陸霓虹 沈凌筠 劉洪璐 陳楊君 杜映榮

抗結(jié)核藥物導(dǎo)致的肝損傷(anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ATB-DILI)在臨床中的發(fā)生率約為8%～10%；因ATB-DILI導(dǎo)致的結(jié)核病患者停藥比例占臨床患者的5%～10%，導(dǎo)致結(jié)核病耐藥風(fēng)險(xiǎn)升高[1]；同時(shí)，ATB-DILI 的發(fā)生也會(huì)進(jìn)一步加重患者的治療負(fù)擔(dān)[2]。ATB-DILI的發(fā)生機(jī)制及影響因素尚未明確?；|(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases，MMP)是一組與鋅結(jié)合的、分解胞外基質(zhì)的蛋白酶，參與胚胎正常發(fā)育及組織重塑，并在多種病理過程中發(fā)揮作用，如炎癥反應(yīng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、惡性腫瘤浸潤(rùn)、動(dòng)脈粥樣硬化、腦血管病和多發(fā)性硬化等[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道MMP與肝纖維化有相關(guān)性[4]，但是否與藥物性肝損傷有相關(guān)性，目前未見報(bào)道。為此，筆者選取ATB-DILI患者作為研究對(duì)象，檢測(cè)其MMP水平，嘗試探究MMP與ATB-DILI的相關(guān)性，以為預(yù)防及治療ATB-DILI尋找新的研究方向。

對(duì)象和方法

1.研究對(duì)象：采用回顧性研究方法，收集2019年6月至2020年6月昆明市第三人民醫(yī)院收治的肺結(jié)核患者中發(fā)生ATB-DILI的98例患者作為病例組，其中，男61例(62.2%)，女37例(37.8%)；年齡范圍為18～57歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為29.2(18.4，56.6)歲。選取同期門診健康體檢者30名作為對(duì)照組，其中，男19名(63.3%)，女11名(36.7%)，年齡范圍為18～43歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為27.5(20.5，42.9)歲。本研究經(jīng)昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(201902313)，所有研究對(duì)象均經(jīng)知情同意。

2.診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)ATB-DILI診斷：患者使用2H-R-Z-E/4H-R(H：異煙肼；R：利福平；Z：吡嗪酰胺；E：乙胺丁醇)抗結(jié)核治療方案，在抗結(jié)核治療過程中出現(xiàn)肝損傷，肝損傷與抗結(jié)核藥物的使用直接相關(guān)。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《抗結(jié)核藥物性肝損傷診治指南(2019年版)》[5]；(2)肺結(jié)核診斷：參照《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[6]。

3.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝炎等患者；(2)患有導(dǎo)致免疫功能低下疾病(如腫瘤、糖尿病等)的患者；(3)接受免疫調(diào)節(jié)治療(包括激素、免疫抑制劑等)者；(4)患有其他導(dǎo)致肝損傷相關(guān)疾病者。

4.ATB-DILI臨床分型：根據(jù)《抗結(jié)核藥物性肝損傷診治指南(2019年版)》進(jìn)行分型[5]。(1)肝細(xì)胞損傷型(A組)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)>3倍正常上限(ULN)，且R值[(ALT的實(shí)測(cè)值/ALT的ULN)/(ALP的實(shí)測(cè)值/ALP的ULN)]≥5；(2)膽汁淤積型(B組)：堿性磷酸酶(ALP)>2倍ULN，且R值≤2，血清ALP水平升高，且先于ALT升高，或ALP升高幅度較ALT升高更明顯；(3)肝血管損傷型(C組)，ALT>3倍ULN，R值≥2(伴血管彩色多普勒超聲表現(xiàn))；(4)混合型(D組)：ALT>3倍ULN，ALP>2倍ULN，且2

5.ATB-DILI嚴(yán)重程度分級(jí)：(1)0級(jí)(無肝損傷)：患者對(duì)暴露藥物可耐受，無肝毒性反應(yīng)。(2)1級(jí)(輕度肝損傷)：血清ALT和(或)ALP呈可恢復(fù)性升高，總膽紅素<2.5倍ULN(42.8 μmol/L)，且國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio，INR)<1.5。(3)2級(jí)(中度肝損傷)：血清ALT和(或)ALP升高，總膽紅素≥2.5倍ULN，或雖無總膽紅素升高但I(xiàn)NR>1.5。(4)3級(jí)(重度肝損傷)：血清ALT和(或)ALP升高，總膽紅素≥5倍ULN(50 mg/L 或85.5 μmol/L)，伴或不伴INR>1.5。(5)4級(jí)(急性肝功能衰竭)：血清ALT和(或)ALP水平升高，總膽紅素>10倍ULN(17.1 μmol/L)或每小時(shí)升高>10 mg/L或17.1 μmol/L，INR>2.0或凝血酶原活動(dòng)度(PTA)<40%，可同時(shí)出現(xiàn)腹腔積液、肝性腦病或與肝損傷相關(guān)的其他器官功能衰竭。(6)5級(jí)(致命)：因肝損傷死亡，或需接受肝移植才能存活。

6.基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)檢測(cè)：采集研究對(duì)象晨起空腹靜脈血6 ml，抗凝管裝置混勻后，室溫靜置15～30 min。以1100×g離心15～20 min，收集上清液，如有沉淀需再次離心。血清MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-13、MMP-14濃度檢測(cè)采用雙抗體夾心法，試劑盒選用人MMP定量分析酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒[購(gòu)自上海巧伊生物科技有限公司(貨號(hào)分別為ab66062和m1058665)]。酶標(biāo)儀為美國(guó)Molecular Innovations公司的SPECTCA MAX190。酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(A值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清樣本中不同MMP的含量。

結(jié) 果

1.基本情況：按照ATB-DILI臨床分型，病例組中A組51例，B組12例，C組15例，D組20例。病例組(各臨床分型亞組)與對(duì)照組研究對(duì)象各基本特征的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。ATB-DILI嚴(yán)重程度分級(jí)，病例組中1級(jí)33例，2級(jí)27例，3級(jí)22例，4級(jí)14例，5級(jí)2例。

表1 研究對(duì)象基本特征在不同臨床分型ATB-DILI組和健康對(duì)照組間分布情況的比較

2.MMP水平組間比較：比較病例組(各臨床分型亞組)和對(duì)照組MMP水平差異，發(fā)現(xiàn)MMP-1和MMP-9在A組中明顯升高，MMP-2和MMP-14在C組中明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 各基質(zhì)金屬蛋白酶在不同臨床分型ATB-DILI組和健康對(duì)照組間水平的比較

3.MMP水平相關(guān)性分析：分析ATB-DILI嚴(yán)重程度與MMP水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，MMP-9與ATB-DILI嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-13、MMP-14與ATB-DILI嚴(yán)重程度無明顯相關(guān)性(表3)。

表3 各基質(zhì)金屬蛋白酶與ATB-DILI嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

討 論

ATB-DILI的發(fā)病機(jī)制至今未有定論，目前有多種學(xué)說，如炎癥機(jī)制、免疫機(jī)制、線粒體損傷機(jī)制等[7]。炎癥機(jī)制學(xué)說論證ATB-DILI為藥物導(dǎo)致炎癥因子分泌增加，多重因素致肝細(xì)胞損傷[8]。本研究結(jié)果顯示，MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-14在ATB-DILI患者中明顯升高，同時(shí)，以往研究也證實(shí)MMP家族也與多種炎癥效應(yīng)有關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了炎癥機(jī)制學(xué)說的可能。

MMP-1與MMP-9均屬于MMP家族中的明膠酶，受多種炎癥因子[如白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-6]影響，也在多種炎癥細(xì)胞中表達(dá)[9]。MMP-1與MMP-9分泌增加，尤其是在肝細(xì)胞損傷型ATB-DILI 患者中表達(dá)明顯上升，提示MMP-1、MMP-9與肝細(xì)胞損傷有關(guān)，與相關(guān)研究結(jié)果相符[10]。MMP-2與MMP-14為MMP家族中的另一類蛋白酶。MMP-14為膜型MMP，與MMP-2互相作用，協(xié)同增加分泌及促進(jìn)血管成纖維細(xì)胞增生。MMP-2與MMP-14參與內(nèi)皮細(xì)胞基底膜降解，促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移和增殖，導(dǎo)致新生血管、新生微血管和基底膜形成[11]。MMP-2與MMP-14也參與多種炎癥機(jī)制的發(fā)生，在炎癥因子刺激下表達(dá)增加，促進(jìn)血管損傷，導(dǎo)致炎癥進(jìn)展[12]。本研究結(jié)果顯示，MMP-2與MMP-14水平在肝血管損傷型ATB-DILI 患者中明顯升高，可能提示MMP-2與MMP-14參與血管損傷，在促進(jìn)血管異常增生方面作用更為明顯。這種改變與其他MMP以促進(jìn)炎癥因子分泌為主的表現(xiàn)略有不同，對(duì)發(fā)現(xiàn)新的影響ATB-DILI發(fā)生的因素具有一定臨床意義。

研究發(fā)現(xiàn)，在CaC0-2腸上皮細(xì)胞中，IL-1β或腫瘤壞死因子(TNF)-α也可使MMP-9的表達(dá)水平升高，并分別于刺激后16 h和3 h達(dá)到高峰[13]。另有學(xué)者使用毛囊細(xì)胞、單核細(xì)胞、 神經(jīng)細(xì)胞、腎小球足突狀細(xì)胞、腹膜間皮細(xì)胞等其他細(xì)胞培養(yǎng)體系也有類似的發(fā)現(xiàn)[14]。以上研究結(jié)果充分表明，在多種細(xì)胞培養(yǎng)體系中，炎癥細(xì)胞因子可影響MMP-9的表達(dá)，MMP-9表達(dá)升高與疾病進(jìn)展密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，MMP-9與ATB-DILI嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，證實(shí)MMP-9分泌增加，炎癥反應(yīng)持續(xù)性進(jìn)展，肝損傷程度明顯加重。因此，筆者認(rèn)為，通過研發(fā)新型抗MMP藥物降低MMP-9表達(dá)，從而減少ATB-DILI的發(fā)生，值得進(jìn)一步探討。

綜上，炎癥反應(yīng)可以促進(jìn)MMP表達(dá)上調(diào)，多種MMP參與炎癥機(jī)制及相互促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，促進(jìn)疾病進(jìn)展[16]。ATB-DILI也是在炎癥機(jī)制下由多重因素導(dǎo)致，MMP在其中也具有重要作用。本研究探究了MMP家族中的部分因子對(duì)ATB-DILI的影響，后續(xù)將對(duì)本次研究結(jié)論進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突