胡換儀，汪建中，劉昌錦，林 敏，劉小蘭，魏黃思梧，鄧舜洲

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南昌 330045)

1962年，Shimonura等[1]在維多利亞水母中發(fā)現(xiàn)了一種能釋放出生物熒光的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)。GFP的分子質(zhì)量約27 ku，是一條由238個氨基酸組成的多肽鏈，經(jīng)紫光或藍光照射會發(fā)出綠色熒光。GFP的熒光來源于生色團，由3個氨基酸殘基Ser65-Tyr66-Gly67形成的對羥基苯咪唑啉酮構(gòu)成。GFP的獨特之處在于有氧條件下無需任何輔助因子或特定的酶即可產(chǎn)生熒光[2]。但野生型GFP在藍光激發(fā)下熒光強度偏低，在幾種哺乳動物細胞中表達不穩(wěn)定，針對此情況，Zhang等[3]對GFP的氨基酸進行了替換(Ser65→Thr，Phe64→Leu)，即為增強型GFP(enhanced GFP，EGFP)，其熒光強度提高了35倍。GFP具有性質(zhì)穩(wěn)定、無毒、靈敏度高、載體構(gòu)建簡單等優(yōu)點，因此，近二十多年已在各個領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，主要用于顯像和示蹤技術(shù)、報告基因、活細胞內(nèi)的熒光感受器、篩選和純化及抗體生產(chǎn)等方面[4]。

在利用GFP對內(nèi)源蛋白進行定量時，活體細胞本身存在的自熒光物質(zhì)會影響試驗結(jié)果，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確定量；此外，組織或細胞在各種理化處理過程中熒光易淬滅，不利于對組織中GFP標(biāo)記蛋白進行細胞內(nèi)定位及所在組織的結(jié)構(gòu)和功能的原位分析[5]。因此，如果有針對GFP的高特異性、高靈敏度抗體，可在一定程度上彌補上述不足，作為一種有效的補充手段提高GFP檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度，擴大熒光檢測范圍。

本研究以豬痘病毒(Swinepox virus，SWPV)TK基因為外源基因插入位點，采用同源重組技術(shù)構(gòu)建重組SWPV表達GFP,在此基礎(chǔ)上，制備抗GFP的單克隆抗體，以期為今后建立GFP的免疫學(xué)檢測方法提供特異性抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、毒株和細胞 含有SWPVTK基因左右臂的基礎(chǔ)質(zhì)粒載體pSW[6]、SWPV-JX20G株、PK15細胞、SP2/0骨髓瘤細胞、原核表達的EGFP-His蛋白和抗PCV2單克隆抗體6E2均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)室構(gòu)建或保存;EGFP-N1質(zhì)粒(含P28-EGFP-His片段)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.2 主要試劑NotⅠ和XhoⅠ均購自Thermo公司；T4 DNA連接酶、PCR反應(yīng)相關(guān)試劑均購自TaKaRa公司；新生牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、OPTI-MEM均購自Gibco公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；Western blotting相關(guān)試劑均購自Solarbio公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；PEG2000、HAT、HT、低熔點瓊脂糖和弗氏佐劑均購自Sigma公司。

1.1.3 試驗動物 6～8 周齡雌性BALB/c小鼠和成年昆明小鼠均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.1.4 P28啟動子序列 根據(jù)Winslow等[7]對痘苗病毒啟動子P28的相關(guān)報道，本試驗采用的P28啟動子大小為33 bp，序列為：5′-CTTTTT-TTTTTTTTTTTTTTTGGCATATAAATG-3′。

1.2 方法

1.2.1 EGFP-His蛋白的表達及純化

1.2.1.1 目的基因擴增 以EGFP-N1質(zhì)粒為模板，PCR擴增P28-EGFP-His片段，上游引物EGFP-F：5′-AAATATGCGGCCGCCCCGGGCTT-TTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCATATAAATG-GTGAGCAAGGGCGA-3′，5′-端加上NotⅠ酶切位點(下劃線處)；下游引物EGFP-R：5′-CCTCGAG-TTAATGATGGTGGTGATGATGCTTGTACAGCT-CGTCCATGCCGAGAGTGATCC-3′，5′-端加上XhoⅠ酶切位點(下劃線處)，預(yù)期擴增片段大小為768 bp，含有P28啟動子、EGFP基因和6×His標(biāo)簽。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系50 μL：HiFi Buffer Ⅰ 5 μL，dNTP 4 μL，上、下游引物各0.5 μL，HiFi酶0.5 μL，模板2 μL，ddH2O 37.5 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.2.1.2 重組SWPV轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及鑒定 P28-EGFP-His片段和pSW質(zhì)粒分別經(jīng)NotⅠ和XhoⅠ雙酶切、純化，T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細胞，挑取單個菌落進行PCR鑒定、雙酶切鑒定，篩選陽性克隆進行測序。按高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒說明書操作，大量制備用于轉(zhuǎn)染的重組質(zhì)粒pSW-EGFP-His，測量質(zhì)粒濃度，計算轉(zhuǎn)染體積，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及重組SWPV(rSWPV-EGFP-His)純化 培養(yǎng)PK15細胞匯合度至80%，感染SWPV-JX20G株，吸附2 h后，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)48 h時，觀察有無熒光及細胞病變，維持5～6 d收毒。參考劉昌錦等[8]方法進行重組病毒蝕斑純化。

1.2.1.4 rSWPV-EGFP-His的PCR鑒定 根據(jù)SWPV-JX20G株的TK基因序列，設(shè)計1對檢測引物，上游引物TK1：5′-GGACCTATGTTCTCTG-GAAAGAGT-3′；下游引物TK2：5′-TGTTCCA-TCTAATGCAGCAACG-3′，親本SWPV預(yù)期擴增片段大小為309 bp，rSWPV-EGFP-His預(yù)期擴增片段大小為1 077 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.2.1.1。

1.2.1.5 EGFP-His蛋白表達和純化 將表達EGFP-His蛋白的rSWPV-EGFP-His接種PK15細胞進行擴大培養(yǎng)，病毒吸附4～5 h后加入適量含5%血清的DMEM培養(yǎng)液，48～72 h觀察細胞熒光，細胞達100%熒光時用無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，加入適量無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至細胞全部病變后收毒。 病毒液凍融3 次后取1 mL 12 000 r/min離心10 min，分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE觀察EGFP-His蛋白表達形式。按照His標(biāo)簽可溶性蛋白純化試劑盒說明書純化EGFP-His蛋白，SDS-PAGE觀察純化效果。

1.2.2 抗EGFP-His單克隆抗體的制備

1.2.2.1 小鼠免疫 將純化的EGFP-His蛋白與弗氏完全佐劑乳化，蛋白含量為100 μg/0.2 mL,免疫5 只6～8 周齡雌性BALB/c小鼠，皮下多點注射，0.2 mL/只，每隔10 d加強免疫一次(第2次免疫開始用弗氏不完全佐劑)，共免疫5 次，每次免疫前及第5次免疫后10 d斷尾采血取血清。融合前加強免疫，尾靜脈注射EGFP-His蛋白(50 μg/只)，3 d后取脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合。

1.2.2.2 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定 按照方陣滴定法，將純化后的EGFP-His蛋白用0.05 mol/L pH 9.6 碳酸鹽緩沖液連續(xù)稀釋(濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10和20 μg/mL)，100 μL/孔，4 ℃包被酶標(biāo)板過夜；5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h；將陽性小鼠血清(免疫小鼠血清)和陰性小鼠血清稀釋(1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000和1∶512 000)，100 μL/孔，同時設(shè)空白對照，37 ℃濕盒孵育1 h；PBST洗板3 次，加HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1∶2 000稀釋)，100 μL/孔，37 ℃濕盒孵育1 h；PBST洗板4～5次，加OPD底物溶液，100 μL/孔37 ℃濕盒避光顯色15～20 min；每孔加50 μL終止液終止顯色。酶標(biāo)儀讀D492 nm值，選擇陽性小鼠血清D492 nm值接近1.0，P/N值最大時對應(yīng)的濃度為抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。

1.2.2.3 免疫小鼠抗體水平檢測 將待測免疫小鼠血清1∶1 000稀釋，利用條件優(yōu)化后建立的間接ELISA方法檢測免疫小鼠抗體水平。

1.2.2.4 雜交瘤細胞的制備和篩選 取血清抗體效價最高的小鼠脾細胞與SP2/0細胞以適當(dāng)比例混合均勻，參考王雅文等[9]方法進行細胞融合。融合后10～15 d，采用間接ELISA方法對雜交瘤細胞進行2次篩選，第1次篩選時包被抗原為真核表達的EGFP-His蛋白，第2次篩選時抗原為原核表達的EGFP-His蛋白。篩選到的陽性雜交瘤細胞按照常規(guī)方法進行亞克隆。

1.2.2.5 單克隆抗體腹水的制備、純化和效價測定 取成年雌性BALB/c小鼠，腹腔內(nèi)注射液體石蠟0.5 mL/只；10 d后接種雜交瘤細胞，腹腔注射0.2 mL/只；7～10 d后，根據(jù)腹水產(chǎn)生情況采集腹水；4 000 r/min離心10 min，除去油脂及細胞成分，收集腹水，測腹水抗體效價。 按照辛酸-硫酸銨法純化腹水中的單克隆抗體，SDS-PAGE分析腹水純化效果，采用間接ELISA方法檢測純化腹水抗體效價。

1.2.2.6 單克隆抗體Western blotting的鑒定 參考1.2.1.5制備SWPV載體表達的EGFP-His蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，分別以9株抗EGFP-His單克隆抗體(待檢樣品)和1株抗PCV2單克隆抗體6E2(陰性對照)為一抗，以1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，通過DAB顯色系統(tǒng)對單克隆抗體進行Western blotting檢測。

2 結(jié) 果

2.1 EGFP-His的表達及純化

2.1.1 EGFP-His基因片段的擴增 以合成質(zhì)粒EGFP-N1為模板擴增P28-EGFP-His片段，擴增產(chǎn)物大小為768 bp(圖1)，與預(yù)期一致。

圖1 P28-EGFP-His的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of P28-EGFP-His

2.1.2 重組SWPV轉(zhuǎn)移載體的鑒定 構(gòu)建好的重組質(zhì)粒用引物EGFP-F/EGFP-R進行PCR驗證，結(jié)果均得到大小約768 bp的明顯條帶(圖2)，與預(yù)期相符。提取重組質(zhì)粒，用NotⅠ和XhoⅠ雙酶切，得到大小約768和4 700 bp的2個條帶(圖3)，與預(yù)期相符。測序結(jié)果顯示，插入的基因堿基序列、位置和方向均正確，證明重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功。

M，DL2000 DNA Marker；1～6，重組克隆菌M，DL2000 DNA Marker；1-6，Recombinant bacteria clonies圖2 重組質(zhì)粒pSW-EGFP-His的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid pSW-EGFP-His

M1，DNA Marker Ⅳ；1，pSW質(zhì)粒；2，pSW-EGFP-His重組質(zhì)粒；M2，DL2000 DNA MarkerM1，DNA Marker Ⅳ；1，pSW plasmid；2，Recombinant plasmid pSW-EGFP-His；M2，DL2000 DNA Marker圖3 重組質(zhì)粒pSW-EGFP-His的酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pSW-EGFP-His by enzyme digestion

2.1.3 rSWPV-EGFP-His的純化與擴增 rSWPV-EGFP-His在第1輪純化時熒光斑較小，熒光細胞比較分散，熒光斑的數(shù)量也較少(圖4A)。經(jīng)過7輪純化，熒光斑變大、變亮且致密(圖4B)。一般經(jīng)過7～8輪純化可得到純化的重組病毒，將經(jīng)驗證的重組病毒依次用24孔板、6孔板、25 cm2培養(yǎng)瓶進行擴增培養(yǎng)，直至在熒光顯微鏡下能觀察到所有細胞均發(fā)熒光(圖4C)。

A，第1輪純化；B，第7輪純化；C，增殖的熒光斑A，The first round of purification；B，The seventh round of purification；C，F(xiàn)luorescent plaques after proliferation圖4 rSWPV-EGFP-His純化、增殖熒光斑(100×)Fig.4 Purification and proliferation fluorescence of rSWPV-EGFP-His (100×)

2.1.4 rSWPV-EGFP-His的PCR鑒定 提取純的rSWPV-EGFP-His和親本SWPV-JX20G的DNA，用引物TK1/TK2進行PCR擴增。結(jié)果顯示,親本病毒擴增出一條大小為309 bp的條帶，符合預(yù)期；重組病毒rSWPV-EGFP-His僅擴出一條大小為1 077 bp的條帶，而無309 bp的條帶(圖5)，表明EGFP-His基因成功插入到SWPVTK基因中并成功純化到rSWP-EGFP-His。

M，DL2000 DNA Marker；1；SWPV-JX20G strain；2，rSWP-EGFP-His圖5 rSWPV-EGFP-His的PCR擴增結(jié)果Fig.5 PCR amplification results of rSWPV-EGFP-His

2.1.5 EGFP-His蛋白的表達與純化 由圖6可知，EGFP-His蛋白存在于重組病毒的細胞培養(yǎng)上清中，蛋白大小約27 ku，為可溶性表達。培養(yǎng)液上清濃縮透析后，采用鎳柱純化，獲得了高純度的EGFP-His蛋白(圖7)。原核表達的EGFP-His溶液為無色，而SWPV載體表達的EGFP-His在可見光下呈現(xiàn)綠色熒光(圖8)。

M，預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，rSWPV-EGFP-His病毒液懸液；2,rSWPV-EGFP-His病毒液上清；3，rSWPV-EGFP-His病毒液沉淀M，Pre-staining Protein Marker；1，Virus suspension of rSWPV-EGFP-His；2，Supernatant of virus solution of rSWPV-EGFP-His；3，Precipitation of virus solution of rSWPV-EGFP-His圖6 EGFP-His蛋白可溶性分析Fig.6 Soluble analysis of EGFP-His protein

M，預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，rSWPV-EGFP-His細胞懸液；2～4，EGFP-His蛋白第2、3、4管洗脫液M，Pre-staining Protein Marker；1，Cell suspensions of rSWPV-EGFP-His；2-4，Tube 2,3,4 elution of EGFP-His protein圖7 EGFP-His蛋白純化Fig.7 Purification of EGFP-His protein

1，SWPV載體表達的EGFP-His；2，原核載體表達的EGFP-His1,EGFP-His expressed by SWPV vector；2，EGFP-His expressed by prokaryotic vector圖8 不同載體表達的EGFP-His蛋白Fig.8 EGFP-His protein expressed in different expression vectors

2.2 抗EGFP-His單克隆抗體的制備

2.2.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定 由表1可知，EGFP-His蛋白濃度為5 μg/mL，陰陽性小鼠血清稀釋度為1∶64 000時，陽性小鼠血清D492 nm值接近1.0，P/N值最大，因此，選擇上述濃度作為抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。

表1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定

2.2.2 免疫小鼠血清EGFP抗體水平檢測 間接ELISA結(jié)果顯示，隨免疫次數(shù)增加免疫鼠抗體效價明顯上升(圖9)，其中，5號小鼠免疫效價最高，為1∶256 000，表明SWPV載體表達的EGFP-His蛋白具有良好的免疫原性。

圖9 免疫小鼠血清抗體水平Fig.9 Serum antibody level of immunized mice

2.2.3 雜交瘤細胞篩選結(jié)果 選擇效價最高的免疫鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合，經(jīng)間接ELISA篩選到9株能穩(wěn)定分泌抗EGFP單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為7E12、2F2、4B3、11H6、9H8、17C8、9A10、18A6和17H2。這9株單克隆抗體均能與SWPV載體表達的EGFP-His蛋白反應(yīng)，其中7株(2F2、4B3、11H6、9H8、17C8、18A6和17H2)能與原核表達的EGFP-His蛋白反應(yīng)，2株(7E12和9A10)不與原核表達的EGFP-His蛋白反應(yīng)。

2.2.4 單克隆抗體制備、純化及效價測定 制備的單克隆抗體效價在1∶8×103至1∶2.048×106之間。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在大小約52和26 ku的位置出現(xiàn)2條明顯的條帶且無其他雜帶(圖10)，表明純化到單克隆抗體，2條條帶分別對應(yīng)抗體的重鏈和輕鏈，純化效果較好。

M，預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，抗EGFP-His單克隆抗體17H2腹水；2，純化的抗EGFP-His單克隆抗體17H2M，Pre-staining Protein Marker；1，Ascites of monoclonal antibody 17H2 against EGFP-His；2，Purified monoclonal antibody 17H2 against EGFP-His圖10 EGFP-His單克隆抗體純化結(jié)果Fig.10 Purification results of EGFP-His monoclonal antibody

2.2.5 單克隆抗體Western blotting檢測結(jié)果 由圖11可知，經(jīng)Western blotting檢測，2F2、4B3、11H6、9H8、17C8、18A6和17H2這7株單克隆抗體在27 ku處均有明顯的特異性反應(yīng)條帶，說明其能與變性的SWPV載體表達的EGFP-His蛋白反應(yīng)，而7E12和9A10這2株單克隆抗體在27 ku處沒有條帶，說明其不能與變性的SWPV載體表達的EGFP-His蛋白反應(yīng)?？筆CV2單克隆抗體6E12在27 ku處沒有條帶，與預(yù)期一致。

M，預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4，抗EGFP-His單克隆抗體17C8、4B3、9A10和2F2；5，抗PCV2單克隆抗體6E12；6～10，抗EGFP-His單克隆抗體11H6、9H8、17H2、18A6和7E12M，Pre-staining Protein Marker；1-4，Monoclonal antibodies 17C8,4B3,9A10 and 2F2 against EGFP-His,respectively；5，Monoclonal antibody 6E12 against PCV2;6-10，Monoclonal antibodies 11H6,9H8,17H2,18A6 and 7E12 against EGFP-His,respectively圖11 單克隆抗體Western blotting檢測結(jié)果Fig.11 Detection results of monoclonal antibody by Western blotting

3 討 論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因工程表達外源蛋白取得較大進展，迄今為止，已開發(fā)出多種原核和真核表達系統(tǒng)用于外源蛋白的表達，主要包括大腸桿菌、酵母細胞、桿狀病毒、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)等。大腸桿菌表達系統(tǒng)為原核表達系統(tǒng)，具有表達背景清楚，表達水平高，操作簡單，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強等優(yōu)點，但其表達產(chǎn)物往往易形成包涵體且難以復(fù)性，表達真核基因缺乏翻譯后修飾功能[10]。酵母表達系統(tǒng)為真核表達系統(tǒng)，表達量高，可大規(guī)模生產(chǎn)，對異源蛋白有一點簡單的修飾作用，但其發(fā)酵過程中常大量產(chǎn)熱、產(chǎn)氣，需要復(fù)雜的處理系統(tǒng)。桿狀病毒表達系統(tǒng)具有完善的加工修飾功能，表達產(chǎn)物可組裝成病毒樣顆粒(VLPs)，具有與天然蛋白近似的功能，但其生產(chǎn)需要昂貴的細胞培養(yǎng)基和血清，生產(chǎn)成本較高，且外源蛋白處于極晚期病毒啟動子的調(diào)控之下，由于病毒感染引發(fā)細胞凋亡，導(dǎo)致細胞生存時間短無法進行連續(xù)性表達，表達量低[11]。哺乳動物表達系統(tǒng)能產(chǎn)生正確折疊的蛋白，提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等翻譯后修飾功能，表達產(chǎn)物更接近于天然蛋白，是多種基因工程藥物的生產(chǎn)平臺[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，原核表達的GFP大部分以不可溶的包涵體形式存在，即使是經(jīng)過改造的EGFP表達產(chǎn)物也只是少部分可溶，且在細菌系統(tǒng)中產(chǎn)生的大多數(shù)非細菌蛋白無法形成天然構(gòu)象，相反，真核表達系統(tǒng)具有一系列翻譯后加工修飾體系，表達的外源蛋白更接近于天然蛋白[14]。朱反修等[15]用桿狀病毒表達載體表達的GFP在日光下可見微弱綠色，具有與天然GFP相似的生物活性。為獲得正確折疊及具有生物活性的GFP，本研究采用SWPV表達載體在豬腎上皮細胞中表達EGFP-His蛋白，該蛋白為可溶性表達，與原核表達的EGFP-His相比，在可見光下呈現(xiàn)明顯綠色。

GFP發(fā)色團的形成取決于肽鏈的正確折疊，其對溫度敏感，高于65 ℃時熒光形成不穩(wěn)定[16]，熱變性的GFP無法有效復(fù)性或恢復(fù)熒光[17]。研究表明，GFP抗原結(jié)構(gòu)中含有構(gòu)象依賴型的抗原表位，經(jīng)變性后會丟失，Nakamura等[18]制備了針對熱變性GFP的多克隆抗體，可識別經(jīng)熱處理和變性劑處理后暴露的GFP表位，該多克隆抗體針對的是GFP的線性表位。為獲得不同種類的抗GFP單克隆抗體，本試驗分別利用SWPV載體和原核載體表達的EGFP-His蛋白為檢測抗原進行間接ELISA，共篩選到9株抗EGFP-His單克隆抗體。 間接ELISA和Western blotting結(jié)果顯示，其中有2株單克隆抗體(7E12和9A10)既不與原核表達的EGFP-His蛋白反應(yīng)，也不與經(jīng)SDS處理的SWPV載體表達的EGFP-His蛋白反應(yīng)。這是因為2株單克隆抗體針對的是天然GFP的構(gòu)象表位，該表位在蛋白變性(如熱處理和尿素處理)后可被破壞，從而導(dǎo)致針對構(gòu)象表位的單克隆抗體無法和抗原發(fā)生反應(yīng)。其余7株單克隆抗體均可識別變性和非變性形式的GFP，針對的是GFP的線性表位。

GFP自發(fā)現(xiàn)以來被作為理想的基因表達標(biāo)記，已被廣泛應(yīng)用于跟蹤蛋白在細胞、組織和生物體中的定位和相互作用，檢測外源基因表達情況等[19-22]。通過熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀可進行GFP定量檢測，Gerena-lópez等[23]通過流式細胞術(shù)對轉(zhuǎn)染的Molt-4T細胞系的EGFP表達進行了定量；茍吉慶等[24]利用熒光分光光度計對植物組織中的GFP表達水平進行定量分析，其結(jié)果與熒光顯微鏡觀察結(jié)果高度一致；張塏等[25]建立了一套通過定量檢測細胞熒光強度從而測定EGFP表達水平的方法，該方法簡單有效,且不依賴于大型儀器設(shè)備,具有較高的準(zhǔn)確性與靈敏度，但上述方法均存在一定局限性，結(jié)果判定主觀性強，無法進行準(zhǔn)確定量。制備抗GFP的特異性抗體可用于建立免疫學(xué)檢測方法，對GFP或GFP標(biāo)記的融合蛋白進行定量或半定量檢測[26]。劉全等[27]以GFP兔抗血清為一抗,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔血清為二抗,建立了GFP定量檢測的間接ELISA方法，該方法能正確反映藍氏賈第鞭毛蟲病毒(GLV)介導(dǎo)的GFP表達情況,可用于GFP定量方析。本研究在表達EGFP-His蛋白的基礎(chǔ)上制備了抗EGFP-His的單克隆抗體，可用于今后建立免疫學(xué)檢測方法，對GFP進行定性/定量檢測，為SWPV表達載體的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究利用SWPV載體成功表達并純化了EGFP-His蛋白，大小為27 ku，為可溶性表達，可見光下呈現(xiàn)明顯綠色。采用雜交瘤技術(shù)制備了9株抗EGFP-His蛋白單克隆抗體，其中2株針對GFP的構(gòu)象表位，其余7株針對GFP的線性表位。本研究制備的EGFP-His蛋白和9株抗EGFP-His單克隆抗體為后續(xù)建立GFP的免疫學(xué)檢測方法提供了必備材料。