楊 莎，郝海生，杜衛(wèi)華，龐云渭，趙善江，鄒惠影，朱化彬，楊宇澤，趙學(xué)明

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；2.北京市畜牧總站，北京 100101)

CRISPR/dCas9(nuclease-dead Cas9)是由CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated genes)衍生而來的遺傳操作工具。CRISPR/Cas9是成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及相關(guān)基因的簡稱，是繼鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease,ZFN)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)之后的第三代基因編輯技術(shù)[1]。CRISPR系統(tǒng)最早由日本科學(xué)家于1987年在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)[2]，它是細(xì)菌和古細(xì)菌等原核生物中的一種獲得性免疫系統(tǒng)，不僅可以保護(hù)自身免受噬菌體感染，而且還可以防止其他染色體外元件入侵細(xì)菌[3-4]。2012年，Jinek等[5]體外證實(shí)Cas能夠?qū)崿F(xiàn)對DNA進(jìn)行切割。2013年，Cong等[6]首次發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠用于哺乳動物的基因編輯。隨著研究的深入，CRISPR/Cas9系統(tǒng)除了被用于編輯目標(biāo)DNA或RNA外，還發(fā)展出了CRISPR/dCas9系統(tǒng)，該系統(tǒng)被廣泛用于基因表達(dá)調(diào)節(jié)、表觀遺傳修飾調(diào)控、單堿基編輯以及細(xì)胞內(nèi)活體成像等研究中。

1 CRISPR/dCas9系統(tǒng)的作用原理

CRISPR/dCas9是在CRISPR/Cas9基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)由單向?qū)NA(single guide RNA，sgRNA)和Cas9蛋白兩部分組成[5]。sgRNA是通過將tracrRNA的5′-末端與CRISPR RNA(crRNA)的3′-末端相雜交嵌合而成[1]。而Cas9蛋白是由NUC核酸酶結(jié)構(gòu)域和REC結(jié)構(gòu)域2部分組成[7]。而NUC結(jié)構(gòu)域又包含了RuvC結(jié)構(gòu)域、PAM結(jié)構(gòu)域、HNH結(jié)構(gòu)域和WED結(jié)構(gòu)域[7-8]。Cas9蛋白則利用HNH結(jié)構(gòu)域、RuvC結(jié)構(gòu)域的核酸酶活性行使切割功能[5]。在實(shí)際應(yīng)用中，sgRNA首先識別出基因中的特定序列，由此引起一系列變化使得自身與靶DNA彼此發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，形成RNA-DNA異源雙鏈體[9]。同時，sgRNA與Cas9核酸酶形成復(fù)合物結(jié)合到靶序列處，行使切割功能并產(chǎn)生雙鏈斷裂(double strand breaks，DSB)[10-11]。該斷裂可誘導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)并通過各種內(nèi)源性機(jī)制刺激DNA的修復(fù)，進(jìn)而達(dá)到基因編輯的目的[12]。

2013年，Qi等[13]制備了失活的Cas9蛋白(dCas9)，將Cas9蛋白結(jié)構(gòu)中的HNH域中引入H840A突變，在RuvC域中引入D10A突變，使得蛋白活性發(fā)生缺陷，喪失了原有的切割功能，但仍可以相同精度結(jié)合DNA。同時，sgRNA中負(fù)責(zé)與Cas9結(jié)合的序列同樣負(fù)責(zé)dCas9復(fù)合物的形成[14]，由此，dCas9蛋白成為了能夠兼容多種效應(yīng)蛋白(如轉(zhuǎn)錄抑制子或激活子、表觀遺傳修飾子和熒光團(tuán))的融合蛋白[15]，能在sgRNA的引導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)對基因目標(biāo)位點(diǎn)的靶向調(diào)節(jié)作用，可被用于改變基因表達(dá)和改寫表觀遺傳標(biāo)記，而不產(chǎn)生DSB[16]。

2 CRISPR/dCas9系統(tǒng)在基因表達(dá)調(diào)控方面的應(yīng)用

目前，CRISPR/dCas9系統(tǒng)主要通過CRISPR激活(CRISPR activation，CRISPRa)或CRISPR干擾(CRISPR interference,CRISPRi)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的調(diào)控。

2.1 CRISPR/dCas9系統(tǒng)在激活基因表達(dá)方面的應(yīng)用與優(yōu)化

CRISPRa是指當(dāng)dCas9蛋白與sgRNA共表達(dá)時，會產(chǎn)生DNA識別復(fù)合物，同時dCas9蛋白所攜帶的效應(yīng)子域會通過招募RNA聚合酶或內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄激活因子的方式來促進(jìn)轉(zhuǎn)錄進(jìn)程，從而達(dá)到激活靶基因的目的[17]。最初，研究人員在真核生物中將dCas9與激活子域進(jìn)行簡單融合，通過單個或多個sgRNA靶向啟動子區(qū)域來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)報告基因和內(nèi)源基因的激活[18-20]。這些研究雖然不同程度上實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因表達(dá)的激活，但都存在著各自的局限性，因此第二代工具應(yīng)運(yùn)而生。

新一代工具旨在將更多激活子效應(yīng)域融合到dCas9中，以放大作用效果，能更為準(zhǔn)確、高效地實(shí)現(xiàn)目的基因的激活。這些工具包括SunTag、VP64、VPR、SAM、MS2、scRNA或它們的組合(圖1[21])。dCas9-SunTag系統(tǒng)通過肽重復(fù)序列GCN4和單鏈可變片段scFv(single-chain variable fragment)連接dCas9蛋白與多個激活子效應(yīng)域從而有效激活目的基因[22]。而VPR系統(tǒng)由VP64、轉(zhuǎn)錄激活蛋白 (p65)和反式激活蛋白(RTA)三者組成，三者串聯(lián)融合后，相較于dCas9-VP64系統(tǒng)或dCas9-VP64- p65/RTA系統(tǒng)，可誘導(dǎo)目標(biāo)基因高效激活[23]。與上述系統(tǒng)通過改造實(shí)行編輯功能的效應(yīng)域來提高激活效率不同，SAM系統(tǒng)通過對sgRNA進(jìn)行改造實(shí)現(xiàn)CRISPRa系統(tǒng)對基因激活效率的增強(qiáng)。SAM系統(tǒng)包括dCas9-VP64融合復(fù)合物和MCP融合的p65-HSF1，與dCas9-VP64系統(tǒng)相比也顯示出更高的基因表達(dá)激活效力[24]。

圖1 不同CRISPRa系統(tǒng)示意圖[21]Fig.1 Schematic diagram of different CRISPRa systems[21]

2.2 CRISPR/dCas9系統(tǒng)在抑制基因表達(dá)方面的應(yīng)用與優(yōu)化

CRISPRi是指當(dāng)dCas9蛋白與sgRNA共表達(dá)時，會產(chǎn)生DNA識別復(fù)合物，同時dCas9所攜帶的效應(yīng)域通過阻止RNA聚合酶的結(jié)合或是破壞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合從而干擾轉(zhuǎn)錄延伸來抑制轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而達(dá)到抑制或沉默基因表達(dá)的目的[25-26]。當(dāng)單獨(dú)使用dCas9將CRISPRi導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞時，其抑制效率較低，因此研究人員們一直致力于提高真核細(xì)胞中靶向基因調(diào)節(jié)的效率。他們將諸如Krüppel關(guān)聯(lián)框(Krüppel-associated box，KRAB)之類的抑制域與dCas9融合，發(fā)現(xiàn)可以提高抑制效率[27]。自Gilbert等[27]首次利用dCas9-KRAB融合蛋白以增加CRISPRi沉默的效率后，其他研究人員也利用該融合蛋白靶向5′-非翻譯區(qū)域[28]以及增強(qiáng)子元件[29-30]，有效使目的基因沉默或抑制。

雖然在上述研究中dCas9-KRAB融合蛋白確實(shí)提高了CRISPRi系統(tǒng)的效率，但仍存在許多問題有待解決。 于是，Amabile等[31]通過將dCas9-KRAB與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)結(jié)合使用，結(jié)果證明其在多達(dá)78%的細(xì)胞中穩(wěn)定地誘導(dǎo)了目的基因沉默，提高了系統(tǒng)的作用穩(wěn)定性。Yeo等[32]將KRAB-MeCP2阻遏結(jié)構(gòu)域與dCas9蛋白相結(jié)合，其作用效果與單獨(dú)使用dCas9或dCas9-KRAB相比較，對目的基因表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用。Alerasool等[33]研發(fā)出了新一代KRAB結(jié)構(gòu)域——ZIM3 KRAB，通過驗(yàn)證表明，它與KRAB-MeCP2相比作用效果又提高了，是現(xiàn)存的CRISPRi系統(tǒng)中最為有效的一種。

3 CRISPR/dCas9系統(tǒng)在表觀遺傳精準(zhǔn)修飾方面的應(yīng)用

表觀遺傳學(xué)是一門對基因可遺傳變化進(jìn)行研究的學(xué)科，這種可遺傳變化能夠使相同基因、來源和生長環(huán)境的細(xì)胞在不改變DNA序列的情況下產(chǎn)生不同的功能[34]。表觀遺傳修飾主要包括組蛋白修飾、DNA甲基化、非編碼RNA調(diào)控等[35]。這些表觀遺傳修飾過程對基因的表達(dá)起著至關(guān)重要的作用，和許多癌癥疾病的發(fā)生存在著密切的聯(lián)系[36]，所以利用CRISPR/dCas9系統(tǒng)探索新的疾病和癌癥治療方法也成為了研究的趨勢，不同研究人員在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了各種各樣的嘗試。

3.1 CRISPR/dCas9系統(tǒng)用于組蛋白修飾

組蛋白是存在于染色質(zhì)中起調(diào)節(jié)基因表達(dá)作用的蛋白成分，各種基團(tuán)能與其N-末端共價結(jié)合而發(fā)生修飾作用[37]。組蛋白修飾主要包括組蛋白乙?；⒘姿峄?、甲基化和泛素化等，這些修飾能夠影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)松緊程度，進(jìn)而對基因的表達(dá)起到修飾作用[38]。

3.1.1 調(diào)控組蛋白乙酰化 在組蛋白乙?；揎椃矫妫?015年，Hilton等[39]將人乙?；D(zhuǎn)移酶p300與dCas9蛋白相融合，并將其用于催化啟動子和增強(qiáng)子上組蛋白H3 Lys27的乙?；Y(jié)果表明這種乙?；D(zhuǎn)移酶能夠促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。2017年，Bohnsack等[40]在Gabra1基因啟動子上成功驗(yàn)證了該系統(tǒng)的效果，增加組蛋白乙?；⒎乐沽薌abra1基因表達(dá)降低，為治療因Gabra1基因表達(dá)異常而引起的各種疾病打下了基礎(chǔ)，證明了該系統(tǒng)可應(yīng)用于疾病治療。

在組蛋白去乙酰化修飾方面，2017年，Kwon等[41]設(shè)計(jì)將dCas9-HDAC3靶向啟動子組蛋白脫乙?；?，成功抑制了幾種候選基因轉(zhuǎn)錄，展示了該類系統(tǒng)的作用效果，為后續(xù)相關(guān)應(yīng)用研究提供了有力的工具。KRAS是癌癥中最易發(fā)生突變的癌基因之一，Liu等[42]將dCas9-HDAC1用于修飾KRAS啟動子上的組蛋白乙酰化，結(jié)果有效沉默了癌癥基因KRAS，提供了一種有效可行的抗KRAS突變的癌癥療法，為相關(guān)癌癥治療提供了一種新的可能性。

3.1.2 調(diào)控組蛋白甲基化 在組蛋白甲基化修飾方面，2019年Chen等[43]將組蛋白甲基化酶與dCas9融合，構(gòu)建了CRISPR/dCas9-EZH2系統(tǒng)，將其靶向前體脂肪細(xì)胞中的C/EBPα啟動子，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)能夠精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)組蛋白H3第27位賴氨酸(histone H3 lysine 27，H3K27)甲基化，下調(diào)C/ebpα基因的表達(dá)，成功抑制了細(xì)胞的成脂分化，就此為組蛋白甲基化修飾和靶向操作提供了強(qiáng)大的工具。 同年，F(xiàn)ukushima等[44]將dCas9-olEZH2 mRNA與sgRNA共同注射到單細(xì)胞階段的日本鳉魚(Oryziaslatipes，Medaka)胚胎中，發(fā)現(xiàn)特定位置出現(xiàn)了組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(histone H3 lysine 27 trimethylation，H3K27me3)積累，其失調(diào)與癌癥等疾病有關(guān)，并導(dǎo)致了相關(guān)基因表達(dá)的下調(diào)，成功在胚胎中建立了H3K27me3的體內(nèi)表觀基因組編輯，擴(kuò)展了基于dCas9的體內(nèi)表觀基因組編輯的應(yīng)用范圍，同時該組蛋白甲基化系統(tǒng)還為疾病的治療提供了模型。

在組蛋白去甲基化修飾方面，Kearns等[29]將dCas9-LSD1系統(tǒng)運(yùn)用到小鼠胚胎干細(xì)胞中，結(jié)果顯示dCas9-LSD1會誘導(dǎo)Tbx3上游增強(qiáng)子標(biāo)記組蛋白H3第4位賴氨酸二甲基化(histone H3 lysine 4 dimethylation，H3K4me2)減少，成功導(dǎo)致增強(qiáng)子失活，Tbx3轉(zhuǎn)錄減少，證明了該技術(shù)的作用效果，同時表明該技術(shù)有能力幫助剖析遠(yuǎn)端順式調(diào)控元件對發(fā)育和疾病的影響。 為了了解H3K4me3在調(diào)節(jié)α-突觸核蛋白在帕金森氏病中的重要作用，Guhathakurta等[45]開發(fā)了靶向H3K4me3去甲基化系統(tǒng)dCas9 SunTag-JARID1A，該系統(tǒng)作用于α-突觸核蛋白基因(α-synuclein gene,SNCA)啟動子后，顯著降低了H3K4me3，影響了α-突觸核蛋白的表達(dá)，證明對啟動子SNCA的組蛋白的調(diào)控可以通過影響α-突觸核蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響帕金森氏病表現(xiàn)。

3.2 CRISPR/dCas9系統(tǒng)用于DNA甲基化精準(zhǔn)修飾

DNA甲基化是指通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在CpG二核苷酸中胞嘧啶的第5個碳原子上添加1個甲基基團(tuán)生成5-甲基胞嘧啶的過程[46-47]。甲基化對許多哺乳動物生物過程(如細(xì)胞周期調(diào)控、基因印跡、胚胎發(fā)育等過程)具有重要意義，是維持細(xì)胞或組織基因表達(dá)的重要機(jī)制[48]。因其會阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，所以DNA甲基化一般會導(dǎo)致基因沉默或下調(diào)[49]。而基因啟動子的低甲基化會導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)座因子的再激活和基因組印跡喪失，從而引起基因的過表達(dá)，造成癌癥疾病的發(fā)展[21]。

3.2.1 CRISPR/dCas9系統(tǒng)用于DNA甲基化精準(zhǔn)調(diào)增 DNA甲基化是由DNMT催化完成的，哺乳動物細(xì)胞中已知的DNMT主要有3種：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT1主要負(fù)責(zé)維持DNA的甲基化狀態(tài)[50]；DNMT3a和DNMT3b主要負(fù)責(zé)催化DNA的從頭甲基化，它們以未甲基化的DNA為模板，在DNA建立新的甲基化位點(diǎn)[51]。2016年，McDonald等[52]和Vojta等[53]首先開發(fā)出一種基于CRISPR/dCas9的工具，都將DNMT3a與dCas9蛋白相融合(dCas9-DNMT3a)，并將其用于誘導(dǎo)啟動子中特定位點(diǎn)的DNA甲基化，同時Vojta等[53]還證明該工具可以允許同時利用多個gRNA靶向多個相鄰位點(diǎn)，達(dá)到啟動子大片段甲基化的目的。同年，Rudolf- Jaenisch研究小組成功在小鼠體內(nèi)印證了這一工具的效果，將其應(yīng)用領(lǐng)域擴(kuò)展到哺乳動物體內(nèi)[54]。后來，Wei等[55]又利用顯微注射的方法將gRNA與dCas9-DNMT3a mRNA導(dǎo)入小鼠GV期卵母細(xì)胞中，有效地提高了MⅡ期卵母細(xì)胞中目標(biāo)基因的DNA甲基化水平，并成功產(chǎn)生了后代。以上研究證明了dCas9-DNMT3a系統(tǒng)在實(shí)際應(yīng)用中的效果顯著，同時為探究體內(nèi)DNA甲基化狀態(tài)與疾病和發(fā)育之間關(guān)系的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

為了提高靶向基因組位點(diǎn)的DNMT3a水平，進(jìn)而高效、有針對性地進(jìn)行甲基化，有研究者將dCas9蛋白與SunTag序列相融合，在靶位點(diǎn)招募多個抗體融合的DNMT3a(dCas9-SunTag-DNMT3a)，試驗(yàn)結(jié)果均表明與先前的系統(tǒng)(dCas9-DNMT3a)相比，改造后的系統(tǒng)明顯提高了目標(biāo)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，同時降低了脫靶現(xiàn)象的發(fā)生[56-58]。同時Stepper等[59]采用了dCas9-DNMT3a-DNMT3L在不同基因啟動子處將DNA甲基化引入人的基因組中，在單個gRNA的引導(dǎo)下，實(shí)現(xiàn)了啟動子的有效且廣泛的甲基化。

3.2.2 CRISPR/dCas9系統(tǒng)用于DNA甲基化精準(zhǔn)調(diào)減 DNA去甲基化過程則是由Tet(ten-eleven translocation)雙加氧酶家族負(fù)責(zé)，它們可以將5-甲基胞嘧啶(5mC)逐步氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)，最后達(dá)到消除甲基化印跡的目的[60]。2016年有研究者首先利用dCas9-Tet1系統(tǒng)分別對腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)啟動子Ⅳ和肌源性決定因子(myogenic differentiation,MyoD)遠(yuǎn)端增強(qiáng)子靶向去甲基化，成功誘導(dǎo)了有絲分裂后神經(jīng)元中BDNF的表達(dá)和MyoD的激活，就此證明了dCas9-Tet1系統(tǒng)在表觀遺傳研究方面的重要用途[54]。而后，Liu等[61]使用dCas9-Tet1/sgRNA系統(tǒng)對脆性X綜合征(fragile X syndrome，F(xiàn)XS)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)進(jìn)行編輯，成功恢復(fù)了脆性X智力障礙1號(fragile X mental retardation 1,FMR1)基因的表達(dá)，并且在植入小鼠大腦后，相應(yīng)神經(jīng)元的FMR1表達(dá)得到了維持，為相關(guān)醫(yī)療技術(shù)繼續(xù)深入研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

為了實(shí)現(xiàn)更大作用范圍內(nèi)有效和高效去甲基化，2016年Xu等[62]將2個MS2 RNA元件插入到sgRNA中構(gòu)建出了sgRNA2.0，將其與dCas9-Tet1催化結(jié)構(gòu)域(dCas9-Tet1 catalytic domain，dCas9-Tet1CD)共同作用，成功募集了更多DNA去甲基化酶，實(shí)現(xiàn)了對一定范圍內(nèi)靶基因的有效去甲基化。同年，Morita等[56]利用改造以后的dCas9-SunTag系統(tǒng)成功在靶位點(diǎn)招募了更多的scFv-GFP-Tet1CD，實(shí)現(xiàn)了遠(yuǎn)距離去甲基化，并在小鼠胚胎的活體大腦中實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源性基因的去甲基化。Xu等[63]報道了一種高保真催化系統(tǒng)dHFCas9-Tet3CD，該系統(tǒng)能有效降低脫靶概率，成功優(yōu)化了系統(tǒng)的作用效果。

4 結(jié) 語

CRISPR/dCas9技術(shù)在動物、植物研究方面都有著重要應(yīng)用意義，并且其應(yīng)用不再拘泥于簡單的基因編輯，而是在基因表達(dá)調(diào)控、表觀遺傳修飾、細(xì)胞成像、單堿基編輯、基因診斷等多個方向發(fā)揮著日益重要的作用，促進(jìn)著生物學(xué)研究的發(fā)展。許多資料表明，疾病和癌癥的發(fā)生都與表觀遺傳狀態(tài)有著直接聯(lián)系，而利用CRISPR/dCas9技術(shù)對相關(guān)疾病基因進(jìn)行表觀遺傳修飾將為一些癌癥疾病的治療帶來新的契機(jī)。