì)其產(chǎn)量的影響，檢測(cè)了不同器官敵草快殘留量并以紫云英和水稻種子為受體測(cè)定了環(huán)境毒理學(xué)參數(shù)，旨在為紫云英種子生產(chǎn)中催枯劑的施用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及材料

研究地點(diǎn)位于河南省信陽(yáng)市平橋區(qū)信陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)示范基地(32°14′ N，114°13′ E，海拔60 m)，該地屬亞熱帶向暖溫帶過(guò)渡區(qū)，年均日照1 900～2 000 h；年平均氣溫15℃，降雨量1 060 mm；土壤系黃褐土發(fā)育而成的水稻土，pH值6.6，有機(jī)質(zhì)含量10.7 g·kg-1，全氮含量1.04 g·kg-1，速效磷含量14.1 mg·kg-1，速效鉀含量60.4 mg·kg-1。試驗(yàn)以紫云英品種‘信紫1號(hào)’為研究對(duì)象，敵草快(山東三農(nóng)生物科技有限公司，測(cè)定其有效成分含量為200 g·L-1)為催枯劑。于2019年9月30日進(jìn)行紫云英播種，播種量22.5 kg·hm-2，以225 kg·hm-2過(guò)磷酸鈣為基肥，后期不追施其他肥料，管理同當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2020年5月8日(此時(shí)75%莖枝結(jié)莢、25%莖枝開(kāi)花)上午10∶00—11∶00，進(jìn)行敵草快葉面噴施。依據(jù)敵草快有效成分濃度設(shè)置3個(gè)處理(20 g·L-1(High)、10 g·L-1(Median)和5 g·L-1(Low))，以葉面噴施清水為對(duì)照(CK)，各處理3次重復(fù)，每小區(qū)(5 m×6 m)噴施處理溶液或?qū)φ账芤? L，處理后6 h內(nèi)未下雨。

1.3 植株含水率測(cè)定

于處理后第2 d和第6 d的8∶00—9∶00在各小區(qū)隨機(jī)采集植株樣品10株，依據(jù)莖節(jié)位置由下而上選取第1至第3節(jié)位(底部，Lower)、第3至第5節(jié)位(中部，Middle)以及第5節(jié)位以上(頂部，Upper)莖稈，稱取鮮重后，80℃烘干2 d，稱取干重，計(jì)算含水率。

1.4 莢果性狀調(diào)查

于敵草快處理后第0，1，2，4，6 d的7∶00—9∶00，在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取1 m×1 m樣方，貼近地面手工收割地上部，運(yùn)回室內(nèi)進(jìn)行莢果性狀調(diào)查。由下而上依據(jù)著生部位分別采集第1～2，3～4及5以上枝位莢果，以花序?yàn)閱卧?，進(jìn)行成熟度分級(jí)、記錄單位面積各類(lèi)花莢的總花序數(shù)(包括莢果)。根據(jù)前期研究結(jié)果[6]，對(duì)紫云英莢果成熟度分級(jí)辦法進(jìn)行簡(jiǎn)化：黑色莢果賦值為4，灰色莢果賦值為3，綠色莢果賦值為2，花賦值為1，進(jìn)行分類(lèi)并賦值，根據(jù)賦值和莢果個(gè)數(shù)計(jì)算調(diào)查單位面積的莢果成熟指數(shù)。將收集的莢果充分散開(kāi)后自然晾干，至果皮指壓即碎時(shí)(含水量10%左右)信封分裝，稱取花莢總重，脫粒后測(cè)定種子產(chǎn)量及千粒重。

1.5 敵草快殘留及毒理學(xué)測(cè)定

于處理后第6 d各小區(qū)隨機(jī)采集紫云英10株，莢果、莖分別干冰保存送至農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(武漢)，采用氣相色譜法[12]對(duì)其進(jìn)行敵草快農(nóng)藥殘留檢測(cè)。以紫云英種子和水稻種子為受體，在收獲當(dāng)年10月進(jìn)行敵草快的毒理學(xué)生物測(cè)試：配制10-5～104mg·L-1敵草快水溶液，于雙層濾紙培養(yǎng)皿(90 mm)中均勻撒入30粒水稻種子或50粒紫云英種子，加入5 mL敵草快待測(cè)水溶液并封口，重復(fù)5次，以去離子水為對(duì)照，20℃暗培養(yǎng)?；谌ルx子水培養(yǎng)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在培養(yǎng)后第2，4，6 d測(cè)定發(fā)芽率，第7 d利用數(shù)碼相機(jī)對(duì)水稻、紫云英幼苗拍照并進(jìn)行水稻胚根長(zhǎng)、胚芽鞘長(zhǎng)以及紫云英幼苗株高圖像測(cè)量。其中水稻胚根長(zhǎng)為萌發(fā)生長(zhǎng)出根系的總長(zhǎng)，紫云英株高則為子葉至根尖的長(zhǎng)度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013和SPSS 18軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計(jì)分析，多因素方差分析采用SPSS內(nèi)嵌的通用線性模型(GLM法)，多重比較(Post Hoc Multiple Comparison)分別采用Scheffé法(樣本量不同，毒理學(xué)測(cè)試中的幼苗性狀)和Turkey HSD法(樣本量相同，含水率、莢果性狀、敵草快殘留量)，在P<0.05水平下檢查差異顯著性。利用ImageJ軟件測(cè)定所有發(fā)芽水稻胚根長(zhǎng)、胚芽鞘長(zhǎng)以及紫云英幼苗株高。種子相對(duì)發(fā)芽率計(jì)算如下：

式中，Gt為處理受體發(fā)芽率，G0為對(duì)照受體發(fā)芽率。

成熟指數(shù)，表示某一時(shí)期枝位的莢果成熟水平[6]，計(jì)算方法如下：

式中，Iij為第i天第j枝位的莢果成熟指數(shù)，n為成熟等級(jí)值(詳見(jiàn)1.4部分)，Pn為對(duì)應(yīng)成熟度莢果在該時(shí)期該枝位上莢果數(shù)量的占比，以百分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用敵草快對(duì)植株含水率的影響

敵草快處理后紫云英莖稈含水率顯著下降，不同部位響應(yīng)敏感性存在差異(表1)。處理后第2 d，紫云英底部和中部莖稈含水率在各處理間無(wú)顯著差異，高濃度敵草快處理下頂部莖稈的含水率顯著低于對(duì)照(P<0.05)，降幅達(dá)13.1%。第6 d，敵草快處理紫云英底部、中部、頂部莖稈含水率均顯著低于對(duì)照(P<0.05)，降幅分別達(dá)22.7%～29.4%，41.3%～45.9%，42.58%～44.13%，底部含水率降幅低于中部和頂部。值得注意的是，第2 d和第6 d對(duì)照莖稈含水率并未顯著下降，說(shuō)明敵草快催枯效果顯著，但在處理后第6 d 3個(gè)濃度敵草快處理下植株莖稈含水率無(wú)顯著差異。

表1 敵草快處理后不同時(shí)期紫云英莖稈含水率Table 1 Moisture content of Astragalus sinicus stem at different periods after diquat treatments 單位：%

2.2 施用敵草快對(duì)紫云英莢果性狀的影響

調(diào)查時(shí)期、敵草快濃度、枝位對(duì)莢果性狀具有顯著作用(表2)。試驗(yàn)期間(0～6 d)紫云英總花序數(shù)、花莢總重?zé)o顯著變化，而種子產(chǎn)量、千粒重、成熟指數(shù)顯著升高(P<0.05)；紫云英總花序數(shù)、花莢總重及種子產(chǎn)量受敵草快處理顯著影響(P<0.05)，呈現(xiàn)隨敵草快濃度升高逐漸降低的趨勢(shì)；結(jié)莢枝位對(duì)總花序數(shù)、花莢總重、種子產(chǎn)量、千粒重、成熟指數(shù)均有影響(P<0.05)，底部性狀最優(yōu)。對(duì)上述3個(gè)因子交互效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，敵草快處理并未與時(shí)期、枝位產(chǎn)生交互效應(yīng)，噴施中高濃度的敵草快水溶液會(huì)造成花莢脫落及籽粒顯著減少，但并未加速莢果成熟。

表2 敵草快處理后紫云英花莢及產(chǎn)量性狀Table 2 Flowers-pods and yield characters of Astragalus sinicus after diquat treatments

2.3 敵草快對(duì)莢果的催枯特征

敵草快主要作用于紫云英幼嫩部分或綠色器官。如圖1所示，花序及成熟度較低的莢果(圖1中2～3號(hào))經(jīng)過(guò)敵草快處理后，呈枯黃萎縮狀，莢果明顯脫水，與正常成熟脫水莢果存在明顯差別。但達(dá)到成熟的莢果(圖1中1號(hào))顏色為黑色或棕色，外觀受敵草快作用不明顯，莢果中籽粒飽滿。

圖1 敵草快對(duì)紫云英花莢的催枯特征Fig.1 Characteristics of the flower-pods of Astragalus sinicus after diquat application注：圖中數(shù)字顯示成熟度，其中1為成熟、2為綠色未成熟莢果、3為花序。照片拍攝于施藥后第6 dNote：1 for mature,2 for green un-mature,3 for flowers. The photos were taken on the 6th day after application

2.4 敵草快殘留量

處理6 d后，莢果中敵草快殘留量高于莖，隨處理濃度升高而逐漸升高(圖2)。其中，高濃度處理紫云英莢果中敵草快殘留量達(dá)2.34 μg·g-1，莖殘留0.42 μg·g-1，顯著高于中濃度處理(0.70 μg·g-1和0.16 μg·g-1)和低濃度處理(0.05 μg·g-1和0.01 μg·g-1)及對(duì)照的敵草快殘留量(P<0.05)。對(duì)照莢果中亦檢測(cè)出0.026 μg·g-1殘留，推測(cè)施藥過(guò)程敵草快飄散，造成了污染。

圖2 紫云英莖和莢果的敵草快殘留量Fig.2 Residue amount of diquat in stems and pods注：圖中誤差項(xiàng)為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。不同小寫(xiě)字母者表示差異顯著(P<0.05)Note：Error bar indicated mean±SE. Different letters indicated significant difference between levels at the 0.05 level

2.5 敵草快生物毒性評(píng)價(jià)

以紫云英及后茬作物水稻種子作為受體，評(píng)價(jià)敵草快生物毒性。研究發(fā)現(xiàn)，受體相對(duì)發(fā)芽率隨敵草快濃度升高呈“S”型特征變化(圖3)。在敵草快濃度為1 000～10 000 mg·L-1時(shí)，敵草快完全抑制水稻和紫云英發(fā)芽；在敵草快濃度為0.1～100 mg·L-1時(shí)，水稻發(fā)芽率隨敵草快濃度降低而逐漸升高，當(dāng)敵草快濃度≤0.1 mg·L-1時(shí)，相對(duì)發(fā)芽率高于100%；紫云英種子相對(duì)發(fā)芽率則在敵草快濃度為10～100 mg·L-1逐漸升高，敵草快濃度≤10 mg·L-1時(shí)，相對(duì)發(fā)芽率高于100%。敵草快濃度對(duì)幼苗生長(zhǎng)存在顯著影響(表3)。當(dāng)敵草快濃度≥1 mg·L-1時(shí)，水稻胚芽鞘生長(zhǎng)受到顯著抑制，濃度≥0.1 mg·L-1時(shí)，水稻胚根受到顯著抑制；而紫云英則在敵草快濃度≥10 mg·L-1時(shí)生長(zhǎng)受到顯著抑制。綜合發(fā)芽率和幼苗生長(zhǎng)情況，水稻對(duì)于敵草快的敏感性高于紫云英，其安全閾值為0.01 mg·L-1，紫云英則為1 mg·L-1。

圖3 不同濃度敵草快對(duì)水稻(a)和紫云英(b)種子發(fā)芽率的影響Fig.3 Germination response of Oryza sativa (a) and Astragalus sinicus (b) seeds to diquat注：圖中誤差項(xiàng)為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。對(duì)照水稻種子第4 d和第6 d的絕對(duì)發(fā)芽率分別為60.0%和77.0%，紫云英種子第2 d和第4 d的絕對(duì)發(fā)芽率分別為63.5%和75.4%Note：Error bar indicated mean±SE. The absolute germination rate of Oryza sativa seeds at 4 d and 6 d were 60.0% and 77.0%,the absolute germination rate of Astragalus sinicus seeds at 2 d and 4 d were 63.5% and 75.4%

表3 不同濃度敵草快對(duì)水稻和紫云英幼苗生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of diquat on seedling growth of Oryza sativa (a) and Astragalus sinicus

3 討論

3.1 噴施敵草快對(duì)紫云英的催枯作用

本研究中，敵草快施用6 d后，紫云英中部和頂部莖稈含水率下降至30%～40%，底部下降至54%～61%，顯著低于對(duì)照(75%～83%)，敵草快顯著降低了紫云英莖稈含水率。有報(bào)道顯示敵草快具有催熟的效果。喬醒等[8]研究發(fā)現(xiàn)，施用敵草快后3～4 d，油菜角果皮逐漸變?yōu)楹稚?，而?duì)照角果在第5～6 d才開(kāi)始變黃，但其催熟作用主要表現(xiàn)在中上部角果上。本研究采用成熟指數(shù)[6]表征紫云英莢果顏色變化，發(fā)現(xiàn)敵草快處理并未顯著影響莢果成熟度(表2)，與喬醒等[8]研究不同，原因可能是紫云英正常成熟過(guò)程莢果呈“綠—褐—黑”，敵草快處理6 d內(nèi)綠色莢果逐漸枯黃，枯黃色未在成熟指數(shù)指標(biāo)體系，因此施用敵草快未影響紫云英整體的成熟指數(shù)。但是，不同部位莖稈脫水速率存在差異，表現(xiàn)為頂部>中部>底部，原因可能是敵草快為聯(lián)吡啶類(lèi)傳導(dǎo)性觸殺滅生性除草劑，通過(guò)植物綠色組織吸收[10，13]，而噴施條件下頂部綠色組織截留更多敵草快藥劑，導(dǎo)致葉片、綠色莖稈等活性組織結(jié)構(gòu)破壞，植株對(duì)于水分的結(jié)合能力、主動(dòng)傳導(dǎo)能力降低，水分大量散失；底部則由于接觸較少的敵草快，加之近地面相互遮蔽不利于水分散失，所以脫水速率較低。紫云英黑色莢果在噴施敵草快后并未受到影響(圖1)，而花序和綠色莢果則在施藥后均呈現(xiàn)非正常脫水的枯黃色。據(jù)此可見(jiàn)，噴施敵草快主要作用于紫云英幼嫩器官，對(duì)植株頂部的作用效果強(qiáng)于底部，高濃度敵草快則加速器官脫水過(guò)程。

3.2 過(guò)量敵草快對(duì)紫云英種子產(chǎn)量的影響

施用催枯劑可以加速植株脫水，便于機(jī)械收獲。研究發(fā)現(xiàn)，大豆、棉花、苜蓿的莖稈的剪切強(qiáng)度和拉伸強(qiáng)度與含水率密切相關(guān)[14-16]。因此，脫水催枯可提高作物收割效能，便于籽粒收獲和保存。油菜在噴施敵草快6 d后，角果和籽粒含水量分別下降52.66%和24.84%，而油菜籽千粒重及品質(zhì)均未產(chǎn)生顯著差異[8]。本研究中，噴施高濃度敵草快顯著降低了紫云英總花莢數(shù)、莢果總重和種子產(chǎn)量，但未對(duì)千粒重產(chǎn)生顯著影響(表2)。由于敵草快是傳導(dǎo)性觸殺滅生性除草劑，可迅速被綠色植物組織吸收，通過(guò)干擾植物細(xì)胞膜、破壞光合作用而快速發(fā)揮效果[10，13]。據(jù)此推測(cè)，高濃度敵草快一方面降低了花莢數(shù)量(頂部新生莢果死亡、底部成熟莢果脫落)，造成籽粒供給能力不足；另一方面，器官快速脫水造成未成熟莢果籽粒受損，結(jié)實(shí)率下降[17]。此外，低濃度敵草快處理下，紫云英總花莢數(shù)、莢果總重和種子產(chǎn)量均未受顯著影響，原因既可能是花莢與莖對(duì)敵草快敏感度存在差異，又可能是頂部存在截留效應(yīng)使中下部莢果脫水速率適中未造成明顯的落莢損失。由于紫云英在成熟過(guò)程中，80%以上的種子產(chǎn)量來(lái)源于中下部莢果[6]，因此，雖然頂部尚有花序及幼嫩莢果，若選擇恰當(dāng)時(shí)期噴施適當(dāng)濃度催枯劑(敵草快)，可實(shí)現(xiàn)紫云英種子“穩(wěn)產(chǎn)提質(zhì)”。

3.3 敵草快在紫云英種子生長(zhǎng)中的應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)

敵草快毒性較低，但仍然具有生態(tài)學(xué)毒性風(fēng)險(xiǎn)。楊亞哲等[18]測(cè)定了敵草快對(duì)水藻的毒性，其中對(duì)羊角月芽藻(Selenastrumcapricornutum)的 72 h的半數(shù)效應(yīng)濃度為 3.16×10-2mg·L-1，對(duì)大型溞(Daphniamagna)48 h的半數(shù)效應(yīng)濃度為 1.18×10-2mg·L-1。成云峰等[19]對(duì)敵草快生態(tài)毒性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)敵草快對(duì)蜜蜂(Apismellifera)、蚯蚓(Eiseniafetida)、斑馬魚(yú)(Brachydaniorerio)低毒，而對(duì)家蠶(Bombyxmori)、日本鵪鶉(Coturnixjaponica)、大型溞中毒。紫云英主要在稻田種植擴(kuò)繁，因此施用敵草快危害的主要受體作物應(yīng)是紫云英和水稻。本研究中，敵草快對(duì)于水稻和紫云英發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)呈“S”型，高濃度抑制效應(yīng)顯著。水稻種子萌發(fā)對(duì)于敵草快的半數(shù)效應(yīng)濃度為1～10 mg·L-1，紫云英種子萌發(fā)對(duì)于敵草快的半數(shù)效應(yīng)濃度為10～100 mg·L-1，兩者敏感性顯著低于藻類(lèi)[17]，與魚(yú)類(lèi)和蜜蜂相似[19]。敵草快對(duì)于水稻和紫云英種子屬于低毒性[20]。然而，高濃度處理莢果中敵草快殘留量達(dá)2.34 μg·g-1，莖殘留0.42 μg·g-1，以200 g·m-2莢果和300 g·m-2莖葉計(jì)算[6]，單位面積敵草快殘留為0.59 mg·m-2，假設(shè)20 mm降水條件敵草快完全洗脫(實(shí)際上應(yīng)無(wú)法完全洗脫，若紫云英翻壓為水田，水量應(yīng)遠(yuǎn)高于20 mm)濃度為0.295 mg·L-1，中濃度和低濃度處理則為0.064 mg·L-1和0.006 mg·L-1，由于水稻和紫云英對(duì)于敵草快的安全閾值分別為 0.01 mg·L-1和1 mg·L-1(圖3和表3)，因此可以確定低濃度敵草快的施用對(duì)水稻生產(chǎn)是安全的，而紫云英種子在3個(gè)處理下均是安全的。若考慮敵草快在稻田的漂移，依據(jù)對(duì)不同生物的半致死濃度，低濃度敵草快施用對(duì)水藻、大型溞、家蠶、蜜蜂、魚(yú)類(lèi)也具有安全性[18-19]。

4 結(jié)論

敵草快能夠顯著降低成熟期紫云英莖稈含水率，施用6 d后紫云英中部和頂部莖稈含水率下降至30%～40%，底部下降至54%～61%，可以滿足機(jī)械化收割需要。但是，高濃度(20 g·L-1)敵草快處理顯著降低紫云英總花莢數(shù)、莢果總重，影響種子產(chǎn)量；而施用中高濃度(≥10 g·L-1)敵草快，紫云英莖稈殘留的敵草快對(duì)于水稻具有一定毒害風(fēng)險(xiǎn)。綜合考慮脫水效果、莢果性狀和產(chǎn)量、殘留及對(duì)受體的毒性情況，噴施低濃度(5 g·L-1)敵草快適用于紫云英種子生產(chǎn)，殘留不足以影響水稻接茬。