劉 莉，顧玲玲，張 碩，謝 軍，朱善元，王安平

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰州 225300；2.江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，連云港 222005)

近年來，中國(guó)鵝場(chǎng)暴發(fā)了一種主要引起4～20日齡雛鵝痛風(fēng)癥狀的傳染病，其主要特征為跛行或癱瘓，剖檢可見內(nèi)臟和關(guān)節(jié)有大量尿酸鹽沉積，死亡率高達(dá)50%，給中國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。

星狀病毒(Astrovirus,AstV)為單股正鏈、無囊膜的RNA病毒,于1975年首次發(fā)現(xiàn)于患腸胃炎的嬰兒糞便中[1]。透射電子顯微鏡觀察可見其表面具有特征性星狀結(jié)構(gòu)，因此被命名為星狀病毒[2]。首個(gè)GAstV FLX株全基因組序列報(bào)道于2017年[3]，F(xiàn)LX株基因組全長(zhǎng)為7 299 nt，其基因組結(jié)構(gòu)與星狀病毒屬其他成員相似，由3個(gè)不同的重疊開放閱讀框(ORF1a、ORF1b和ORF2)組成。其中，ORF1a 和ORF1b編碼非結(jié)構(gòu)蛋白[4]，ORF2編碼病毒衣殼蛋白(Cap蛋白)，是基因組中的高變區(qū)域，與病毒粒子形成及抗體產(chǎn)生相關(guān)[5]。此后，陸續(xù)報(bào)道了多株GAstV全基因組序列，如GD[6]、SDPY[7]、HN1G[8]、SD01[9]、GsFJ02[10]和HN01[11]等。遺傳進(jìn)化分析表明，所有已知序列的GAstVs均屬于2個(gè)不同的系統(tǒng)進(jìn)化分支，因此，有學(xué)者建議將FLX類毒株命名為GAstV-1，將SD01類毒株命名為GAstV-2，又稱之為新型GAstV[10]。

已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道用GAstV-2進(jìn)行雛鵝回歸試驗(yàn)可復(fù)制出鵝痛風(fēng)，證明GAstV-2是鵝痛風(fēng)的病原[6-8]。江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室課題組前期研究證明，用GAstV-1 TZ03接種健康雛鵝，可引起與臨床癥狀相似的鵝痛風(fēng)，說明GAstV-1也是鵝痛風(fēng)的病原之一[12]。張玉杰等[13]報(bào)道，GAstV-1與GAstV-2混合感染能致雛鵝發(fā)生典型痛風(fēng)癥狀，且比單獨(dú)感染導(dǎo)致的死亡率更高。因此，為了做好鵝痛風(fēng)的防控，需對(duì)GAstV-1與GAstV-2做好診斷和檢測(cè)工作。

目前尚無用于GAstV檢測(cè)的商品化試劑盒，張玉霞等[14]建立了GAstV-2 LAMP快速檢測(cè)方法，Yuan等[15]建立了GAstV-2實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，呂炫等[16]利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)了GAstV-2衣殼蛋白，且制備了高效價(jià)多克隆抗體。而針對(duì)GAstV-1診斷檢測(cè)方法的研究鮮有報(bào)道。本研究在前期分離鑒定的GAstV-1的基礎(chǔ)上，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)GAstV-1衣殼蛋白ORF2，并制備其多克隆抗體，以期為GAstV-1血清學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌種與細(xì)胞

GAstV-1 TZ03毒株(全基因組序列GenBank登錄號(hào)：MW353015)由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；pET-30a(+)由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶及預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均購(gòu)自Thermo公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、HRP標(biāo)記的抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自康為世紀(jì)有限公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG均購(gòu)自KPL公司。

1.3 ORF2基因密碼子優(yōu)化及合成

在不改變ORF2基因核苷酸序列的前提下，對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化，將大腸桿菌稀有密碼子改變?yōu)榇竽c桿菌偏嗜性密碼子，同時(shí)在該基因兩端引入BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。優(yōu)化后的基因序列由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成，并克隆于pGEM-T質(zhì)粒載體中。

1.4 重組質(zhì)粒pET-ORF2的構(gòu)建及鑒定

將含有優(yōu)化基因ORF2的質(zhì)粒和原核表達(dá)載體pET-30a(+)分別用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切后，分別回收ORF2基因片段和pET-30a(+)載體，兩者經(jīng)T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)14 h。隨機(jī)挑取單菌落，接種于含卡那青霉素(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的菌株送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-ORF2及載體質(zhì)粒pET-30a(+)分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于含卡那青霉素(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，次日按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至相同培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液D600 nm值達(dá)0.6～1.0時(shí)，加入 IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)3～5 h，離心收集菌體，溶于適量PBS中，超聲波裂解菌體，取裂解后的菌液12 000 r/min離心10 min，將上清和沉淀分別與5×Loading Buffer混勻，煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE分析。同時(shí)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5% BSA 4 ℃封閉過夜，用HRP標(biāo)記的抗His標(biāo)簽單克隆抗體(1∶1 000稀釋)于37 ℃孵育2 h，DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色觀察。

1.6 重組蛋白純化

按上述1.5的方法重新誘導(dǎo)菌液100 mL，4 ℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體，溶于適量PBS，超聲波裂解菌體，按照His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說明書進(jìn)行純化，以200 mmol/L咪唑緩沖液進(jìn)行洗脫，將洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。利用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)純化后的重組蛋白濃度進(jìn)行定量。

1.7 多克隆抗體制備

參照劉雪婷等[17]制備多克隆抗體血清，將上述純化的重組蛋白ORF2與弗氏完全佐劑等體積混勻，充分乳化。以背部皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔，每只家兔免疫的蛋白量為400 μg。首免2和4周后，以相同量的重組蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化，分別進(jìn)行二免和三免。三免后第14天采血，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 多克隆抗體鑒定

1.8.1 多克隆抗體效價(jià)測(cè)定 將純化后的重組蛋白稀釋至濃度為2 μg/mL，100 μL/孔包被96孔酶標(biāo)板，4 ℃作用過夜。PBST洗滌5次，3 min/次，每孔加入200 μL含有5%脫脂乳的PBST封閉液，37 ℃封閉2 h。PBST洗滌后，每孔加入用封閉液倍比稀釋的待檢血清200 μL，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌后，TMB避光顯色30 min，加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取D450 nm值。同時(shí)設(shè)立免疫前兔血清作為陰性對(duì)照。

1.8.2 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè) 參考文獻(xiàn)制備鵝胚腎細(xì)胞(GEK)[11]，將GAstV-1 TZ03毒株以100 TCID50感染GEK細(xì)胞，48 h后棄去上清，PBS洗滌2次，用-20 ℃預(yù)冷的甲醇固定20 min，PBS洗滌3遍后加入5% BSA室溫封閉1 h。以制備的兔源多克隆抗體血清為一抗(1∶200)，37 ℃孵育2 h；PBS洗滌5次，以FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)為二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3遍后置于熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。同時(shí)以未接種病毒的GEK細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pET-ORF2鑒定

將酶切回收的目的基因ORF2與載體pET-30a(+)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR篩選獲得重組子，提取質(zhì)粒經(jīng)BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切鑒定，產(chǎn)生大小約為5 400和2 140 bp的2條條帶(圖1)，與預(yù)期大小一致，表明ORF2基因已成功克隆入載體pET-30a(+)中。測(cè)序結(jié)果完全正確。

圖1 重組質(zhì)粒pET-ORF2雙酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET-ORF2 by double enzyme digestion

2.2 重組蛋白ORF2的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-ORF2及載體質(zhì)粒pET-30a(+)分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組蛋白獲得較高水平表達(dá)，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，在約70 ku處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，與預(yù)期的6His-ORF2融合蛋白大小一致，且以包涵體形式存在(圖2)。

M,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1,pET-30a(+)誘導(dǎo)菌裂解上清；2,pET-ORF2誘導(dǎo)菌裂解上清；3,pET-30a(+)誘導(dǎo)菌裂解沉淀；4,pET-ORF2誘導(dǎo)菌裂解沉淀M,Protein Marker;1,Supernatant of lysed pET-30a(+) after inducement;2,Supernatant of lysed pET-ORF2 after inducement;3,Precipitation of lysed pET-30a(+) after inducement;5,Precipitation of lysed pET-ORF2 after inducement圖2 重組蛋白ORF2的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein ORF2

2.3 重組蛋白ORF2純化

對(duì)純化后的重組蛋白ORF2進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果顯示，在約70 ku處出現(xiàn)特異性條帶，與重組蛋白的理論值相符，且條帶較單一(圖3)，說明重組蛋白獲得成功純化。利用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，蛋白濃度為1.02 mg/mL。

圖3 純化重組蛋白ORF2的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein ORF2

2.4 重組蛋白ORF2的Western blotting鑒定

用HRP標(biāo)記的抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行Western blotting鑒定，結(jié)果顯示，在分子質(zhì)量約70 ku處出現(xiàn)了特異性條帶(圖4)，與預(yù)期條帶大小一致，表明表達(dá)的重組蛋白具備良好的反應(yīng)原性。

M,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1,pET-ORF2誘導(dǎo)菌裂解沉淀；4,pET-30a(+)誘導(dǎo)菌裂解沉淀M,Protein Marker;1,Precipitation of lysed pET-ORF2 after inducement;2,Precipitation of lysed pET-30a(+) after inducement圖4 重組蛋白ORF2的Western blotting鑒定Fig.4 Identification of recombinant protein ORF2 by Western blotting

2.5 多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

將純化的重組蛋白ORF2包被酶標(biāo)板，利用間接ELISA方法測(cè)定多克隆抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，制備的ORF2多克隆抗體效價(jià)最高達(dá)1∶128 000(圖5)。

圖5 多克隆抗體效價(jià)測(cè)定Fig.5 Titer determination of polyclonal antibody

2.6 多克隆抗體IFA鑒定

通過IFA對(duì)制備的兔源多克隆抗體血清進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，GAstV-1感染的GEK細(xì)胞中有大量特異性免疫熒光，而對(duì)照組未出現(xiàn)熒光(圖6)，說明制備的兔源多克隆抗體血清能與GAstV-1發(fā)生特異性結(jié)合。

A,感染GAstV-1的GEK細(xì)胞；B,未感染的GEK細(xì)胞A,GEK cells infected with GAstV-1;B,Uninfected GEK cells圖6 ORF2多克隆抗體IFA鑒定(200×)Fig.6 Identification of ORF2 polyclonal antibody by IFA (200×)

3 討 論

鵝痛風(fēng)為近年來的新發(fā)病，死亡率高達(dá)50%，給養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。分析其原因主要有：①鵝痛風(fēng)病原較復(fù)雜，有GAstV-1和GAstV-2，2種GAstV不僅基因同源性不到60%，且兩者之間沒有交叉保護(hù)作用[13,18]；②目前尚無商品化的GAstV疫苗產(chǎn)品用于該病的防控；③目前為止，還沒有成熟的GAstV診斷檢測(cè)試劑，僅有的幾篇文獻(xiàn)是關(guān)于GAstV-2 PCR檢測(cè)方法的建立[14-16]，而關(guān)于GAstV-1檢測(cè)方法的研究還鮮見報(bào)道，因此，有必要積極開發(fā)其診斷制劑。

ORF2是星狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，不僅介導(dǎo)病毒與宿主的相互作用，還可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[19-21]。本研究選擇原核表達(dá)載體，以前期分離的GAstV-1 TZ03株為基礎(chǔ)，表達(dá)GAstV-1結(jié)構(gòu)蛋白ORF2。前期試驗(yàn)中，以GAstV-1基因組為模板，高保真PCR方法擴(kuò)增出ORF2基因，將其克隆入原核表達(dá)載體pET-30a(+)，在優(yōu)化了不同條件之后，重組蛋白均沒有表達(dá)。重新利用其他原核表達(dá)載體如pET-28(+)、pET-32a(+)、pCold TF等，仍不表達(dá)。分析其原因，GAstV-1ORF2基因密碼子可能不是原核表達(dá)系統(tǒng)所偏愛的密碼子。因此，對(duì)ORF2基因進(jìn)行了大腸桿菌偏愛性密碼子優(yōu)化合成后，再克隆入原核表達(dá)載體pET-30a(+)，SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果表明重組蛋白ORF2獲得了正確、高效的表達(dá)。蒲路莎等[22]利用原核表達(dá)載體pET-32a(+)，未經(jīng)密碼子優(yōu)化，成功表達(dá)了GAstV-2 HLJ01株ORF2基因；孫佳卉等[23]利用原核表達(dá)載體pET-30a(+)，同樣未經(jīng)密碼子優(yōu)化，成功表達(dá)了GAstV-2 CH16株ORF2基因。以上研究表明，雖然很多外源基因不需進(jìn)行偏愛性密碼子優(yōu)化也能在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，但GAstV-1ORF2基因密碼子不適合在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，需進(jìn)行密碼子優(yōu)化后才能在大腸桿菌中獲得較高水平表達(dá)，同時(shí)也說明GAstV-1與GAstV-2ORF2基因在密碼子的偏嗜性上差異較大。

4 結(jié) 論

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了GAstV-1結(jié)構(gòu)蛋白ORF2，制備了高效價(jià)的兔抗ORF2蛋白多克隆抗體，且該抗體具有良好的反應(yīng)性和特異性，能特異性識(shí)別GAstV-1，可用于臨床樣品GAstV-1的檢測(cè)及相關(guān)方法的建立。