陳 靜，吳 燕，李 梅，岳 筠，朱二鵬,2，文 明,2，張雙翔，程振濤,2

(1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴陽 550025；3.貴州省動物疫病預防控制中心，貴陽 550008)

絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.capri,Mmc)屬于絲狀支原體簇，感染山羊及綿羊后可導致羊支原體性肺炎(Mycoplasmapneumonia of goats and sheep,MPGS)，其臨床癥狀主要以高熱、咳嗽、胸膜及肺臟發(fā)生炎癥為主[1-2]。近年來，許多地區(qū)羊群中均有MPGS發(fā)生，該病波及范圍廣、傳播速度快且發(fā)病率高，嚴重制約了中國養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。疫苗免疫是防制該病的主要措施，而疫苗免疫效果評估是防控本病的有力保障[3]。目前，用于疫苗免疫效果評估的主要手段有血凝試驗、血凝抑制試驗及ELISA等，其中ELISA方法在靈敏度及特異性等方面占有很大的優(yōu)勢，是最常用的方法之一[4-5]。

糖脂和膜蛋白是細胞膜抗原的主要結(jié)構(gòu)成分，在特定的條件下能與抗原誘導的抗體等物質(zhì)進行特異性結(jié)合[6]。支原體表面具有大量結(jié)構(gòu)復雜的膜蛋白，這些膜蛋白具有識別和免疫的作用，在一定條件下既能刺激機體產(chǎn)生免疫應答反應，又與支原體致病力的強弱密切相關[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，Mmc擁有龐大、結(jié)構(gòu)復雜的基因組，而Mmc LPPA蛋白是整個絲狀支原體簇均存在的一種膜脂蛋白，該蛋白具有高度保守性。其基因序列位于Mmc 251-1 822位堿基，除了N-端5-25位氨基酸外，LPPA蛋白絕大部分區(qū)域均具有較強的抗原性。但關于Mmc LPPA蛋白的功能研究目前尚不明確，推測其可能在支原體進入到宿主細胞過程中發(fā)揮著關鍵作用[10]。近年來，Mmc已在世界多國流行，成為阻礙山羊養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的病原之一，給羊產(chǎn)業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失。目前常用的診斷方法有支原體分離培養(yǎng)、PCR及實時熒光定量RT-PCR等[11-13]。關于疫苗效果評估方法的報道極少，ELISA方法以其簡便、檢測樣本量大等優(yōu)點，多用于疫苗免疫效果的評價。但對于Mmc的ELISA診斷方法目前報道較少，Mmc抗體檢測技術仍處于起步階段，嚴重制約了該病的有效診斷與防治工作。因此，建立一種針對Mmc的快速、特異、敏感的檢測方法對羊支原體肺炎的診斷、監(jiān)控及流行病學調(diào)查工作具有重要意義。本研究原核表達Mmc LPPA蛋白，并將純化的重組蛋白作為包被抗原，建立了一種Mmc重組LPPA蛋白的間接ELISA抗體檢測方法，以期為Mmc抗體水平檢測、流行病學調(diào)查、疫苗免疫效果評價提供重要的技術手段。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及血清樣本

Mmc PG3標準株購自中國微生物菌種資源庫保存中心；大腸桿菌BL21(DE3)和DH5α感受態(tài)細胞、大腸桿菌原核表達質(zhì)粒pCold-Ⅰ均由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室保存；綿羊肺炎支原體(Mo)和Mmc標準陽性及陰性血清、弓形蟲(Tox)標準陽性血清、Mmc正向間接血凝診斷試劑盒均購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所；藍舌病病毒(BTV)和小反芻獸疫病毒(PPRV)標準陽性血清均購自北京天之泰公司；羊口蹄疫病毒(FMDV)標準陽性血清購自武漢科前動物生物制品有限責任公司；山羊痘病毒(GPV)標準陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；184份臨床檢測血清及92份經(jīng)Mmc正向間接血凝診斷試劑盒檢測抗體陰性的羊血清均采自貴州省遵義市某規(guī)模養(yǎng)羊場。

1.2 主要試劑

支原體基因組小量提取試劑盒購自Biomiga公司；E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit、E.Z.N.A.TMPlasmid Kit均購自Omega公司；蛋白純化試劑盒購自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和XhoⅠ、Prestained Protein Ladder、T4 DNA連接酶均購自ThermFisher公司；DL2000 DNA Marker和DL5000 DNA Marker均購自天根生化科技(北京)有限公司；IPTG購自Sigma公司；兔抗羊IgG-HRP購自北京博奧森生物技術有限公司；DAB購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 重組蛋白誘導表達及純化

1.3.1 引物設計與合成 參照GenBank已登錄的MmcLPPA基因序列(登錄號：AF072715.1)，利用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物。引物序列為：Mmc-LPPA-F：5′-CTCGAGACCACCA-TGAGTTTGCAAGAAACAGACAAAGATG-3′；Mmc-LPPA-R：5′-TTTAGCTGCTGCTACTGA-3′，預期擴增片段大小為450 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2LPPA基因原核表達載體的構(gòu)建 以支原體基因組小量提取試劑盒提取Mmc PG3株基因組DNA,以Mmc-LPPA-F和Mmc-LPPA-R為引物擴增目的基因。 PCR反應體系25 μL：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，利用E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit純化目的片段，純化后的目的片段用T4 DNA連接酶與pCold-Ⅰ載體于16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)菌液PCR、雙酶切及測序鑒定后獲得表達質(zhì)粒載體pCold-Ⅰ-LPPA。

1.3.3 重組蛋白的誘導及表達 將酶切和測序正確的質(zhì)粒pCold-Ⅰ-LPPA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取LB(含Amp)固體培養(yǎng)基的單個菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG進行誘導表達(時間為3 h)，收集菌體用預冷的PBS洗滌2～3次并超聲破碎，破碎完畢后，9 000 r/min離心10 min,收集上清和沉淀，分別制樣，進行SDS-PAGE,鑒定其表達情況與可溶性。

1.3.4 蛋白純化及反應原性分析 根據(jù)His·tag融合蛋白純化試劑盒步驟純化蛋白并采用Western blotting和瓊脂擴散血清學試驗分析其與Mmc陽性血清的反應原性。Western blotting：將SDS-PAGE產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，隨后加入5%脫脂奶粉于37 ℃封閉2 h；封閉結(jié)束后用TBST洗滌3次，加入稀釋好的一抗高免血清4 ℃過夜,TBST洗滌3次后加入HRP標記酶標二抗，37 ℃孵育1 h；TBST洗滌3次，將PVDF膜置于DAB底物顯色溶液中顯色，待目的條帶清晰后迅速置于蒸餾水中終止顯色反應，觀察并分析結(jié)果。瓊脂擴散血清學試驗：取新制作的瓊脂擴散平板，經(jīng)打孔、封板后在中央孔加入純化的Mmc LPPA重組蛋白，在周圍孔分別加入Mmc標準陽性血清、標準陰性血清和臨床陽性血清，置于濕盒中，37 ℃恒溫箱中放置12～24 h后觀察結(jié)果。

1.4 Mmc LPPA蛋白抗體ELISA檢測方法的建立

1.4.1 反應體系的建立與優(yōu)化 用包被緩沖液將重組純化蛋白Mmc LPPA分別稀釋為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 μg/100 μL，加入96孔酶標板中，100 μL/孔，室溫包被過夜。按方陣滴定法，加入不同稀釋度(1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300和1∶500)的Mmc標準陽性血清、陰性血清到同一個稀釋度的抗原包被孔中，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，每孔做一次重復，并做空白對照試驗。最佳優(yōu)化條件：P/N值最大(P=陽性對照D630 nm平均值-空白對照D630 nm平均值；N=陰性對照D630 nm平均值-空白對照D630 nm平均值)、陰性對照值較小的抗原濃度、陽性血清及陰性血清稀釋度。

通過已確定的優(yōu)化條件，分別以1%明膠、3%明膠、0.5% BSA、1% BSA、3% BSA、1%脫脂奶粉、3%脫脂奶粉、5%脫脂奶粉進行0.5、1.0、1.5及2.0 h不同時間的封閉，同時以不封閉孔及空白孔作為對照孔，每孔做一次重復。通過測定每個樣品的D630 nm值計算P/N值，取P/N值最大時所對應條件為最佳封閉液和封閉時間。

1.4.3 ELISA方法性能評估 應用上述方法，以Mmc標準陽性血清及陰性血清為陽性對照和陰性對照，每孔重復1次。分別對Mo、BTV、FMDV、弓形蟲、GPV及PPRV的標準陽性血清進行檢測，測定D630 nm值，對該方法的特異性進行評估。

批內(nèi)重復試驗：準備抗原包被酶標板(同批制備)和4份臨床羊血清(隨機抽取)，用已確定的間接ELISA反應程序進行檢測，每份血清均做8次重復性試驗。批間重復試驗：準備4份臨床羊血清(隨機選取)，采用8個抗原包被酶標板(不同批次)，進行間接ELISA檢測。應用統(tǒng)計學原理分別對批內(nèi)及批間重復試驗的差異性進行評估，變異系數(shù)<10%，即可判定為該ELISA方法的重復性較好[15]。

1.5 間接ELISA方法的臨床應用

分別應用本研究建立的間接 ELISA方法和Mmc正向間接血凝診斷試劑盒對從貴州省某規(guī)模羊場采集的184份血清樣本進行平行檢測，并對其結(jié)果進行比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒鑒定

以從Mmc貴州分離株提取的DNA為模板，經(jīng)PCR擴增得到大小為450 bp的目的基因片段(圖1)，與預期大小相符。 將目的基因片段連入pCold-Ⅰ載體質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行PCR、雙酶切及測序鑒定，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒PCR擴增出大小為450 bp的目的條帶(圖2)，雙酶切鑒定得到大小為4 407 bp的載體條帶和450 bp的目的條帶(圖3)，且重組質(zhì)粒測序結(jié)果正確，表明pCold-Ⅰ-LPPA原核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M，DL2000 DNA Marker；1、2，Mmc LPPA基因；3，陰性對照M，DL2000 DNA Marker;1 and 2，Mmc LPPA gene；3，Negative control圖1 Mmc LPPA基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of Mmc LPPA gene

M，DL2000 DNA Marker;1～3，重組質(zhì)粒;4，陽性對照；5，陰性對照M，DL2000 DNA Marker;1-3，Recombinant plasmids;4，Positive control；5，Negative control圖2 Mmc pCold-Ⅰ-LPPA重組質(zhì)粒鑒定Fig.2 Identification of Mmc recombinant plasmid pCold-Ⅰ-LPPA

M，DL5000 DNA Marker;1～3，重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物;4，菌液PCR產(chǎn)物;5，空載體對照M，DL5000 DNA Marker;1-3，Recombinant plasmid double digestion products；4，Bacterial liquid PCR product;5，Empty vector control圖3 Mmc pCold-Ⅰ-LPPA 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.3 Double enzyme digesting identification of recombinant plasmid of Mmc pCold-Ⅰ-LPPA

2.2 重組蛋白誘導表達及純化

將含有重組表達載體pCold-Ⅰ-LPPA的重組菌在適宜條件下進行誘導表達和純化，重組蛋白超聲裂解結(jié)果分析顯示，在23 ku附近出現(xiàn)目的條帶，主要以包涵體形式表達(圖4)。SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，重組蛋白被洗脫，且雜蛋白較少(圖5)，表明目的蛋白純化成功。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準;1、2，重組蛋白上清;3、4，重組蛋白沉淀M，Protein Marker;1 and 2，Supernatant of recombinant protein;3 and 4,Precipitate of recombinant protein圖4 Mmc pCold-Ⅰ-LPPA重組蛋白可溶性分析Fig.4 Solubility analysis of Mmc recombinant protein pCold-Ⅰ-LPPA

M,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準;1,重組蛋白沉淀;2～4，純化1、2和3 h后收集的重組蛋白M，Protein Marker;1，Recombinant protein precipitation;2-4，Recombinant protein collected after 1,2 and 3 h,respectively圖5 Mmc pCold-Ⅰ-LPPA 重組蛋白純化結(jié)果Fig.5 Purification results of recombinant protein pCold-Ⅰ-LPPA

2.3 重組蛋白反應原性檢測結(jié)果

2.3.1 瓊脂擴散試驗 瓊脂擴散試驗結(jié)果顯示，重組蛋白與Mmc標準陰性血清孔之間無沉淀線，而Mmc標準陽性血清孔和臨床陽性血清孔與純化重組之間均出現(xiàn)明顯的沉淀線，表明pCold-Ⅰ-LPPA重組蛋白具有良好反應原性(圖6)。

1,pCold-Ⅰ-LPPA重組蛋白；2，Mmc標準陽性血清；3，Mmc標準陰性血清；4～7，臨床陽性血清1，Recombinant protein pCold-Ⅰ-LPPA;2，Standard positive serum of Mmc;3，Standard negative serum of Mmc;4-7，Clinical positive sera圖6 pCold-Ⅰ-LPPA重組蛋白反應原性檢測結(jié)果Fig.6 Detection of reactivity of recombinant protein pCold-Ⅰ-LPPA

2.3.2 Western blotting試驗結(jié)果 Western blotting試驗結(jié)果顯示，純化后的蛋白能與Mmc陽性血清特異性反應，在23 ku處出現(xiàn)特異條帶(圖7)，表明pCold-Ⅰ-LPPA重組蛋白具有良好的反應原性。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1～3，純化的pCold-Ⅰ-LPPA重組蛋白；4，pCold-Ⅰ空載體M，Protein Marker;1-3，Purified recombinant protein pCold-Ⅰ-LPPA;4，pCold-Ⅰ empty vector圖7 pCold-Ⅰ-LPPA重組蛋白Western blotting鑒定Fig.7 Identification of recombinant protein pCold-Ⅰ-LPPA by Western blotting

2.4 基于Mmc LPPA蛋白的間接ELISA方法的建立

2.4.1 抗原及血清最佳工作濃度測定結(jié)果 采用矩陣法設計不同稀釋度重組蛋白pCold-Ⅰ-LPPA與不同稀釋度Mmc標準陽性、陰性血清反應，取陰性對照值達到最低，且P/N值達到最大時的抗原及血清濃度作為最佳優(yōu)化條件。最終確定抗原最佳包被量為2.0 μg/100 μL，血清最佳稀釋度為1∶300(表1)。

表1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度測定結(jié)果(P/N值)

2.4.2 封閉液及封閉時間優(yōu)化結(jié)果 在優(yōu)化條件下，根據(jù)矩陣法分別對不同封閉液、不同封閉時間進行比較，封閉液為3% BSA，封閉時間為1.0 h時P/N值最大(表2)，確定3% BSA封閉1.0 h為最佳封閉條件。

表2 封閉液及封閉時間優(yōu)化結(jié)果(P/N值)

2.5 ELISA方法性能評估

應用本試驗建立的間接ELISA方法檢測Mmc標準陽性血清的P/N值為2.846；而檢測Mo、BTV、FMDV、弓形蟲、GPV及PPRV標準陽性血清的P/N值為1.427～1.741，均為陰性，說明建立的間接 ELISA特異性良好。

重復性試驗結(jié)果顯示，建立的ELISA方法批內(nèi)變異系數(shù)在1.83%～5.41%之間；批間變異系數(shù)在2.95%～9.01%之間,批內(nèi)及批間變異系數(shù)均<10%(表3)，表明該方法的重復性良好。

表3 重復性試驗結(jié)果(n=8)

2.6 間接ELISA方法的臨床應用

分別應用正向間接血凝診斷試劑盒和本研究建立的間接 ELISA方法對貴州省某規(guī)模羊場采集的184份血清樣本進行平行檢測分析，結(jié)果顯示本試驗建立的ELISA方法檢測的蛋白抗體陽性率為52.72%(97/184)，而正向間接血凝診斷試劑盒檢測蛋白抗體陽性率為40.76%(75/184)，2種方法的陽性符合率為93.33%(70/75)，陰性符合率為75.23%(82/109)，相對符合率為82.61%。

3 討 論

羊支原體肺炎的診斷方法較多,如病原分離培養(yǎng)、血清學診斷和分子生物學診斷等[16]。其中病原分離培養(yǎng)為鑒定該病的主要方法，但由于Mmc對培養(yǎng)基營養(yǎng)要求高、培養(yǎng)周期長、培養(yǎng)困難，羊支原體肺炎的病原分離培養(yǎng)方法不適用于臨床檢測[17-18]。血清學診斷方法是對Mmc感染進行流行病學調(diào)查、檢測和疫苗免疫效果評價的重要手段。其中,ELISA方法特異性強、靈敏度高、高效省時，可用于大量樣本的篩選[19]。目前已建立的Mmc血清學檢測方法中，間接血凝試驗存在保質(zhì)期短、試驗結(jié)果判定主觀性較強等問題，且尚無特異針對Mmc檢測的標準商業(yè)化試劑盒。因此，對于Mmc的臨床診斷及病原防控仍需一種快速、特異、敏感的間接ELISA檢測方法。本研究基于膜蛋白LPPA建立ELISA方法，為Mmc感染動物后的疫苗效果評估及流行病學監(jiān)測提供一種快速、準確、有效的檢測手段。

選擇合適的抗原包被蛋白是建立ELISA檢測方法的關鍵。支原體脂蛋白的抗原性較強，常被用于血清學診斷，膜脂蛋白LPPA存在于絲狀支原體簇的表面，是重要的抗原組成成分[20]。Dedieu等[21]對與Mmc同屬于絲狀支原體簇的牛傳染性胸膜肺炎支原體的4種蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)，LPPA作為其免疫優(yōu)勢蛋白，能誘導強烈的體液免疫。張玲等[22]對脂蛋白Mmc LPPA蛋白進行誘導表達，證實了其具有良好的免疫原性和反應原性。基于以上研究及貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室前期對該基因的生物信息學分析，推測Mmc LPPA蛋白可作為一種免疫原性蛋白初步應用于免疫學相關研究。本試驗通過原核表達系統(tǒng)對Mmc LPPA蛋白進行了表達。原核表達系統(tǒng)在蛋白的融合表達中具有操作簡單、成本低廉、表達量高、純度高、純化方式簡易、可短時間大量制備且不易散毒等優(yōu)點[23]。本研究選擇原核表達載體pCold-Ⅰ在表達蛋白的末端加入His-tag，成功誘導表達了目的蛋白，但表達蛋白主要以包涵體存在。通常情況下以包涵體形式表達的重組蛋白在純化環(huán)節(jié)操作較為復雜，且包涵體蛋白的反應原性比可溶性蛋白差，應用價值相對較低[24]。但本試驗通過優(yōu)化表達條件后成功獲得純化的LPPA蛋白，純化過程簡單，表達量可觀；瓊脂擴散試驗結(jié)果顯示，純化蛋白與Mmc陰性血清無特異性反應，但與Mmc陽性血清能夠發(fā)生特異性反應，綜合Western blotting試驗再一次表明該蛋白具有良好的反應原性，可將其作為建立間接ELISA方法的包被蛋白。

特異性是評價血清學檢測技術的一個重要指標。儲岳峰等[25]將絲狀支原體山羊亞種PG3株經(jīng)處理后獲得滅活抗原，建立了檢測絲狀支原體山羊亞種抗體的間接血凝試驗方法，但采用完整病原體作為包被抗原時，由于抗原成分復雜，很難避免與其他病原特別是親緣關系近的病原的抗體發(fā)生交叉反應，從而難以保證檢測方法的特異性。本試驗以純化后的Mmc LPPA蛋白作為包被抗原，單一包被抗原較好地避免了因抗原成分復雜帶來的病原間的抗體交叉反應。李敏杰等[26]建立A型口蹄疫抗體固相競爭ELISA方法時，以其能特異性檢測A型FMDV標準陽性血清而不能檢出其他病毒的陽性血清來說明所建方法的特異性較強。本研究使用相同方法進行ELISA性能評估，建立的間接ELISA方法能特異性檢測Mmc標準陽性血清而未與Mo、BTV、FMDV等6種病原體的標準陽性血清發(fā)生交叉反應，進一步說明Mmc LPPA純化蛋白的純度較高，以該蛋白為包被原建立的ELISA方法特異性較強。重復性試驗結(jié)果顯示，本方法變異系數(shù)在1.83%～9.01%之間，證明所建的ELISA方法具有良好的重復性。敏感性是評價血清學檢測技術的另一指標。由于目前沒有針對該Mmc的商品化的ELISA檢測試劑盒，因此本研究使用商品化的間接血凝診斷試劑盒對184份血清樣本進行對比檢測，本方法對臨床樣品的檢測陽性率比間接血凝診斷試劑盒高，證明本方法具有更高的敏感性，能檢測到較低水平的血清抗體滴度。這與張煥容等[27]得出的樣品檢測陽性率愈高證明ELISA方法敏感性愈高這一結(jié)果相符。綜上所述，本研究建立的ELISA方法能在保持特異性的同時，還具有較好的敏感性和重復性，能準確地對Mmc抗體水平進行檢測，為Mmc的檢測及流行病學調(diào)查提供了一種可靠的方法，為Mmc的防控提供參考。

4 結(jié) 論

本研究通過原核表達純化的方法，成功表達并純化了Mmc LPPA蛋白，以其為包被蛋白，通過檢測條件的優(yōu)化，初步建立了Mmc LPPA蛋白間接ELISA抗體檢測方法。該方法具有良好的特異性和重復性。臨床樣品檢測結(jié)果表明，該方法與間接血凝診斷試劑盒具有較高的檢測符合率，在Mmc血清學診斷防治研究中具有一定的臨床應用價值。