金亞東，趙海霞，桂瑞麒，馬青，周玉香*

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002）

共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是亞油酸的同分異構(gòu)體，是一類含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸（亞油酸）異構(gòu)體混合物。常見的CLA為C18：2 cis-9 trans-11和C18：2 trans-10 cis-12，其中C18：2 cis-9 trans-11在所有共軛亞油酸中的比例最高，達(dá)87%左右［1］。共軛亞油酸作為一種新興的營養(yǎng)素，具有抗癌、預(yù)防心血管疾病和糖尿病等作用。與其他動物產(chǎn)品相比，反芻動物產(chǎn)品（肉和奶）中CLA含量較高［2］。CLA在反芻動物體內(nèi)的合成主要通過兩個途徑，一是在瘤胃生物加氫化過程中作為C18：2n6和C18：3n3氫化的中間體產(chǎn)生，二是組織內(nèi)的反式異油酸（trans vaccenic acid，TVA，trans-11 C18：1）在硬脂酰輔酶A去飽和酶（stearyl coenzyme A dehydrogenase-1，SCD）的作用下合成c9t11CLA，這是內(nèi)源合成CLA的重要機(jī)制。研究表明，CLA內(nèi)源途徑合成主要與瘤胃內(nèi)的TVA含量有關(guān)。此外，暫無報道顯示組織內(nèi)的C18：2 trans-10 cis-12合成與SCD酶之間存在相互關(guān)系，但組織內(nèi)和奶中C18：2 trans-10 cis-12的合成與瘤胃中C18：2 trans-10之間存在一定的聯(lián)系。溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）和蛋白溶解梭菌（Butyrivibrio proteoclasticus）是參與瘤胃內(nèi)C18不飽和脂肪酸氫化的主要細(xì)菌，此外其他細(xì)菌如白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）、黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）以及埃式巨型球菌（Megasphaera elsdenii）等也在瘤胃不飽和脂肪酸的氫化過程中起一定的作用［3-4］。

研究表明，放牧或飼喂低精料日糧的羊只的肌肉中含有較高的CLA［5-6］。此外，大量的體外研究也表明，高精料日糧或者低瘤胃pH對發(fā)酵液中CLA和TVA的濃度，以及相關(guān)氫化細(xì)菌生長具有一定的抑制［3-4］。而關(guān)于體內(nèi)試驗條件下，日糧精料水平對反芻動物瘤胃內(nèi)CLA和TVA，以及相關(guān)氫化細(xì)菌生長的影響的研究報道則較少。Wang等［7］和Xu等［8］的研究表明，當(dāng)羊只日糧精料水平高于60%時會對羊只胃腸道健康產(chǎn)生一定的威脅。過高的精料水平會引起瘤胃pH降低，對瘤胃內(nèi)相關(guān)微生物的生長繁殖產(chǎn)生不利影響［9-10］，最終導(dǎo)致組織內(nèi)CLA含量的降低。鉻是人和動物所必需的微量元素，與其他價態(tài)的鉻相比，三價態(tài)鉻的安全性及穩(wěn)定性相對較高，并且與無機(jī)鉻相比，有機(jī)鉻的吸收利用效率更高。蛋氨酸鉻（chromium methionine，Cr-Met）作為有機(jī)鉻的一種，由于其與蛋氨酸螯合，可借助蛋氨酸鉻的吸收途徑進(jìn)入機(jī)體，因此其吸收效率高于其他有機(jī)鉻。在單胃動物上的研究也表明，日糧鉻的添加對提高動物機(jī)體組織CLA的含量具有積極的作用［11］。之前的研究表明，動物的小腸是鉻的主要吸收部位，其在瘤胃內(nèi)的吸收效率極低［12-13］。這意味著鉻的添加可能并不會對反芻動物瘤胃微生物的生長產(chǎn)生影響。因此，日糧鉻添加對反芻動物，尤其是瘤胃方面的研究鮮有報道。然而，Dallago等［14］的研究表明，添加0.375 mg·d-1（按元素含量計）的鉻顯著降低羔羊瘤胃內(nèi)原蟲的數(shù)量，而0.250和0.500 mg·d-1的添加量對瘤胃原蟲的數(shù)量則沒有顯著影響。這表明，即使鉻在瘤胃內(nèi)的吸收效率極低，但適量的Cr添加也有可能影響到反芻動物瘤胃內(nèi)相關(guān)微生物的活動。并且相關(guān)報道表明，鉻可作為CLA合成過程中的催化劑，增加CLA的合成效率［15-16］。據(jù)此，本研究以低精料（low concentrate，LC）日糧為對照組，選擇精料水平低于60%的日糧作為試驗組日糧，觀察其對灘羊瘤胃發(fā)酵特性，瘤胃脂肪酸組成和相關(guān)氫化細(xì)菌的DNA豐度是否有不利影響，并且在高精料（high-concentrate，HC）日糧中添加Cr-Met，觀察其對以上指標(biāo)是否有積極的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

試驗于2019年6-9月在寧夏回族自治區(qū)吳忠市寧鑫生態(tài)牧場進(jìn)行。選取體重相近［（21.00±1.23）kg］、健康狀況良好的5月齡灘羊公羔40只，隨機(jī)分配到4個試驗組，每組10只。LC組飼喂精粗比為35∶65的全混合飼糧，日糧中不添加Cr-Met；HC組飼喂精粗比為55∶45的全混合飼糧，日糧中不添加Cr-Met；HCM組和HCH組均飼喂精粗比為55∶45的全混合飼糧，Cr-Met的添加量分別為0.75和1.50 g·d-1·只-1。試驗周期80 d，預(yù)飼期15 d，正試期65 d。參考《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 816-2004）［17］配制飼糧，試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗開始前對圈舍進(jìn)行消毒，對所有羊只進(jìn)行體內(nèi)和體外驅(qū)蟲，并按照牧場相關(guān)防疫程序?qū)ρ蛑蛔⑸湟呙纭Ｃ咳诊曃箖纱危?7：00和17：00）全混合飼糧，自由飲水。Cr-Met由金寶（中國）動物營養(yǎng)科技有限公司饋贈（鉻≥1000 mg·kg-1，純度99%，蛋氨酸含量≥0.9%），并以膠囊的形式于每日晨飼前單獨(dú)口服投喂。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrition levels of diet（DM basis）

1.2 瘤胃液采集與前處理

試驗第65天在每組選擇5只平均體重相近的羊只，晨飼后3 h利用瘤胃液采集器（科立博，武漢，中國）通過口腔采集瘤胃液（約50 mL）。在每次樣品采集前和結(jié)束后用溫水（約39.0℃）對采集器內(nèi)部和外部進(jìn)行清洗，并棄去最開始采集到的瘤胃液。在每份瘤胃液中取1.8 mL，用無菌無酶的2 mL凍存管進(jìn)行分裝，并用液氮速凍，隨后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存，備測相關(guān)細(xì)菌的DNA豐度。在樣品收集結(jié)束后立即用便攜式瘤胃p H計檢測瘤胃液p H值。隨后，用潔凈無菌的4層紗布對剩余的瘤胃液過濾，將過濾后的液體分為4份：取5 mL濾液與1 mL 250 g·L-1（W/V）偏磷酸混合均勻，-20℃保存，備測瘤胃揮發(fā)性脂肪酸。另取5 mL瘤胃液加入1 mL 20 g·L-1（W/V）H2SO4混合均勻，-20℃保存，備測瘤胃氨態(tài)氮（ammoniacal nitrogen，NH3-N）濃度。第3份約5 mL，-20℃保存，備測瘤胃微生物蛋白（microbial protein，MCP）含量。剩余瘤胃液-20℃保存，備測瘤胃脂肪酸組成。

1.3 樣品檢測方法

1.3.1 MCP、NH3-N和VFA的檢測 參照王加啟［18］的方法，用分光光度計檢測瘤胃NH3-N濃度。利用氣相色譜儀（安捷倫，GC7890，美國）檢測瘤胃脂肪酸，具體步驟參照王加啟［18］和武曉東［19］的方法。MCP用考馬斯亮藍(lán)比色法進(jìn)行檢測，具體步驟參照Makkar等［20］的方法。

1.3.2 瘤胃相關(guān)細(xì)菌定量分析 用糞便基因組提取試劑盒（DP328）對瘤胃液樣品中的總基因組DNA進(jìn)行提取，具體方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。樣品DNA提取成功后，用超微量分光光度計檢測總DNA的濃度和純度（OD260/280和OD260/230），用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA的質(zhì)量。然后將總DNA于-20℃冰箱中保存，直到進(jìn)行熒光定量PCR分析。以瘤胃內(nèi)總菌（general bacteria，GB）DNA作為內(nèi)參基因，利用相對定量法對選擇的細(xì)菌進(jìn)行定量，具體計算公式如下：目標(biāo)菌(總菌16SrDNA含量，%)=2-(目標(biāo)菌CT值-瘤胃總菌CT值)。

待測細(xì)菌引物參照Fuentes等［4］，Gudla等［3］和Stevenson等［21］設(shè)計，具體信息見表2，引物由上海生工合成。用BIO-RAD熒光定量PCR儀（CFX Connect，美國）和CFX Manager軟件對ButyrivibrioSA、ButyrivibrioVA、R.albus、R.flavefaciens、B.proteoclasticus、Anaerovibrio lipolytica和M.elsdenii的DNA豐度進(jìn)行熒光定量PCR分析，每個樣品3個生物學(xué)重復(fù)。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為25μL，包括12.5μL的SYBR?Green Master Mix（YEASEN，中國），1μL的PCR正向引物（10μmol），1μL的PCR反向引物（10μmol），1μL DNA模板和9.5μL的dd H2O。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，40個循環(huán)，72℃延伸20 s，在延伸期收集熒光信號。全部樣品檢測均設(shè)置一個去離子水代替模板的陰性對照。

表2 熒光定量PCR引物Table 2 Pr imer s used for real-time PCR quantification

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SAS 8.2統(tǒng)計軟件中的one-way ANOVA方法對4個試驗組以及HC和LC組的各指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析；用GLM程序中的不相關(guān)比較法（orthogonal contrast）對高精料條件下各指標(biāo)隨Cr-Met添加水平增加的線性（linear，L）和二次函數(shù)（quadratic，Q）變化進(jìn)行統(tǒng)計分析。以P<0.05作為判斷差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧精料水平和Cr-Met添加對灘羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表3可知，HC、HCM和HCH組灘羊瘤胃液p H值均顯著低于LC組，HC、HCH組乙酸/丙酸也均顯著低于LC組（P<0.05）；與LC組相比，HC組灘羊瘤胃MCP、丙酸和戊酸濃度顯著升高（P<0.05）。高精料日糧中添加Cr-Met對瘤胃p H、NH3-N、MCP和揮發(fā)性脂肪酸組成均無顯著影響（P>0.05）。與HC組相比，HCM組灘羊瘤胃內(nèi)乙酸/丙酸顯著升高（P<0.05），但與其他組間無顯著差異（P>0.05）。

表3 日糧精料水平和Cr-Met添加對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 3 Effects of dietary concentrate level and Cr-Met supplementation on rumen fermentation parameter

2.2 日糧精料水平和Cr-Met添加對灘羊瘤胃細(xì)菌DNA相對豐度的影響

由表4可知，與LC組相比，HC組灘羊瘤胃液中反式油酸溶纖維丁酸弧菌和黃色瘤胃球菌的DNA豐度顯著降低（P<0.05），但解脂厭氧弧桿菌的DNA豐度卻顯著增加（P<0.05）。高精料日糧條件下，灘羊瘤胃液中硬脂酸溶纖維丁酸弧菌、反式油酸溶纖維丁酸弧菌、蛋白溶解梭菌和解脂厭氧弧桿菌的DNA豐度隨Cr-Met劑量的增加而線性降低（P<0.05），但黃色瘤胃球菌的DNA豐度則線性升高（P<0.05）。

2.3 日糧精料水平和Cr-Met添加對灘羊瘤胃脂肪酸組成的影響

由表5可知，與LC組相比，HC組灘羊瘤胃液中C18：1、t9 C18：1、t11 C18：1、trans C18：1、c9t11 CLA、t10c12 CLA、C18：2n6和C18：3n3濃度均顯著降低（P<0.05），而C18：0濃度則顯著升高（P<0.05）。高精料日糧條件下，灘羊瘤胃液中C18：1、t9 C18：1、t11 C18：1和trans C18：1濃度隨Cr-Met劑量的增加而線性上升（P<0.05）。

表5 日糧精料水平和Cr-Met添加對瘤胃脂肪酸組成的影響Table 5 Effects of dietary concentrate level and Cr-Met supplementation on fatty acid composition of rumen fluid（mg·kg-1）

3 討論

3.1 日糧精料水平和Cr-Met添加對灘羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

本研究表明，提高日糧精料水平可顯著降低瘤胃乙酸比例，這與之前的研究結(jié)果一致［4，22］。飼喂高精料日糧可引起瘤胃pH降低，抑制瘤胃內(nèi)相關(guān)纖維降解菌的生長繁殖，最終導(dǎo)致乙酸/丙酸的降低［3，9］。由表3和表4可知，本研究中HC組灘羊瘤胃pH值顯著低于LC組，并且相關(guān)纖維降解菌如：反式油酸溶纖維丁酸弧菌和黃色瘤胃球菌的DNA豐度顯著低于LC組。高精料日糧條件下丙酸濃度的含量較高，這與以前的研究結(jié)果一致［22-23］。這可能與高精料日糧促進(jìn)了相關(guān)淀粉分解菌的繁殖有關(guān)［23］。相對于纖維分解菌而言，淀粉分解菌對低瘤胃pH的耐受性更強(qiáng)。本研究中，增加日糧精料水平略微提高了丁酸的濃度，但并無顯著影響，這與Wang等［24］的研究結(jié)果一致。但Kljak等［25］的研究則表明，在以高粱（Sorghum bicolor）青貯為粗飼料來源的情況下，提高奶牛日糧精料水平可線性提高其瘤胃丁酸濃度。以上研究結(jié)果的不同，可能與動物種類和日糧組成的不同有關(guān)。提高日糧精料水平可顯著提高戊酸濃度，這與Gudla等［3］的研究結(jié)果一致。Fuentes等［4］的體外研究也表明，提高日糧精料水平可增加發(fā)酵液中戊酸的比例，并且在同一精粗比條件下，發(fā)酵液的p H越低，其戊酸的比例則越高，本研究結(jié)果與此類似。Fuentes等［26］和Gudla等［3］的體外研究也有類似的發(fā)現(xiàn)，說明高精料日糧或低瘤胃p H有利于戊酸生成菌的生長。日糧精料水平的增加提高了瘤胃內(nèi)MCP的濃度，這可能與高精料日糧增加了瘤胃內(nèi)MCP合成時所需的能量和碳架有關(guān)。隨著日糧精料水平的添加，瘤胃乙酸/丙酸由3.85降至2.53，這與Wang等［24］和Zhang等［9］的研究報道類似。說明精料比例的增加促進(jìn)了動物瘤胃發(fā)酵類型由乙酸型轉(zhuǎn)變?yōu)楸嵝停@對提高動物育肥效果具有重要意義［27］。目前關(guān)于日糧添加Cr-Met對反芻動物瘤胃揮發(fā)性脂肪酸影響的研究報道較少。本研究表明，高精料日糧中添加Cr-Met對瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的比例并無顯著影響。如表4所示，Cr-Met的添加對不同纖維降解菌的DNA豐度的影響并不一致。因此，瘤胃內(nèi)揮發(fā)酸的變化可能是Cr-Met對瘤胃微生物的不同作用結(jié)果所導(dǎo)致的。與HC組相比，HCM組乙酸/丙酸顯著升高，說明在HC日糧添加0.75 g·d-1·只-1Cr-Met改變了瘤胃發(fā)酵類型。

表4 日糧精料水平和Cr-Met添加對瘤胃細(xì)菌DNA相對豐度的影響Table 4 Effects of dietar y concentrate level and Cr-Met supplementation on the DNA abundance of selected rumen bacter ial（%of total bacteria）

3.2 日糧精料水平和Cr-Met添加對灘羊瘤胃細(xì)菌DNA相對豐度的影響

前人研究顯示［3，28］，瘤胃p H的降低會抑制瘤胃內(nèi)纖維降解菌的生長如：反式油酸溶纖維丁酸弧菌和黃色瘤胃球菌的DNA豐度出現(xiàn)顯著下降，即使是在瘤胃p H沒有達(dá)到亞急性酸中毒的情況下。Latham等［29］的研究也表明，瘤胃纖維降解菌對pH的變化較為敏感。硬脂酸溶纖維丁酸弧菌也屬于纖維降解菌，并且和反式油酸溶纖維丁酸弧菌都屬于溶纖維丁酸菌屬，共同參與瘤胃內(nèi)C18：2n6氫化產(chǎn)生TVA的過程，但硬脂酸溶纖維丁酸弧菌的最終產(chǎn)物為C18：0［30］。本研究表明，瘤胃p H的降低并未顯著影響硬脂酸溶纖維丁酸弧菌的DNA豐度，這與Fuentes等［4］的研究結(jié)果一致。表明硬脂酸溶纖維丁酸弧菌對瘤胃p H變化的敏感程度比反式油酸溶纖維丁酸弧菌低。Fuentes等［4］和Gudla等［3］的體外研究表明，低瘤胃p H（5.60～5.74）條件下，解脂厭氧弧桿菌的數(shù)量顯著降低，本研究結(jié)果與此剛好相反。以上結(jié)果的不同，可能與體內(nèi)和體外試驗之間的差異，培養(yǎng)時間長短和瘤胃pH的不同有關(guān)。Hobson［31］的研究表明，解脂厭氧弧桿菌的活性在pH為5.7時開始受到抑制，在pH為5.3時其活性完全被抑制，但當(dāng)p H維持在6.3以上時可避免其活性被抑制。Fuentes等［4］的體外研究表明，在p H為6.4的條件下孵育3 d后，發(fā)酵液中解脂厭氧弧桿菌的DNA豐度顯著降低，但當(dāng)繼續(xù)孵育2 d后，發(fā)酵液中解脂厭氧弧桿菌的DNA豐度顯著升高；但在p H=5.6的條件下孵育時，解脂厭氧弧桿菌的DNA豐度隨時間的增加呈線性降低。表明在pH適宜的情況下，解脂厭氧弧桿菌在經(jīng)過短暫的適應(yīng)過程后，其活性開始復(fù)蘇。Mackie等［32］和Tajima等［33］的體內(nèi)研究也表明，當(dāng)反芻動物逐步適應(yīng)高精料日糧后，其瘤胃內(nèi)解脂厭氧弧桿菌的數(shù)量開始增加。

以前的研究表明，鉻在瘤胃的吸收率極低［12，34］，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)某些金屬元素的添加會抑制瘤胃微生物的生長［14］，此外鉻在羊養(yǎng)殖中的使用一直未有明確的規(guī)定。因此，目前關(guān)于鉻添加對反芻動物瘤胃微生物影響的報道較少。本研究結(jié)果也表明，日糧添加Cr-Met降低了瘤胃內(nèi)硬脂酸溶纖維丁酸弧菌、反式油酸溶纖維丁酸弧菌、蛋白溶解梭菌和解脂厭氧弧桿菌的DNA豐度，這與Dallago等［14］關(guān)于吡啶甲酸鉻（chromium picolinate，Cr-Pic）添加降低了羔羊瘤胃原蟲數(shù)量的報道類似。有研究認(rèn)為，重金屬可引起瘤胃微生物DNA損傷，干擾基本代謝功能或活性代謝物的產(chǎn)生，增加其氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致其死亡或抑制其生長繁殖［14］。然而，與其他瘤胃細(xì)菌不同的是，黃色瘤胃球菌的DNA豐度則隨高精料日糧中Cr-Met劑量的增加而升高。以上研究結(jié)果的不同，可能與不同瘤胃微生物對鉻的耐受性和需求的差異有關(guān)。

3.3 日糧精料水平和Cr-Met添加對灘羊瘤胃脂肪酸組成的影響

與HC組相比，LC組灘羊瘤胃液內(nèi)C18：1n9、C18：2n6和C18：3n3的濃度較高，表明飼喂LC日糧降低了灘羊瘤胃液內(nèi)這些脂肪酸的表觀脂解率或氫化。然而，Troegeler-Meynadier等［35］的體外研究表明，以干草為發(fā)酵底物或者在高瘤胃pH條件下（6.71 vs 6.21和6.56 vs 5.82）孵育6 h后，發(fā)酵液中的C18：2n6和C18：3n3的消失率顯著增加，其含量也顯著低于淀粉組和低p H組。Gudla等［3］的體外研究也表明，與精粗比70：30的日糧相比（p H=5.74），添加精粗比30∶70的日糧的發(fā)酵液（p H=6.47）在孵育3 h后，C18：2n6、C18：3n3和C18：1n9的濃度顯著降低。解脂厭氧弧桿菌是瘤胃內(nèi)參與不飽和脂肪酸脂解的主要細(xì)菌［36］，LC組較高的C18：1n9、C18：2n6和C18：3n3可能與解脂厭氧弧桿菌DNA豐度的降低有關(guān)［3，27，35］。

Trans C18：1和CLA是瘤胃不飽和脂肪酸氫化的中間產(chǎn)物。Trans C18：1和CLA濃度的升高和C18：0濃度的降低表明瘤胃內(nèi)的不飽和脂肪酸發(fā)生不完全氫化［3］。本研究中LC組灘羊瘤胃液中trans C18：1和c9t11 CLA濃度顯著增加，其他CLA異構(gòu)體的濃度也出現(xiàn)略微的增加，而C18：0則顯著降低，表明LC日糧促進(jìn)了瘤胃不飽和脂肪酸的不完全氫化。Troegeler-Meynadier等［35］的研究表明，以干草為發(fā)酵底物時trans C18：1還原為C18：0的效率顯著低于以玉米（Zea mays）淀粉為發(fā)酵底物時的還原效率。Kalscheur等［37］的體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)日糧粗料水平由25%升高到60%時，流入奶牛小腸中的C18：0的量降低了21.87%。表明在體內(nèi)試驗的情況下，飼喂高水平的粗飼料可抑制瘤胃trans C18：1轉(zhuǎn)換為C18：0的還原反應(yīng)。本研究中LC組灘羊瘤胃液中C18：0的濃度較低，這與以上研究報道的結(jié)果一致。Wallace等［38］，Mckain等［39］和Ishlak等［27］的研究表明，蛋白溶解梭菌參與瘤胃氫化反應(yīng)的最后一步，即將trans C18：1還原為C18：0的過程，并且蛋白溶解梭菌在該還原反應(yīng)中起著重要作用。此外，Paillard等［30］的研究表明，硬脂酸溶纖維丁酸弧菌也參與C18：0的生成。本研究中HC組灘羊瘤胃液中硬脂酸溶纖維丁酸弧菌和蛋白溶解梭菌的DNA豐度均略高于LC組，這可能是HC組灘羊瘤胃液中C18：0的濃度顯著高于LC組的原因。當(dāng)然，HC組較高的C18：0也可能是由于某些未被檢測的微生物的變化所導(dǎo)致的。

Trans C18：1的濃度隨著高精料日糧中Cr-Met劑量的增加而線性上升，CLA濃度也有輕微的上升，而C18：0的濃度則略有降低，表明Cr-Met的添加促進(jìn)了瘤胃不飽和脂肪酸的不完全氫化作用［39］。由表4可知，高精料日糧中添加Cr-Met線性降低了瘤胃內(nèi)解脂厭氧弧桿菌的DNA豐度，這將導(dǎo)致瘤胃內(nèi)不飽和脂肪酸脂解作用的降低。這與HCM和HCH組瘤胃液中略微增加的C18：1n9和C18：2n6的變化一致。同時高精料條件下灘羊瘤胃內(nèi)硬脂酸溶纖維丁酸弧菌和蛋白溶解梭菌的DNA豐度隨Cr-Met的添加線性降低，這與C18：0含量的變化規(guī)律一致。瘤胃液內(nèi)trans C18：1濃度的線性升高也可能是Cr-Met的添加抑制了瘤胃內(nèi)不飽和脂肪酸生物氫化的末端還原反應(yīng)（trans C18：1轉(zhuǎn)變?yōu)镃18：0），從而導(dǎo)致trans C18：1在瘤胃內(nèi)不斷累積。

以前的研究表明，低精料日糧條件下，TVA是主要的trans C18：1異構(gòu)體，而高精料日糧條件下t10 C18：1則是主要的trans C18：1異構(gòu)體［4，35］。本研究則發(fā)現(xiàn)，無論在LC，還是在HC日糧條件下，TVA在所有trans C18：1異構(gòu)體中的比例均為最高，這與以上研究者的報道部分相似。Abughazaleh等［40］的研究表明，當(dāng)日糧精料水平由250 g·kg-1DM增加到500 g·kg-1DM時，發(fā)酵液中TVA依然是主要的trans C18：1異構(gòu)體；但當(dāng)日糧精料水平由500 g·kg-1DM增加到750 g·kg-1DM時，發(fā)酵液中t10 C18：1則成為主要的trans C18：1異構(gòu)體。這表明只有當(dāng)日糧精料水平達(dá)到一定比例時，t10 C18：1才有可能成為主要的trans C18：1異構(gòu)體。TVA是反芻動物內(nèi)源途徑合成CLA的主要前體物，進(jìn)入動物組織內(nèi)的TVA在硬脂酰輔酶A去飽和酶的作用下合成c9t11 CLA。本研究中，飼喂高精料日糧雖然降低了瘤胃液中TVA的濃度，但是Cr-Met的添加則線性提高了瘤胃液中TVA的濃度。這表明Cr-Met的添加可能對增加機(jī)體CLA的合成有一定的促進(jìn)作用。

以前的研究表明，C18：2n6可在反式油酸溶纖維丁酸弧菌的作用下產(chǎn)生TVA和c9t11 CLA［39］。本研究發(fā)現(xiàn)，Cr-Met的添加降低了瘤胃內(nèi)反式油酸溶纖維丁酸弧菌的DNA豐度，但TVA的濃度卻隨Cr-Met的添加呈線性增加，c9t11CLA的濃度也略有上升，這似乎是一個矛盾。Paillard等［30］和Maczulak等［41］的研究表明，瘤胃內(nèi)的纖維降解菌如：反式油酸溶纖維丁酸弧菌、白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌參與瘤胃內(nèi)C18：2n6的氫化。Gudla等［3］的研究也發(fā)現(xiàn)，3種纖維降解菌DNA豐度的降低是導(dǎo)致瘤胃內(nèi)TVA和c9t11 CLA下降的主要原因。本研究中，HC組灘羊瘤胃液中反式油酸溶纖維丁酸弧菌的DNA豐度雖然隨著Cr-Met劑量的增加而線性降低，但黃色瘤胃球菌的DNA豐度卻線性上升，并且黃色瘤胃球菌的DNA豐度在所有已檢測的細(xì)菌中占據(jù)主導(dǎo)地位，是反式油酸溶纖維丁酸弧菌的DNA豐度的19～33倍。據(jù)此推斷，高精料日糧條件下TVA和c9t11 CLA濃度隨Cr-Met添加量的增加而升高的變化趨勢是反式油酸溶纖維丁酸弧菌和黃色瘤胃球菌共同作用的結(jié)果。此外，Cr-Met的添加線性降低了瘤胃內(nèi)硬脂酸溶纖維丁酸弧菌和蛋白溶解梭菌的DNA豐度，這表明瘤胃內(nèi)不飽和脂肪酸氫化反應(yīng)的最后一步受阻。因此，瘤胃內(nèi)TVA和c9t11 CLA濃度的增加也可能是由于氫化反應(yīng)受阻所導(dǎo)致的底物濃度積累的結(jié)果。

t10c12 CLA的產(chǎn)生源自與c9t11 CLA不同的酶系［42］。以往的大部分研究表明，高精料日糧或低p H可提高瘤胃內(nèi)t10c12 CLA的含量［3，26］。但本研究則發(fā)現(xiàn)，HC組t10c12 CLA的濃度顯著低于LC組，F(xiàn)uentes等［4］、Wallace等［42］和Troegeler-Meynadier等［35］也有類似的發(fā)現(xiàn)。有學(xué)者認(rèn)為，埃式巨型球菌參與瘤胃內(nèi)C18：2n6生成t10c12 CLA的過程［43］，并且高精料或者低瘤胃p H可促進(jìn)埃式巨型球菌的生長［44］，從而提高t10c12 CLA的含量［3］。然而，Maia等［45］的研究表明，埃式巨型球菌不具有異構(gòu)化C18：2n6的能力。本研究也發(fā)現(xiàn)，在LC組埃式巨型球菌的DNA豐度略低于HC組的情況下，LC組灘羊瘤胃液中t10c12 CLA的濃度顯著高于HC組。這意味著瘤胃中存在其他適宜在低精料日糧或高瘤胃pH條件下生長的細(xì)菌參與了t10c12 CLA的產(chǎn)生。Verhulst等［34］的研究表明，痤瘡丙酸桿菌具有將C18：2n6轉(zhuǎn)化為t10c12 CLA的能力，并且其可在以干草為底物的發(fā)酵液中生存。因此，本研究中LC組灘羊瘤胃液中t10c12 CLA的濃度顯著升高，可能與痤瘡丙酸桿菌或者其他t10c12 CLA生成菌的大量繁殖有關(guān)。

4 結(jié)論

本試驗條件下，飼喂精粗比為55∶45的高精料日糧降低了灘羊瘤胃內(nèi)參與生物氫化作用的細(xì)菌的DNA豐度如：反式油酸溶纖維丁酸弧菌和黃色瘤胃球菌，但促進(jìn)了解脂厭氧弧桿菌的生長繁殖。高精料日糧促進(jìn)了瘤胃內(nèi)不飽和脂肪酸的生物氫化，導(dǎo)致c9t11 CLA和TVA濃度的下降；Cr-Met的添加降低了大部分氫化細(xì)菌的DNA豐度，但增加了黃色瘤胃球菌的DNA豐度；同時也增加了瘤胃內(nèi)TVA的含量，這對機(jī)體組織中c9t11 CLA含量的增加有一定促進(jìn)作用。