趙哲儀， 王正蓉， 方興艷， 王甜， 羅昭遜， 謝婷婷*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 產(chǎn)前診斷中心， 貴州 貴陽 550004； 4.山東省立第三醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 山東 濟(jì)南 250031； 5.貴州醫(yī)科大學(xué) 兒科學(xué)院， 貴州 貴陽 550004)

砷(arsenic，As)是一種分布廣泛且具有致癌作用的類金屬元素，被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為危害全球公眾健康的十大化學(xué)物質(zhì)之一[1-2]。As及其化合物常通過皮膚系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)或胃腸道系統(tǒng)進(jìn)入體內(nèi)導(dǎo)致肝脂肪變性、肝纖維化、肝硬化及肝癌等一系列肝臟疾病[3-4]。盡管已有研究表明氧化應(yīng)激、脂肪變性及凋亡過程參與As致肝損傷疾病的發(fā)生發(fā)展，但相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明[5-6]。法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)與小異二聚體伴侶(small heterodimer partner，SHP)屬于核受體超家族成員，其所構(gòu)成的信號通路不僅參與調(diào)節(jié)肝臟糖脂、膽汁酸等營養(yǎng)物質(zhì)的新陳代謝，還與肝細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡密切相關(guān)[7-8]，但目前尚未見有關(guān)As影響肝細(xì)胞FXR-SHP信號通路的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以小鼠肝細(xì)胞株AML12為對象、亞砷酸鈉(sodium arsenite，NaAsO2)為處理因素，探究As對肝細(xì)胞氧化應(yīng)激、脂肪變性、凋亡以及FXR-SHP通路的影響，以期為進(jìn)一步闡明As致肝損傷機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞來源和主要藥物 小鼠正常肝細(xì)胞AML12(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，NaAsO2(美國Merck)。

1.1.2主要試劑和儀器 2.5 g/L胰蛋白酶溶液、DMEM/F-12培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Corning公司)，青霉素和鏈霉素(美國Hyclone)，細(xì)胞凍存液、油紅O染色試劑盒、蛋白提取試劑盒及聚丙烯酰胺凝膠制備試劑盒(北京索萊寶)，化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Millipore)，TB Green Premix Ex TaqTMⅡ和Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(日本TaKaRa)，二辛可寧酸法(bicinchoninicacid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天)，兔抗小鼠FXR單克隆抗體(美國Novus)，兔抗小鼠SHP單克隆抗體(美國Affinity)，兔抗小鼠Bax單克隆抗體(武漢三鷹)，兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(英國Abcam)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、NaAsO2處理及分組 AML12細(xì)胞于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，5%CO2、37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)；取處于對數(shù)生長期的AML12細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合率達(dá)80%時，棄原培養(yǎng)基，換含0、10、15、20、25及30 μmol/L NaAsO2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，對應(yīng)設(shè)置為6個濃度組。以不含NaAsO2為對照組，其余各濃度為實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2化學(xué)比色法檢測細(xì)胞內(nèi)丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量 消化收集各組細(xì)胞，按100 ∶1的比例加蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑提取各組總蛋白，并用BCA法檢測各組蛋白濃度；按照試劑盒說明書配制相應(yīng)的MDA檢測體系，100 ℃水浴保溫60 min，10 000 r/min常溫離心10 min；吸取上清液200 μL于96孔板中，測定各組樣本于波長450、532及600 nm處的吸光度，并計(jì)算每克樣本質(zhì)量中MDA的含量；每組樣本均設(shè)置3個復(fù)孔，并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.3油紅O染色法檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴含量 各組細(xì)胞完成NaAsO2染毒處理后，棄去原培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞2次，按試劑盒說明書步驟對細(xì)胞進(jìn)行固定及染色，加PBS覆蓋細(xì)胞于倒置顯微鏡下觀察并采集圖像，使用Image pro plus 6.0軟件分析細(xì)胞內(nèi)脂滴光密度值。

1.2.4實(shí)時熒光定量PCR(reverse transcription realtime fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)檢測細(xì)胞FXR和SHPmRNA表達(dá) TRIzol法提取各組細(xì)胞的RNA，去除基因組DNA后合成cDNA。根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)提供的基因組序列設(shè)計(jì)引物(表1)，并按照試劑說明書配制RT-qPCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件設(shè)為 ∶95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 s、60 ℃退火及延伸30 s、共40個循環(huán)。擴(kuò)增完成后進(jìn)行熔解曲線分析產(chǎn)物特異性。以GAPDH和次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1)為雙內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt計(jì)算出目的基因的相對表達(dá)量。每個樣本重復(fù)檢測3次，實(shí)驗(yàn)同時設(shè)無反轉(zhuǎn)錄酶對照和非模板對照。

表1 基因引物序列Tab.1 Gene primer sequence

1.2.5Western blot法檢測細(xì)胞FXR、SHP及Bax蛋白表達(dá) 按100 ∶1的比例配制蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑混合溶液提取各組細(xì)胞的總蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣本與5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)上樣緩沖液按照1 ∶4比例充分混勻，置于100 ℃金屬浴中加熱8 min；各組蛋白均以上樣量40 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，再轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上；經(jīng)50 g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉2 h，吐溫-Tris鹽緩沖液(tris-buffered saline with tween20, TBST)洗膜3次、10 min/次，分別加兔抗小鼠FXR(1 ∶1 000)、SHP(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)及GAPDH抗體(1 ∶10 000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次、10 min/次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次、10 min/次，采用化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)顯影；采用Image J軟件處理并分析圖像，以GAPDH為內(nèi)參照計(jì)算各目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MDA含量

化學(xué)比色法檢測各組AML12細(xì)胞內(nèi)MDA含量發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，10～30 μmol/L NaAsO2組AML12細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高(P<0.05)。見圖1。

注:(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與10 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與15 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(4)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(5)與25 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖1 各組AML12細(xì)胞中MDA含量Fig.1 The contents of MDA in hepatocyte AML12 of each group

2.2 脂滴含量

油紅O染色結(jié)果表明，對照組AML12細(xì)胞輪廓清晰、胞漿內(nèi)只見少許的橘黃色脂滴，其余NaAsO2組AML12細(xì)胞輪廓模糊、胞漿內(nèi)存在大量繞核分布的橘黃色脂滴；與對照組相比，15～30 μmol/L NaAsO2組AML12細(xì)胞內(nèi)脂滴含量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注:A為油紅O染色法檢測脂滴含量的結(jié)果(400×)，B為脂滴含量的定量結(jié)果；(1)與對照組比較，P<0.05。圖2 各組AML12細(xì)胞中的脂質(zhì)含量Fig.2 The contents of lipid in hepatocyte AML12 in groups with different concentrations of NaAsO2

2.3 FXR和SHP mRNA的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果表明，與對照組相比，10～30 μmol/L NaAsO2組AML12細(xì)胞內(nèi)FXR、SHPmRNA相對表達(dá)量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

注:(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與10 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與15 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(4)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(5)與25 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖3 各組AML12細(xì)胞中FXR和SHP mRNA的表達(dá)Fig.3 Expression of FXR and SHP mRNA in hepatocyte AML12 with different concentrations of NaAsO2

2.4 FXR、SHP及Bax蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，10～30 μmol/L NaAsO2組AML12細(xì)胞內(nèi)FXR蛋白相對表達(dá)量降低(P<0.05)，20～30 μmol/L NaAsO2組AML12細(xì)胞內(nèi)SHP蛋白相對表達(dá)量降低(P<0.05)，25～30 μmol/L NaAsO2組AML12細(xì)胞內(nèi)BAX蛋白相對表達(dá)量增高(P<0.05)。見圖4。

注:A為Western blot檢測FXR、SHP及Bax蛋白的結(jié)果，B為FXR、SHP及Bax蛋白表達(dá)的定量結(jié)果；(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與10 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與15 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(4)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(5)與25 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖4 各組AML12細(xì)胞中FXR、SHP及Bax蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of FXR, SHP, and Bax proteins in hepatocyte AML12 with different concentrations of NaAsO2

3 討論

國內(nèi)外已有研究發(fā)現(xiàn)，As可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激、脂肪變性及凋亡，但其具體機(jī)制尚未闡明[9-11]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時，體內(nèi)的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡會產(chǎn)生大量的活性氧使生物大分子發(fā)生過氧化從而導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷[12]。此外，氧化應(yīng)激還能通過促進(jìn)脂質(zhì)積累與細(xì)胞凋亡參與多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展[13-14]。MDA是活性氧與生物膜的磷脂、膜受體相關(guān)的脂肪酸側(cè)鏈等大分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而生成的產(chǎn)物，其含量對評價氧化應(yīng)激損傷尤為重要[15]。Bax作為B細(xì)胞淋巴瘤-2家族的促凋亡分子，可通過增強(qiáng)線粒體的通透性使得大量凋亡因子被釋放，從而激活凋亡執(zhí)行程序[16]。本研究通過體外構(gòu)建As暴露肝細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，隨著NaAsO2質(zhì)量濃度的增加，AML12肝細(xì)胞內(nèi)MDA、脂滴含量及Bax蛋白相對表達(dá)量逐漸增加，提示As可以明顯誘導(dǎo)AML12肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激、脂肪變性及凋亡。

FXR和SHP均屬于核受體超家族成員，在肝臟、胃腸道中表達(dá)豐富[17-18]。FXR作為配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子可通過結(jié)合SHP基因啟動子區(qū)域的FXR結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)SHP基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR-SHP通路不僅可抑制肝臟脂肪的合成、降低肝臟中甘油三脂的含量，還與細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡存在密切聯(lián)系[21-23]。在多種不同細(xì)胞系的研究中均發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR和SHP能通過上調(diào)抗氧化酶以抵御氧化應(yīng)激損傷[24-25]。而FXR和SHP在細(xì)胞凋亡中的作用存在爭議，Lv等[23]發(fā)現(xiàn)FXR和SHP在胃癌上皮細(xì)胞中的表達(dá)量高于正常上皮細(xì)胞，且通過抑制FXR信號通路可使促凋亡分子半胱氨酸蛋白酶3和BAX的表達(dá)量升高。Haga等[26]發(fā)現(xiàn)激活FXR可上調(diào)SHP及抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2、B細(xì)胞淋巴瘤-xL的表達(dá)，從而抑制肝細(xì)胞發(fā)生凋亡；但Miyazaki等[27]發(fā)現(xiàn)上調(diào)FXR和SHP的表達(dá)可促進(jìn)結(jié)腸腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果顯示，NaAsO2可致AML12細(xì)胞中FXR、SHP的mRNA及蛋白表達(dá)量下調(diào)，提示As可能通過下調(diào)FXR-SHP信號通路，影響與氧化應(yīng)激、脂代謝及凋亡相關(guān)靶基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致肝損傷，但具體生物學(xué)機(jī)制有待深入研究。

綜上所述，NaAsO2能導(dǎo)致AML12細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激、脂肪變性及凋亡，其機(jī)制可能與As抑制FXR、SHP的表達(dá)相關(guān)。本研究僅初步探討了FXR-SHP信號通路在As致肝損傷中的表達(dá)變化，還需利用干預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證該信號通路在As致肝損傷過程中的具體作用。