高鵬飛，張靜，范衛(wèi)芳，高冰，郝宏娟，吳建慧

（東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

干旱嚴(yán)重影響植物的生長與觀賞價值，甚至?xí)?dǎo)致植物的死亡。根系是植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官。有研究表明，經(jīng)歷干旱后，植物根系總長度、總表面積、總體積、平均直徑和生物量等表型特征都會發(fā)生改變［1-2］，根系細(xì)胞中的線粒體等細(xì)胞器的形態(tài)和數(shù)目也會出現(xiàn)變化［3］。干旱條件下，丙二醛（malondialdehyde，MDA）會在細(xì)胞中不斷積累，損傷生物膜系統(tǒng)［4-5］，而細(xì)胞中的脯氨酸、可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量會增加，提高細(xì)胞的保水能力［6-7］，一些抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等也會增加活性，幫助植物抵御干旱脅迫［8-12］。因此，這些都可以作為判斷植物對干旱脅迫程度耐受性的重要指標(biāo)。

東北地區(qū)因常年降水較少，在園林植被的選擇上具有一定的特殊性。光叉委陵菜（Potentilla bifurcavar.glabrata）是薔薇科（Rosaceae）委陵菜屬（Potentilla）多年生草本植物，能夠適應(yīng)東北地區(qū)干燥的氣候條件，株型優(yōu)美，花色美觀，根系發(fā)達(dá)，耐粗放管理，可以作為優(yōu)良地被植物在園林中應(yīng)用［13］。目前，對于委陵菜屬植物的研究多集中于資源開發(fā)利用、藥用和觀賞價值、引種馴化及花粉、葉表皮形態(tài)等［14-17］，在生理方面尤其是干旱生理的研究較少。根系直接接觸土壤，當(dāng)植物遭受干旱脅迫時，發(fā)達(dá)的根系是植物獲得水分和養(yǎng)分的重要保證。本研究通過自然控水的方法，測定干旱脅迫下光叉委陵菜的根系表型、結(jié)構(gòu)特征以及根系生理指標(biāo)變化，探討光叉委陵菜的耐旱能力臨界值，可以擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，也可以為耐旱品種的選擇和城市綠化植物品種的豐富提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院苗圃地的光叉委陵菜多年生實(shí)生幼苗為研究對象，選取株高5 cm左右、生長周期一致的植株苗，緩苗處理2周待其生長。將生長正常且高度在15 cm左右的植株移植到直徑15 cm的花盆里，培養(yǎng)基質(zhì)比例為營養(yǎng)土∶蛭石=3∶1，在植物培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行種植，培養(yǎng)室溫度為25℃/18℃（晝/夜），光照強(qiáng)度為4000 lx，時間為16 h/8 h（光/暗）。

1.2 試驗(yàn)方法

2019年4月在東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院植物綜合實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行試驗(yàn)。干旱脅迫處理前植株正常澆水。試驗(yàn)設(shè)定對照組和脅迫組，對照組每天正常澆水，脅迫組分為兩組，其中一組在干旱脅迫0，5，10，15，20，25 d時分別取樣測定根系表型特征及生理指標(biāo)，在0，5，15，25 d時分別取樣觀察根系解剖結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)，另一組在干旱脅迫5，10，15，20，25 d時進(jìn)行復(fù)水處理，并在復(fù)水5 d后對植物材料進(jìn)行取樣，以測定各項(xiàng)生理指標(biāo)。每個測定取樣3株（3次重復(fù)）植株。所取待測樣品放入液氮后保存于-80℃超低溫冰箱。

其中，土壤水分設(shè)置包括：自然狀態(tài)（田間最大持水量的70%～80%）、輕度干旱脅迫（田間最大持水量的60%～70%）、中度干旱脅迫（田間最大持水量的50%～60%）、重度干旱脅迫（田間最大持水量的40%～50%）［18-19］。根據(jù)預(yù)先進(jìn)行的土壤持水量測定，自然失水狀態(tài)下的土壤在干旱0 d為自然狀態(tài)，5、10 d為輕度干旱脅迫，15、20 d為中度干旱脅迫，25 d為重度干旱脅迫。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 根系表型特征的測定 取植株根系洗去多余的土與雜質(zhì)，用Expression 11000 XL根系掃描儀掃描整個根系，用WinRHIZO軟件分析根系的總長、總表面積、總體積及根系直徑的數(shù)據(jù)。參照陳麗飛［20］、襲梅［21］的方法，剪取根系洗凈吸干水分，105℃烘干2 h，65℃下烘干48 h以上至恒重，測量其干重。

1.3.2 根系超微結(jié)構(gòu)的觀察 取植株根系距根尖1 cm以上的部位裝在瓶中，取材大小為1 mm×3 mm，抽真空加入3%的戊二醛固定24 h以上，0.1 mol·L-1磷酸緩沖液沖洗3次，用1%鋨酸固定4 h，去離子水沖洗3次，再用梯度濃度乙醇進(jìn)行脫水處理，丙酮過渡，用環(huán)氧樹脂812進(jìn)行滲透包埋，一段時間后用LKB-5切片機(jī)（LKB Co，Switzerland）切片，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色。用H7650透射電鏡觀察。

1.3.3 根系生理指標(biāo)的測定 參照王學(xué)奎［22］的方法，測定MDA、脯氨酸、可溶性蛋白的含量及SOD活性。

1.3.4 圖片與數(shù)據(jù)處理 用Photoshop軟件進(jìn)行圖片組合，將測定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件進(jìn)行計(jì)算和制表，用SPSS 22.0進(jìn)行方差分析，ANOVA檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對光叉委陵菜根系表型特征的影響

光叉委陵菜的根系總長、根系體積、根系總表面積及根系平均直徑隨著干旱脅迫時間的延長逐漸增加，最大值均出現(xiàn)在25 d時，其中，5～15 d時增長速度較快，20、25 d時增長趨勢變緩。說明植物的根系在輕度和中度的干旱脅迫時能正常生長，在重度的干旱脅迫時植物的根系生長受到抑制。25 d時的根系總長、總表面積、總體積和平均直徑較0 d分別增加了118.45%、34.44%、80.00%、64.10%。根系干重在干旱前期大幅增加，在15 d時達(dá)最大值，最大變化率為38.30%，而在干旱后期則迅速減少，且低于0 d的干重（表1）。

表1 干旱脅迫對光叉委陵菜根系表型特征的影響Table 1 Effect of drought stress on root characteristics of P.bifurca var.glabrata

2.2 干旱脅迫對光叉委陵菜根系超微結(jié)構(gòu)的影響

0 d自然狀態(tài)下（圖1A），光叉委陵菜正常生長，根系的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞壁較厚且完整；線粒體多為圓形或長橢圓形，沿細(xì)胞壁分布，內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)明顯；此時細(xì)胞中不存在淀粉粒。5 d輕度脅迫下（圖1B），細(xì)胞壁較正常狀態(tài)下變??；線粒體數(shù)量呈下降趨勢，形狀與0 d自然狀態(tài)下一致，內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)明顯；淀粉粒出現(xiàn)，數(shù)量較多，充滿在細(xì)胞內(nèi)。15 d中度脅迫下（圖1C），細(xì)胞壁厚度進(jìn)一步變薄；線粒體明顯縮小，內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)不明顯；淀粉粒的數(shù)量減少，但是體積開始變大，分布在細(xì)胞中。25 d重度脅迫下（圖1D），細(xì)胞壁變得更薄，并出現(xiàn)損壞的現(xiàn)象；線粒體消失；淀粉粒的體積與15 d中度脅迫時相比更大。液泡在光叉委陵菜的根系結(jié)構(gòu)中始終沒有出現(xiàn)，這可能與植物的品種或者與植物的生長周期和狀態(tài)有關(guān)。

圖1 干旱脅迫對光叉委陵菜根系超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of drought stress on root ultrastructure of P.bifurca var.glabrata

由表2可以看出，細(xì)胞壁的厚度呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，5 d輕度脅迫、15 d中度脅迫和25 d重度脅迫下的厚度相較于前一脅迫程度分別減少了57.14%、8.33%、9.09%，其中5 d輕度脅迫相較于0 d自然狀態(tài)的變化程度最大，兩種狀態(tài)下的細(xì)胞壁厚度存在顯著差異（P<0.05）。對照時沒有淀粉粒的存在，5 d輕度脅迫時淀粉粒出現(xiàn)，其個數(shù)在15 d中度脅迫時顯著降低（P<0.05），25 d重度脅迫下淀粉粒數(shù)量較15 d中度脅迫時增加但不顯著（P>0.05），但淀粉粒平均直徑一直顯著增加（P<0.05）。線粒體的個數(shù)顯著減少，25 d重度脅迫時線粒體消失（P<0.05）。

表2 干旱脅迫對光叉委陵菜超微結(jié)構(gòu)細(xì)胞器的影響Table 2 Effect of drought stress on ultrastructure organelles of P.bifurca var.glabrata

2.3 干旱脅迫對光叉委陵菜根系生理指標(biāo)的影響

2.3.1 干旱脅迫對光叉委陵菜根系MDA含量的影響 由圖2A可知，隨著干旱脅迫時間的延長，光叉委陵菜體內(nèi)MDA含量持續(xù)顯著增長（P<0.05），5、10、15、20、25 d較0 d分別增長了35.90%、121.99%、152.84%、172.03%、286.30%。說明在干旱脅迫前期，植株抗旱能力較強(qiáng)，能夠有效地抑制MDA的產(chǎn)生，但后期，MDA含量急劇增長，可能是由于干旱脅迫程度的加深破壞了植株的干旱脅迫調(diào)節(jié)系統(tǒng)。復(fù)水后，同一脅迫時間下的MDA含量均有顯著下降（P<0.05），5、10、15、20、25 d脅迫時的MDA含量分別下降了22.70%、34.96%、29.59%、23.26%、15.38%，下降后MDA含量整體水平仍較高。25 d復(fù)水后，MDA含量仍保持在很高的水平，說明重度干旱脅迫對植株造成了較為嚴(yán)重的傷害。

2.3.2 干旱脅迫對光叉委陵菜根系脯氨酸含量的影響 如圖2B所示，當(dāng)干旱時間延長時，光叉委陵菜根系脯氨酸含量呈增加的趨勢。干旱脅迫0～15 d期間，脯氨酸含量增長速度緩慢，不同天數(shù)的含量差異不顯著（P>0.05），但當(dāng)脅迫時間超過15 d后，脯氨酸含量增長速度加快，含量差異顯著（P<0.05）。5、10、15、20、25 d較0 d分別增長了5.43%、8.93%、10.77%、61.62%、181.27%。復(fù)水使脅迫程度減輕，5、10、15、20、25 d復(fù)水后的脯氨酸含量比脅迫時的含量分別下降了0.12%、2.12%、2.22%、9.41%、1.52%，但變化都不顯著（P>0.05）。25 d復(fù)水后，脯氨酸含量仍保持在很高的水平，與復(fù)水前相比僅下降1.52%，說明在重度干旱脅迫下，植株受傷害程度較高，但其根部仍沒有死亡。

2.3.3 干旱脅迫對光叉委陵菜根系可溶性蛋白含量的影響 由圖2C可知，光叉委陵菜可溶性蛋白含量隨干旱脅迫時間的延長呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢?？扇苄缘鞍缀吭?～10 d顯著升高（P<0.05），并在15 d達(dá)到最大值，20～25 d顯著降低（P<0.05），但仍高于0 d的含量。5、10、15、20、25 d較0 d分別增長了47.29%、69.27%、75.87%、62.56%、53.02%。這表明光叉委陵菜在應(yīng)對干旱脅迫時可以產(chǎn)生大量的可溶性蛋白來調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，但是超過一定程度的干旱脅迫可能會對植物細(xì)胞造成損傷，使細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量降低。復(fù)水使脅迫程度減輕，5、10、15、20、25 d復(fù)水后的可溶性蛋白含量均比5、10、15、20、25 d脅迫時的可溶性蛋白含量低，分別下降了0.18%、9.74%、4.10%、10.74%、11.12%。20和25 d復(fù)水后，可溶性蛋白含量顯著下降（P<0.05），但含量仍較高，說明可溶性蛋白在植物緩解較嚴(yán)重的干旱脅迫時仍發(fā)揮著較大的作用。

圖2 干旱脅迫對光叉委陵菜根系生理指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of drought stress on physiological index of root system of P.bifurca var.glabrata

2.3.4 干旱脅迫對光叉委陵菜根系SOD活性的影響 由圖2D可知，隨著干旱處理的時間延長，光叉委陵菜SOD活性在不同的處理時間下均發(fā)生顯著改變（P<0.05），并呈先上升后下降的趨勢，在15 d時達(dá)到最大值。5、10、15、20、25 d的SOD活性均高于0 d，分別增長了183.61%、290.47%、1049.25%、590.19%、117.47%。說明SOD活性在光叉委陵菜遭受干旱脅迫時較為敏感。復(fù)水在一定程度上減輕了干旱對植物造成的損傷，不同干旱天數(shù)復(fù)水后，SOD活性均有所下降，5、10、15、20、25 d復(fù)水后的SOD活性比5、10、15、20、25 d脅迫時低，分別下降了29.44%、20.86%、20.22%、17.65%、6.12%。干旱5～20 d復(fù)水后SOD活性均有顯著下降（P<0.05），但脅迫25 d時的SOD活性已下降到很低的水平，且復(fù)水后僅下降6.12%，下降不顯著（P>0.05），說明重度干旱脅迫已對光叉委陵菜的SOD酶系統(tǒng)造成破壞。

3 討論

3.1 干旱脅迫對植物根系表型特征的影響

根系是土壤-植株-大氣水循環(huán)過程中的關(guān)鍵一環(huán)，在干旱的環(huán)境中，根系的適應(yīng)能力尤為關(guān)鍵，植物的生長發(fā)育水平以及對外界環(huán)境的適應(yīng)能力可以通過根系的結(jié)構(gòu)特征來體現(xiàn)［23］。在遭受脅迫時，植物往往通過維持較大的根系長度、總表面積、總體積、平均直徑和調(diào)節(jié)生物量等方面來維持自身的水分吸收和運(yùn)輸能力，提高自身抗旱性。根系長度是評價根系吸收能力的重要指標(biāo)之一，較長的根系可以吸收更多的水分，使植物有效抵御干旱［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)干旱脅迫的時間延長時，光叉委陵菜的根系長度與對照組相比有所降低，說明根系生長受到了干旱的影響，而Wang等［25］發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫顯著降低了高羊茅（Festuca elata）的根系總長度，這與本研究結(jié)果一致。Pirnajmedin等［26］研究認(rèn)為根系的體積、干重、總表面積等與植物的抗旱能力呈正相關(guān)。本研究中，光叉委陵菜根系的總表面積、總體積以及根系平均直徑在干旱脅迫過程中呈現(xiàn)增加趨勢，且在整個脅迫過程中的增長量與對照組相比較少但差異不顯著，說明其根系具有一定的抗旱能力，能夠抵抗一定程度的干旱脅迫，在受到脅迫時仍然會進(jìn)行生長過程。對植物根系的干重進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，光叉委陵菜的根系干重先增加后降低，這可能是由于較嚴(yán)重的水分脅迫影響了植物的正常生長，根系被破壞，也可能是植物把碳水化合物的分配重心轉(zhuǎn)移到了莖葉上，使植株能更好地進(jìn)行光合作用，增強(qiáng)競爭力［27］。

3.2 干旱脅迫對植物根系結(jié)構(gòu)的影響

植株超微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律是判斷其抗旱能力的重要指標(biāo)［28］。本研究中，隨著干旱脅迫加重，光叉委陵菜根系的細(xì)胞壁變薄，淀粉粒的數(shù)量先增加后減少但體積不斷增加，線粒體數(shù)量減少且結(jié)構(gòu)不清晰直至完全消失，液泡始終未出現(xiàn)。對于線粒體的變化，本研究結(jié)果與衛(wèi)星等［29］結(jié)果一致。有研究表明，隨著干旱程度的加重，線粒體會發(fā)生內(nèi)嵴、外膜降解和內(nèi)腔空洞化等一系列結(jié)構(gòu)變化［30］，這印證了本研究的結(jié)果。線粒體作為三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的主要場所，在細(xì)胞中消失，說明重度脅迫下根系細(xì)胞已經(jīng)難以維持正常的生理功能，這或許導(dǎo)致了根系結(jié)構(gòu)的擴(kuò)散。有研究發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫時，淀粉粒出現(xiàn)較少［31］，原因可能是干旱脅迫使得類囊體膜結(jié)構(gòu)發(fā)生了異常，從而降低了光合作用，導(dǎo)致光合產(chǎn)物減少，最終導(dǎo)致根系細(xì)胞淀粉粒數(shù)量減少［32］。但是在本研究中，隨著干旱脅迫程度的增加，淀粉粒的數(shù)量先增后減，淀粉粒的體積不斷地增加，這可能與植物材料本身有關(guān)，也可能是因?yàn)殡S著干旱脅迫程度的增加光叉委陵菜的根系通過增加淀粉粒的數(shù)量來緩解能量的短缺，從而抵抗遭受的逆境脅迫。

3.3 干旱脅迫對植物根系生理特性的影響

植物處在干旱狀態(tài)下時，會產(chǎn)生大量的O2-和H2O2等具有強(qiáng)氧化能力的活性氧（reactive oxygen species，ROS），發(fā)生膜脂過氧化反應(yīng)產(chǎn)生MDA，氧化膜的有序性、結(jié)構(gòu)性會降低，膜透性增大，最終影響植物細(xì)胞的代謝［33］。在本研究中，干旱脅迫時間的不斷延長，加劇了植物體內(nèi)的過氧化反應(yīng)，光叉委陵菜根系的MDA含量不斷上升，嚴(yán)重的膜脂過氧化作用使生物膜系統(tǒng)遭到破壞，各類細(xì)胞器膜逐漸斷裂、分解，這可能是導(dǎo)致線粒體消失的主要原因之一。復(fù)水能夠顯著降低MDA在植物體內(nèi)的含量，緩解膜脂過氧化，這和肖凡等［34］的研究結(jié)果一致。完整且有序的膜系統(tǒng)可以保證細(xì)胞中各個區(qū)域的生理生化反應(yīng)能夠有條不紊地進(jìn)行［35］，而膜脂過氧化作用導(dǎo)致的滲漏會破壞這種代謝分區(qū)，從而釋放或激活大量的水解酶，降低植物的抗旱性［36］，因此隨干旱脅迫時間的延長，復(fù)水前后的MDA含量差值逐漸減小。

干旱脅迫下，植物會增加細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以維持細(xì)胞內(nèi)的膨壓，保證植物進(jìn)行正常生理代謝活動［37］。脯氨酸和可溶性蛋白作為理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以通過主動積累來降低細(xì)胞滲透勢［38］。干旱脅迫前期，可能是因?yàn)楣獠嫖瓴丝寡趸缸饔幂^大，能有效地清除細(xì)胞中的ROS，降低膜脂過氧化作用對細(xì)胞造成的影響，因此脯氨酸含量僅有略微升高，而干旱15 d后，較嚴(yán)重的干旱脅迫破壞了植物的抗氧化酶系統(tǒng)，此時脯氨酸迅速大量積累以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，緩解干旱對植物的傷害，李鵬等［39］的研究中也得出了類似的結(jié)論。植物在逆境脅迫下，會將體內(nèi)的不溶性蛋白轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白，增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)能力［40］。本研究中，可溶性蛋白含量的最大值出現(xiàn)在15 d，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這與陳明濤等［41］的研究結(jié)果一致。脅迫前期蛋白質(zhì)含量增加，可能是由于膜損傷釋放出了蛋白質(zhì)，蛋白酶活性升高使蛋白質(zhì)水解，而水解所得的氨基酸又用于合成如抗氧化酶和脫水蛋白等響應(yīng)干旱脅迫的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致光叉委陵菜根系內(nèi)可溶性蛋白含量進(jìn)一步提高［42］。而在脅迫后期，較嚴(yán)重的干旱脅迫可能抑制了蛋白質(zhì)的合成并加速了蛋白質(zhì)的降解，使可溶性蛋白含量降低［43］。

一般研究認(rèn)為，抗氧化酶的活性與植物的抗旱性密切相關(guān)［44-45］。SOD是植物體內(nèi)的關(guān)鍵抗氧化酶，可以降低膜脂過氧化作用，有效清除ROS，從而保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，通常利用其活性變化情況來反映植物的逆境適應(yīng)能力［46］。干旱脅迫前期，植物體內(nèi)的SOD活性逐漸增加，增強(qiáng)了細(xì)胞清除ROS的能力，但隨著脅迫繼續(xù)進(jìn)行，不斷積累的ROS加劇了膜脂的過氧化程度，細(xì)胞有限的抗氧化能力使得ROS的形成和清除之間的動態(tài)平衡被打破，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境逐漸紊亂，抗氧化酶系統(tǒng)受到影響，SOD的活性隨脅迫時間的延長逐漸下降。季楊等［47］的研究也得出了類似的結(jié)果。復(fù)水后，植物的干旱情況得到緩解，細(xì)胞內(nèi)的膜脂過氧化作用減弱，因此SOD活性均較復(fù)水前有所降低。結(jié)果表明，光叉委陵菜的抗氧化防御系統(tǒng)具有一定的潛力去應(yīng)對重度干旱脅迫對其造成的傷害。

4 結(jié)論

干旱脅迫對光叉委陵菜根系總長度、總表面積、總體積和根系平均直徑的影響較小，但根系干重隨干旱脅迫時間的延長呈現(xiàn)波動趨勢，0～15 d上升，20～25 d顯著下降（P<0.05）。

當(dāng)干旱脅迫時間延長時，根系MDA的含量逐漸增加，復(fù)水后含量降低顯著（P<0.05）；根系脯氨酸的含量一直上升，20～25 d顯著增加（P<0.05），復(fù)水后含量較復(fù)水前上升不顯著（P>0.05）；可溶性蛋白的含量先升高后降低，20～25 d復(fù)水后含量較復(fù)水前上升顯著（P<0.05）；SOD活性在0～15 d顯著上升（P<0.05），20～25 d顯著下降（P<0.05），復(fù)水后不同脅迫時間的SOD活性幾乎都顯著下降（P<0.05），但25 d復(fù)水后SOD活性基本無法恢復(fù)。

綜合以上結(jié)果，光叉委陵菜能耐20 d的自然干旱，具有較強(qiáng)的抗旱性，可以作為東北地區(qū)的抗旱植物。