王少華 趙國(guó)連 王佩 談小文 崔曉利 康磊 黨麗云

近年來(lái)，耐藥結(jié)核病患者的增多給結(jié)核病的防控工作帶來(lái)重大威脅，對(duì)結(jié)核病耐藥性及時(shí)準(zhǔn)確的診斷和治療是控制耐藥結(jié)核病傳播的重要手段之一。目前對(duì)于結(jié)核分枝桿菌(MTB)耐藥性的檢測(cè)分為基因型藥敏檢測(cè)和表型藥敏檢測(cè)(phenotypic drug susceptibility testing，pDST)。傳統(tǒng)的pDST受到培養(yǎng)基上MTB生長(zhǎng)速度的限制，一般需要4～6周才能獲得耐藥性結(jié)果，這使得患者病情延誤，還增加了耐藥結(jié)核病傳播的風(fēng)險(xiǎn)[1]。近幾年，多種基因型藥敏試驗(yàn)如熒光PCR探針熔解曲線法(簡(jiǎn)稱“熔解曲線法”)、GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“Xpert”)通過(guò)檢測(cè)利福平耐藥性決定區(qū)域rpoB基因(RRDR)內(nèi)的突變來(lái)檢測(cè)利福平耐藥性[2-3]。與傳統(tǒng)的pDST方法相比，熔解曲線法檢測(cè)能夠在短時(shí)間內(nèi)完成耐藥篩查，為患者的精準(zhǔn)治療提供了便捷。然而，目前對(duì)于基因型和pDST檢測(cè)利福平藥敏試驗(yàn)結(jié)果不一致的情況成為結(jié)核病診斷治療中的一個(gè)新的難題。

目前有研究顯示不同耐藥基因突變會(huì)導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌不同的耐藥水平，例如Leu511Pro、His526Asn和Asp516Tyr等突變會(huì)導(dǎo)致利福平低水平耐藥，這些低水平耐藥菌株或許是造成基因型與pDST結(jié)果不一致的主要原因[4]。因此，本研究對(duì)熔解曲線法與微孔板法利福平藥敏試驗(yàn)結(jié)果不一致菌株進(jìn)行了回顧性分析，通過(guò)對(duì)基因測(cè)序分析rpoB基因不同突變位點(diǎn)與耐藥結(jié)果不一致的相關(guān)性，以揭示與使用熔解曲線法和微孔板法獲得的不一致利福平藥敏試驗(yàn)結(jié)果有關(guān)的因素。

資料和方法

一、資料來(lái)源

收集2019年8月至2020年9月西安市胸科醫(yī)院收治的培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)核病患者資料，共2562例。其中1298例患者用同一份痰液標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行pDST和熔解曲線法耐藥基因檢測(cè)，再根據(jù)病例篩選出基因型與pDST利福平耐藥結(jié)果不一致的患者54例?；蛐退幟羰遣捎萌劢馇€法獲得，pDST采用分枝桿菌藥敏微孔板法獲得。對(duì)所有不一致分離株重復(fù)進(jìn)行微孔板法，以及對(duì)rpoB基因的部分DNA片段使用Sanger測(cè)序。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.標(biāo)本處理：痰標(biāo)本使用N-乙?；?L-半胱氨酸-氫氧化鈉消化15 min,然后加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值為7.0),3000×g離心15 min,將沉淀再次懸浮于2 ml PBS緩沖液中備用。取處理后標(biāo)本0.5 ml接種在BACTEC MGIT 960分枝桿菌生長(zhǎng)指示管中進(jìn)行培養(yǎng)，另取0.5 ml進(jìn)行MTB核酸提取。

2.分離培養(yǎng)：痰液標(biāo)本經(jīng)處理接種于BACTEC MGIT 960分枝桿菌生長(zhǎng)指示管(美國(guó)BD公司)，然后在BACTEC MGIT 960儀器(美國(guó)BD公司)中孵育，儀器報(bào)陽(yáng)后按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]要求進(jìn)行涂片萋尼染色鏡檢，確認(rèn)分枝桿菌生長(zhǎng)。并采用MTB64抗原檢測(cè)試劑(杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)鑒定結(jié)核分枝桿菌。

3.pDST試驗(yàn)：pDST是采用分枝桿菌藥敏試劑盒(培養(yǎng)法)(珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司)對(duì)患者痰液標(biāo)本培養(yǎng)所得MTB陽(yáng)性菌液進(jìn)行微孔板法的pDST檢測(cè)。對(duì)利福平提供1.0、2.0、4.0和8.0 μg/ml藥物濃度進(jìn)行微孔板稀釋法體外藥敏檢測(cè)。按照制造商操作手冊(cè)進(jìn)行操作。根據(jù)中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的制造商說(shuō)明，微孔板法利福平判讀標(biāo)準(zhǔn)為：1.0 μg/ml敏感，2.0 μg/ml敏感，4.0 μg/ml耐藥，8.0 μg/ml耐藥。每批次微孔板法試驗(yàn)均用MTB標(biāo)準(zhǔn)參考菌株(H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株)進(jìn)行同步室內(nèi)質(zhì)量控制。

4.基因型藥敏試驗(yàn)：熔解曲線法耐藥基因檢測(cè)采用結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)對(duì)患者痰液標(biāo)本提取的MTB陽(yáng)性核酸進(jìn)行耐藥性檢測(cè)。根據(jù)制造商說(shuō)明書進(jìn)行試驗(yàn)操作。結(jié)果判斷參考試劑說(shuō)明書：通過(guò)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因507～533共27個(gè)氨基酸密碼子的突變判定利福平耐藥性；比較檢測(cè)樣品與陽(yáng)性對(duì)照之間熔解曲線的熔點(diǎn)(Tm值)的差異判斷樣品是否發(fā)生突變。

5.rpoB基因測(cè)序及分析：應(yīng)用煮沸法對(duì)培養(yǎng)后的細(xì)菌提取基因組DNA。參考以往報(bào)道[6]將提取后DNA核酸應(yīng)用引物rpoB-F (5′-CTTGCACGA-GGGTCAGACCA-3′)和rpoB-R (5′-ATCTCGTC-GCTAACCACGCC-3′)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 5 min 預(yù)變性，95 ℃ 30 s變性, 60 ℃ 30 s退火和72 ℃ 45 s延伸，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后送檢生工生物工程有限公司(上海，中國(guó))進(jìn)行Sanger測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用MEGA-X軟件以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行序列比對(duì)。本研究是基于大腸桿菌編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行分析。

結(jié) 果

一、兩種檢測(cè)方法利福平耐藥檢測(cè)結(jié)果

1294例結(jié)核病患者在西安市胸科醫(yī)院同時(shí)進(jìn)行熔解曲線法耐藥基因檢測(cè)和微孔板法藥敏檢測(cè)，其中熔解曲線法檢測(cè)206例(15.92%)為突變型，微孔板法檢測(cè)169例(13.06%)為耐藥型。54例(4.17%)熔解曲線法耐藥基因檢測(cè)與微孔板法檢測(cè)結(jié)果不一致的患者中，45例為熔解曲線法檢測(cè)突變而微孔板法檢測(cè)敏感，8例為熔解曲線法檢測(cè)野生型而微孔板法檢測(cè)耐藥。其中1例在熔解曲線法耐藥基因檢測(cè)中顯示異質(zhì)性耐藥而微孔板法顯示敏感，未納入分析。對(duì)納入分析的53株菌株進(jìn)行微孔板法藥敏的復(fù)核，發(fā)現(xiàn)除1株菌株丟失未進(jìn)行復(fù)核和1株結(jié)果無(wú)效外，其余結(jié)果與首次的微孔板法結(jié)果相同。且8株熔解曲線法檢測(cè)野生型而微孔板法檢測(cè)耐藥的菌株全部為同時(shí)耐異煙肼的耐多藥菌株。

二、熔解曲線法檢測(cè)rpoB突變區(qū)域與微孔板法 MIC結(jié)果分析

熔解曲線法檢測(cè)到的206例突變型，其中rpoB基因507～512位密碼子突變占16.50%(34/206)，rpoB基因513～520位密碼子突變占3.40%(7/206)，rpoB基因521～528位密碼子突變占14.56%(30/206)，rpoB基因529～533位密碼子突變占57.77%(119/206)，另有16例多位點(diǎn)突變；其中rpoB基因在507～512位密碼子發(fā)生突變時(shí)，其與微孔板法結(jié)果不一致率最高，為70.59%(24/34)，且不一致的菌株微孔板法MIC的測(cè)定值多分布在≤1 μg/ml。當(dāng)rpoB基因在529～533位密碼子發(fā)生突變時(shí)，其與微孔板法結(jié)果不一致率最低，為6.72%(8/119)(表1)。

表1 熔解曲線法檢測(cè)rpoB突變區(qū)域與微孔板法MIC結(jié)果分析

三、基因型與pDST不一致菌株rpoB基因突變位點(diǎn)分布

本研究對(duì)納入分析的53株不一致分離株rpoB基因的部分DNA片段使用Sanger測(cè)序。在熔解曲線法突變而微孔板法敏感的45株菌株中rpoB基因RRDR序列均發(fā)現(xiàn)了突變，42株菌株為單位點(diǎn)突變，3株菌株發(fā)生了2～3個(gè)位點(diǎn)突變。其中Leu511Pro是觀察到最多的突變位點(diǎn)，占所有不一致菌株的45.28%(24/53)，集中在熔解曲線法檢測(cè)突變區(qū)域的507～512位密碼子，另外還有2株多位點(diǎn)突變菌株也發(fā)生了Leu511Pro突變；其次觀察到較多的突變是Leu533Pro，占所有不一致菌株的15.09%(8/53)，Asp516Tyr 和His526Asn突變率均為5.66%(3/53)；rpoB基因Leu511Pro、Leu533 Pro、Asp516Tyr 和His526Asn是導(dǎo)致熔解曲線法與微孔板法藥敏結(jié)果不一致的主要突變點(diǎn)，占測(cè)序結(jié)果突變而微孔板法敏感菌株的84.44%。8株熔解曲線法檢測(cè)敏感而微孔板法檢測(cè)耐藥的菌株進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示rpoB基因區(qū)域未發(fā)生突變。本研究未發(fā)現(xiàn)RRDR區(qū)域內(nèi)的同義突變和沉默突變(表2)。

討 論

近幾年，隨著熔解曲線法、Xpert等多種MTB基因型藥敏試驗(yàn)的廣泛應(yīng)用，明顯提高了利福平耐藥結(jié)核病的診斷與管理水平[7]。然而隨之出現(xiàn)的MTB利福平基因型和pDST檢測(cè)不一致結(jié)果成為結(jié)核病診斷治療的一個(gè)新難題。筆者回顧性分析了53例利福平熔解曲線法與微孔板法藥敏結(jié)果不一致患者的標(biāo)本，通過(guò)rpoB基因測(cè)序，以評(píng)估不同基因突變位點(diǎn)與不一致結(jié)果的相關(guān)性。

本研究收集的54例熔解曲線法基因型與微孔板法表型檢測(cè)利福平耐藥結(jié)果不一致的患者資料。為了驗(yàn)證微孔板法藥敏結(jié)果的可靠性，筆者對(duì)53例結(jié)果不一致的菌株進(jìn)行微孔板法藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示熔解曲線法檢測(cè)突變型而微孔板檢測(cè)敏感的45例菌株重復(fù)實(shí)驗(yàn)均為敏感， 8例熔解曲線法檢測(cè)野生型而微孔板法檢測(cè)耐藥患者均為耐藥，且全部為同時(shí)對(duì)異煙肼耐藥的耐多藥菌株。分析這8例患者熔解曲線檢測(cè)敏感的原因可能為該菌株有發(fā)生在RRDR區(qū)域外的其他突變，據(jù)報(bào)道只有95%的利福平耐藥分離株在rpoB基因的81 bp熱點(diǎn)區(qū)域內(nèi)發(fā)生突變[8]，剩余5%的耐藥性可能由其他位點(diǎn)突變或者存在其他對(duì)利福平耐藥的機(jī)制,比如MTB外排泵基因的過(guò)表達(dá)[9]。

研究中值得注意的是，當(dāng)熔解曲線法檢測(cè)rpoB基因在507～512位密碼子發(fā)生突變時(shí)，其與微孔板法結(jié)果不一致率高達(dá)70.59%，且不一致的菌株在微孔板法中MIC的測(cè)定值多分布在≤1 μg/ml。Miotto等[10]對(duì)意大利地區(qū)的研究顯示,與pDST結(jié)果相比有爭(zhēng)議的突變位點(diǎn)為511、516、526、533密碼子，與本文的研究相似，且與無(wú)爭(zhēng)議的位點(diǎn)相比較，表現(xiàn)出更低的MIC值，和本文結(jié)論不同的是其與pDST結(jié)果比較不一致率最高的突變位點(diǎn)為526位密碼子。國(guó)內(nèi)也有報(bào)道MIC的測(cè)定值在≤1 μg/ml的菌株在所有不一致菌株中占比較大，且Leu511Pro為觀察到的導(dǎo)致這種不一致結(jié)果的最常見(jiàn)的突變[11]。后者與本文研究結(jié)果相似。分析兩者不同的原因可能與地域差異有關(guān)。由于在臨床工作中，熔解曲線檢測(cè)方法結(jié)果回報(bào)時(shí)間往往早于微孔板法檢測(cè)，這提示我們?cè)谂R床工作中要高度重視熔解曲線法507～512位密碼子突變的菌株，這些患者極有可能會(huì)出現(xiàn)基因型與pDST結(jié)果不一致的情況，有必要觀察利福平對(duì)結(jié)核病患者的療效并及時(shí)調(diào)整用藥方案。另外，目前對(duì)于熔解曲線法耐藥檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告格式，很多醫(yī)院僅給予耐藥或者敏感的結(jié)論是不夠的，實(shí)際工作中檢驗(yàn)科應(yīng)該出具包含耐藥突變區(qū)域的報(bào)告單以對(duì)臨床提供參考。甚至還可以通過(guò)提供不同區(qū)域的ΔTm值來(lái)初步評(píng)估可能出現(xiàn)的突變位點(diǎn)，正如有研究顯示，在不同區(qū)域及不同位點(diǎn)發(fā)生的突變所對(duì)應(yīng)的ΔTm均有所差異[12]。

本研究顯示rpoB基因Leu511Pro、Leu533 Pro、Asp516Tyr 和His526Asn是導(dǎo)致熔解曲線法與微孔板法結(jié)果不一致的主要突變點(diǎn)，占測(cè)序結(jié)果突變而微孔板法敏感菌株的84.44%。Huo等[11]研究顯示Leu511Pro、Leu533 Pro、His526Leu、Asp516Tyr是導(dǎo)致基因型與pDST結(jié)果不一致的主要突變位點(diǎn)，和本研究結(jié)果相似。然而，由于測(cè)序的樣本量有限或者地區(qū)分布原因，Shea等[13]研究RRDR內(nèi)不會(huì)出現(xiàn)影響利福平耐藥的非同義突變(Thr427Ala)和沉默突變(Thr427Thr和Arg447Arg)。本研究未發(fā)現(xiàn)此結(jié)論。多項(xiàng)研究顯示這些特定位點(diǎn)的突變，會(huì)導(dǎo)致突變菌株出現(xiàn)低水平耐藥[11,14]。但是對(duì)于Leu533Pro突變的發(fā)生，前者M(jìn)IC值為≤0.25 μg/ml，表現(xiàn)為敏感，而后者的研究中顯示Leu533Pro突變的MIC值為1～4 μg/ml，表現(xiàn)為低水平耐藥。所以對(duì)上述位點(diǎn)的突變所對(duì)應(yīng)的MIC值還需要進(jìn)一步數(shù)據(jù)的驗(yàn)證。

Rigouts等[15]研究顯示，除了突變位點(diǎn)的影響因素，不同的pDST方法也會(huì)對(duì)以上位點(diǎn)突變的菌株呈現(xiàn)不一致的結(jié)果，對(duì)位于密碼子Lys513Pro 和Leu531Trp的突變，羅氏固體比例法藥敏試驗(yàn)和BACTEC MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果完全一致，以上突變?cè)趦煞N方法中均表現(xiàn)為耐藥。然而對(duì)于Leu511Pro，Asp516Tyr， Leu533 Pro，Ile572Phe突變，羅氏固體比例法藥敏試驗(yàn)和BACTEC MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果高度不一致，常表現(xiàn)為固體比例法結(jié)果為耐藥而B(niǎo)ACTEC MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果為敏感，這樣導(dǎo)致BACTEC MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)對(duì)部分耐藥菌株發(fā)生漏檢。而目前尚未有微孔板法藥敏試驗(yàn)與固體藥敏對(duì)以上突變位點(diǎn)利福平耐藥結(jié)果的差異性研究，本研究使用的微孔板法藥敏試驗(yàn)是否因?yàn)榉椒▽W(xué)而導(dǎo)致基因型與pDST結(jié)果不一致還值得進(jìn)一步深入研究。

本研究的局限性：(1)微孔板藥敏檢測(cè)試劑盒雖然經(jīng)過(guò)了中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)，但是其基于肉湯培養(yǎng)基的微量稀釋法與WHO推薦的臨界濃度(1 μg/ml)存在一定的系統(tǒng)差異。(2)熔解曲線法雖然在耐藥結(jié)核病的診斷上應(yīng)用廣泛，但是其對(duì)于細(xì)菌低載量的標(biāo)本無(wú)法得到有效檢測(cè)結(jié)果，這也使得我們的研究無(wú)法評(píng)估細(xì)菌低載量標(biāo)本的一致性。(3)部分rpoB基因測(cè)序，而不是全基因組測(cè)序可能會(huì)漏掉RRDR區(qū)域之外的耐藥性突變，對(duì)于基因型敏感而表型耐藥的菌株解釋不到位。(4)熔解曲線法能夠清晰地辨別異質(zhì)性耐藥，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群內(nèi)同時(shí)存在敏感菌和耐藥菌時(shí)，結(jié)果會(huì)呈現(xiàn)2個(gè)不同的峰線[2]。本研究中出現(xiàn)1例熔解曲線法檢測(cè)出異質(zhì)性耐藥而微孔板法檢測(cè)為敏感的患者標(biāo)本。然而微孔板法作為pDST的檢測(cè)方法，并不能檢測(cè)出異質(zhì)性耐藥，故此例患者標(biāo)本未納入比較分析。這可能是因?yàn)闃颖局心退幘瓯壤^(guò)低引起的，也提示在解釋基因型與pDST不一致的結(jié)果時(shí)，不能排除異質(zhì)性耐藥的影響。

綜上，引起結(jié)核分枝桿菌基因型與表型利福平藥敏試驗(yàn)結(jié)果不一致的rpoB基因主要突變位點(diǎn)為L(zhǎng)eu511Pro、Leu533 Pro、Asp516Tyr和His526Asn。這些突變位點(diǎn)的描述可以解釋臨床工作中遇到的不一致的藥敏試驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)也亟需一個(gè)新的臨界濃度來(lái)區(qū)分利福平敏感與耐藥，以便更好的治療利福平耐藥患者。