陳 璇，呂艷秋，韓 越，徐一超，金 一

(延邊大學(xué),東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，延吉 133000)

精子冷凍是保存雄性配子最常用的技術(shù)，可以保存新鮮精液以備人工授精。冷凍保存過程中通常需要稀釋劑和添加劑，以保護(hù)精子免受冷休克的損傷，從而最大程度地維持精子的頂體完整性、質(zhì)膜的流動(dòng)和滲透性以及DNA完整性[1]。目前，雖然已經(jīng)建立了公牛精液不同的稀釋劑和冷凍方案，但其受精效果仍無法與新鮮精液相比。因此，研究更有效的冷凍保護(hù)劑對(duì)于提高冷凍保存精子的存活率和生殖能力至關(guān)重要。研究表明，多種化合物對(duì)冷凍豬精子具有保護(hù)作用[2]，通常，人們更傾向于向冷凍保護(hù)劑中添加甘油以保護(hù)精子，使精子受到的損傷最小化。在凍融過程中，像海藻糖這樣的非滲透性低溫保護(hù)劑會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜對(duì)體積變化的敏感性降低[3]。海藻糖在冷凍前通過細(xì)胞脫水引發(fā)高滲，從而減少細(xì)胞內(nèi)水分，防止精子內(nèi)冰晶的形成，防止精子損傷和受精能力的下降。同時(shí)海藻糖也能與低脫水的磷脂膜發(fā)生反應(yīng)，增加膜的穩(wěn)定性，從而增加對(duì)低溫?fù)p傷的抵抗力。許多研究表明，海藻糖可作為公羊[4]、公豬[5]、魚類[6]等精液的冷凍保護(hù)劑。宋國(guó)欣等[7]證實(shí)海藻糖和甘油具有協(xié)同作用，可以提高凍融后絨山羊精液的品質(zhì)。目前為止，甘油仍然是精液冷凍過程中常見的滲透性保護(hù)劑，然而當(dāng)甘油濃度過高時(shí)會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生毒性，降低公雞精子的受精能力[8]。海藻糖作為一種非滲透性雙糖被認(rèn)為是最重要、最有效的冷凍保護(hù)劑之一[9]。海藻糖通過與膜磷脂的極性頭形成氫鍵，在脫水過程中替換水分子阻止細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而達(dá)到對(duì)質(zhì)膜的低溫保護(hù)作用[10]。由于精液在冷凍過程中形成冰晶，使精子受到不可逆的損傷，導(dǎo)致解凍后精液的質(zhì)量不佳[11-12]。只有獲能的精子才可以完成受精，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化是獲能的標(biāo)志[13]，因而檢測(cè)凍融精子的酪氨酸磷酸化水平是十分必要的。凍融引起的氧化應(yīng)激導(dǎo)致精子魚精蛋白中二硫鍵的斷裂，使得精子細(xì)胞核脫氨基，精子染色質(zhì)相對(duì)較少，最終精子發(fā)生DNA斷裂和凋亡樣改變。魚精蛋白的丟失可增加DNA斷裂的可能性[14]。因此，本研究探討在牛的精液冷凍保護(hù)劑中減少甘油濃度，補(bǔ)充海藻糖是否可以提高凍融后精子的質(zhì)量，以期為進(jìn)一步完善公牛精子冷凍保護(hù)劑的成分，提高公牛精子凍融后的質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取3頭3～5歲健康的延邊黃牛，采用手握法采集新鮮精液，每周收集2次，每頭牛收集3份，選取其中活力≥90%的精液混合后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 主要試劑及儀器

硫酸鏈霉素、考馬斯亮藍(lán)、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒JC-1、SDS電泳液和凝膠試劑盒、BCA試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Yo-Pro-1購(gòu)自Life公司；PBS購(gòu)自Biond公司；甘油、海藻糖、Hoechst 33342、碘化丙啶(PI)、部花青540(M540)、色霉素A3(CMA3)、果糖、檸檬酸鈉、葡萄糖、青霉素均購(gòu)自Sigma公司；冷凍保護(hù)劑：蛋黃200 mL/L+檸檬酸鈉13.536 g/L+Tris 24.224 g/L+葡萄糖11 g/L+硫酸鏈霉素1 g/L+青霉素0.8 g/L。

精子-微生物動(dòng)(靜)態(tài)圖像檢測(cè)分析系統(tǒng)(CASA,CN15-T31)購(gòu)自北京華方神火科技有限公司；數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)(ESSENTIAL V6)購(gòu)自UVITEC公司；倒置熒光顯微鏡(C-S-HP35)購(gòu)自Nikon公司；流式細(xì)胞儀(BDaccuri C6)購(gòu)自BD公司。

1.3 冷凍精液處理及分組

將用冷凍保護(hù)劑稀釋后的精液依次裝入0.25 mL冷凍麥管中，蘸取聚乙烯醇粉末封口，于4 ℃中平衡3.5 h。后將麥管放置在液氮上方距離液面3～5 cm處熏蒸8～10 min，隨后投入液氮凍存。儲(chǔ)存6～8周后，取出裝有精液的冷凍麥管，于37 ℃水浴中30 s，用于評(píng)估解凍后精子的參數(shù)。

將冷凍保護(hù)劑與精液樣本混勻，調(diào)整精子密度至1×108/mL。設(shè)置6%甘油、3%甘油+0、50、100和150 mmol/L海藻糖組，總共5組，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組。 通過精子質(zhì)量及動(dòng)力學(xué)參數(shù)評(píng)估后，篩選出最佳海藻糖處理濃度，用于后續(xù)檢測(cè)。

1.4 方法

1.4.1 精子活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整性評(píng)估 取100 μL稀釋后的精液與900 μL低滲腫脹液(果糖13.512 g/L，檸檬酸鈉7.352 g/L) 1∶9混合，于38.5 ℃下孵育30 min。孵育后各組分別取3 μL放在精子-微生物動(dòng)(靜)態(tài)圖像檢測(cè)分析系統(tǒng)(CASA)的腔室中，始終保持37 ℃。隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行精子活力檢測(cè)；孵育后通過顯微鏡觀察精子質(zhì)膜完整性。精子頂體完整性通過考馬斯亮藍(lán)染色法檢測(cè)，取孵育后的精液100 μL均勻涂抹于載玻片，用1 mL考馬斯亮藍(lán)染色液將精子均勻覆蓋，避光室溫孵育30 min，然后通過顯微鏡觀察考馬斯亮藍(lán)染色情況。所有檢測(cè)每次至少計(jì)數(shù)200個(gè)精子，每組至少觀察5個(gè)視野，重復(fù)3次。

1.4.2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)評(píng)估 曲線速度(VCL)、直線速度(VSL)、平均路徑速度(VAP)、直線性運(yùn)動(dòng)(LIN)、前向性運(yùn)動(dòng)(STR)等精子的動(dòng)力學(xué)參數(shù)均用精子-微生物動(dòng)(靜)態(tài)圖像檢測(cè)分析系統(tǒng)(CASA)進(jìn)行評(píng)估。精子處理同1.4.1，孵育后各組分別取3 μL放在分析儀的腔室中，始終保持37 ℃。隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3次。

1.4.3 獲能狀態(tài)檢測(cè) 用蛋白酪氨酸磷酸化水平評(píng)估新鮮精子和凍融精子獲能情況，以β-tubulin為內(nèi)參。新鮮精子分為獲能和非獲能2組，凍融精子(Ⅰ、Ⅱ組和最佳濃度海藻糖組)均進(jìn)行獲能處理，需獲能精子用PBS洗2次后，用BO獲能液處理，置于CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h。孵育后提取各組蛋白，一部分用于測(cè)定蛋白濃度(BCA試劑盒)，一部分用于Western blotting檢測(cè)。按照凝膠試劑盒步驟配制濃縮膠和分離膠，向電泳槽中注入1×電泳液，將5組精子的蛋白樣品與上樣緩沖液混合變性后，上樣、電泳，電泳結(jié)束后將凝膠取出轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用TBST洗膜3次，每次10 min。 隨后用封閉液孵育1～2 h。 TBST洗膜3次后，一抗(P1869 1∶2 000,Sigma) 4 ℃孵育過夜。18～24 h后，用TBST洗膜3次，加入二抗(A0168 1∶2 000,Sigma)孵育1～2 h，用TBST洗膜3次后均勻滴加ECL顯影液，在數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)中成像并拍照。用Image J軟件統(tǒng)計(jì)蛋白條帶灰度值。

1.4.4 活率與線粒體膜電位評(píng)估 將新鮮精子、Ⅰ、Ⅱ組和最佳濃度海藻糖組精子進(jìn)行Hoechst 33342/PI/JC-1聯(lián)合染色分析，用以評(píng)估凍融精子的活率(頭部)和線粒體膜電位水平(中段)。 取500 μL解凍后的精液樣品，加入2.5 μL Hoechst 33342(20 μmol/L)和5 μL JC-1(153 μmol/L)，37 ℃避光孵育20 min后加入2.5 μL PI(2.4 mmol /L)，37 ℃孵育10 min。將孵育后的精子置于熒光顯微鏡下觀察染色情況(其中頭部呈紅色熒光的為死精子；頭部呈藍(lán)色熒光、中段呈橙紅色熒光的為高水平線粒體膜電位活精子，頭部呈藍(lán)色熒光、中段呈較少綠色或無綠色熒光為低水平膜電位活精子)，評(píng)估200～300個(gè)精子，每組至少觀察5個(gè)視野，重復(fù)3次。

1.4.5 膜脂質(zhì)紊亂水平檢測(cè) 使用部花青540(M540)和Yo-Pro-1染色法，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)精子的膜脂質(zhì)紊亂水平。取新鮮精子及Ⅰ、Ⅱ組和最佳濃度海藻糖組精子各1 mL，加入2.7 μL M540和1 μL Yo-Pro-1，37 ℃避光孵育30 min。Yo-Pro-1的熒光由FL1通道接收，M540的熒光由FL3通道接收。

1.4.6 DNA完整性評(píng)估 精子DNA的完整性通常使用CMA3染料評(píng)估魚精蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常時(shí)CMA3呈陽性，精子頭部發(fā)出亮綠色熒光；染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常時(shí)CMA3為陰性，精子頭部發(fā)出暗綠色熒光。具體操作步驟為：每個(gè)精液樣品在不含Ca2+和Mg2+的PBS中洗滌2次，在固定液甲醇和冰醋酸(3∶1)中于4 ℃條件下固定5 min后涂片；取100 μL CMA3染色工作液，pH 7.0，其中包含10 mmol/L氯化鎂,均勻滴加到載玻片上，避光室溫孵育20 min。然后將載玻片在McIlvain的緩沖液中沖洗并風(fēng)干；置于熒光顯微鏡下觀察，每次至少評(píng)估200個(gè)精子，每組至少觀察5個(gè)視野，重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，用GraphPad Prism 8繪圖。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 海藻糖替代部分甘油對(duì)凍融延邊黃牛精子質(zhì)量參數(shù)的影響

由表1可知，與Ⅰ組相比，Ⅱ組精子活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整性均顯著下降(P<0.05)，與Ⅰ和Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組精子的活力均顯著升高(P<0.05)，其中Ⅳ和Ⅴ組精子的質(zhì)膜完整性和頂體完整性均顯著提高(P<0.05)。

表1 凍融精子的質(zhì)量參數(shù)

2.2 海藻糖替代部分甘油對(duì)凍融延邊黃牛精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

由表2可知，與Ⅰ組相比，Ⅱ組精子的VCL和STR都顯著下降(P<0.05)，補(bǔ)充海藻糖(Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組)后精子的VCL、VSL、VAP、LIN和STR均顯著升高(P<0.05)，其中Ⅳ組精子解凍后的質(zhì)量最佳。因此，后續(xù)試驗(yàn)選用100 mmol/L海藻糖處理精子。

表2 凍融精子的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.3 海藻糖替代部分甘油對(duì)凍融延邊黃牛精子獲能狀態(tài)的影響

蛋白酪氨酸磷酸化檢測(cè)結(jié)果顯示，各組精子在獲能過程中，出現(xiàn)了典型的酪氨酸磷酸化蛋白條帶(17、27、38、72、180 ku處)增加(圖1A)。相對(duì)表達(dá)量結(jié)果顯示，與新鮮精子相比，凍融精子獲能后其蛋白酪氨酸磷酸化的條帶顯著減少(P<0.05)；與Ⅰ組相比，100 mmol/L海藻糖組酪氨酸磷酸化蛋白條帶稍有增加，但差異不顯著(P>0.05)(圖1B)。

①A，精子蛋白酪氨酸磷酸化水平檢測(cè)；B，精子蛋白酪氨酸磷酸化相對(duì)表達(dá)量。②1，未獲能的新鮮精子組，2，獲能新鮮精子組；3～5，Ⅰ、Ⅱ組和100 mmol/L海藻糖組。③肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同①A,Detection of tyrosine phosphorylation level of sperm protein;B,Relative expression of sperm protein tyrosine phosphorylation.②1,Fresh sperm (non-capacitated) group;2,Fresh sperm (capacitated) group;3～5,Ⅰ，Ⅱ and 100 mmol/L trehalose groups.③Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖1 各組精子蛋白酪氨酸磷酸化水平Fig.1 Tyrosine phosphorylation level of sperm in each group

2.4 海藻糖替代部分甘油對(duì)凍融延邊黃牛精子活率與線粒體膜電位的影響

凍融精子的活率和線粒體膜電位的染色結(jié)果如圖2A，具有完整質(zhì)膜和高水平線粒體膜電位的活精子細(xì)胞其頭部呈藍(lán)色，中段呈橙紅色。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2B，線粒體膜電位統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2C。結(jié)果顯示，與新鮮精子相比，凍融組精子的活率和線粒體膜電位均顯著降低(P<0.05)。凍融組中，與Ⅰ組相比，Ⅱ組精子的活率與線粒體膜電位水平顯著下降(P<0.05)，100 mmol/L海藻糖組精子的活率和線粒體膜電位均顯著升高(P<0.05)。

①A，活率及線粒體膜電位染色(200×)；B，活率統(tǒng)計(jì)；C，線粒體膜電位水平統(tǒng)計(jì)。②α，具有完整質(zhì)膜和高水平線粒體膜電位的活精子細(xì)胞；β，具有完整質(zhì)膜和低水平線粒體膜電位的活精子細(xì)胞；γ，質(zhì)膜不完整和線粒體膜電位高的死精子細(xì)胞。③1、2、3和4分別為新鮮精子及Ⅰ、Ⅱ組和100 mmol/L海藻糖組。下同①A,Viability and mitochondrial membrane potential staining (200×);B,Statistics of motility rate;C,Statistics of mitochondrial membrane potential level.②α,Live sperm cells,with an intact plasma and high level of mitochondrial membrane potential;β,Live sperm cells,with an intact plasma membrane integrity and low level of mitochondrial membrane potential;γ,Dead sperm cells,with a damaged plasma membraneand and high level of mitochondrial membrane potential.③1,2,3 and 4 were fresh sperm,Ⅰ,Ⅱ and 100 mmol/L trehalose groups,respectively.The same as below圖2 各組精子活率與線粒體膜電位Fig.2 Viability and mitochondrial membrane potential of sperm in each group

2.5 海藻糖替代部分甘油對(duì)凍融延邊黃牛精子膜脂質(zhì)組織紊亂的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與新鮮精子相比，凍融后活精子和死精子的高度膜脂質(zhì)紊亂比例均顯著升高(P<0.05)；與Ⅰ組相比，Ⅱ組的活精子高度膜脂質(zhì)紊亂比例顯著升高，死精子的高度膜脂質(zhì)紊亂比例顯著下降(P<0.05)；100 mmol/L海藻糖組活精子的高度膜脂質(zhì)紊亂比例顯著低于Ⅱ組，死精子總比例顯著低于Ⅰ和Ⅱ組(P<0.05)(圖3、表3)。

Q1，低度膜脂質(zhì)紊亂的死精子；Q2，高度膜脂質(zhì)組織紊亂的死精子；Q3，低度膜脂質(zhì)紊亂的活精子；Q4，高度膜脂質(zhì)紊亂的活精子Q1,Dead sperm with low level of membrane lipid disorder;Q2,Dead sperm with high level of membrane lipid disorder;Q3,Live sperm with low level of membrane lipid disorder;Q4,Live sperm with high level of membrane lipid disorder圖3 各組精子膜脂質(zhì)紊亂水平Fig.3 Lipid disturbance of frozen-thawed sperm membrane in each group

表3 各組精子膜脂質(zhì)紊亂水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.6 海藻糖替代部分甘油對(duì)凍融延邊黃牛精子DNA完整性的影響

精子魚精蛋白染色結(jié)果顯示，與新鮮精子相比，Ⅰ、Ⅱ組和100 mmol/L海藻糖組凍融精子的魚精蛋白缺失率顯著升高(P<0.05)；凍融組中，與Ⅰ組相比，Ⅱ組和100 mmol/L海藻糖組精子的魚精蛋白缺失率顯著降低(P<0.05)(圖4)。

①A，魚精蛋白染色；B，魚精蛋白缺失率統(tǒng)計(jì)。②α，DNA不完整的精子；β，正常精子①A,Protamine staining;B,Statistics of protamine deletion rate.②α,Sperm with incomplete DNA;β,Normal sperm圖4 凍融精子的魚精蛋白缺失檢測(cè)(200×)Fig.4 Protamine deficiency detection of frozen-thawed sperm (200×)

3 討 論

精子超低溫保存對(duì)于高遺傳價(jià)值動(dòng)物的生產(chǎn)和保存以及遺傳物質(zhì)向后代的傳遞具有重要意義。目前，甘油是最常用的低溫保護(hù)劑，然而高濃度甘油在超低溫保存過程中具有毒性作用[15]。Pena等[4]研究了在豬精液冷凍保護(hù)液中添加不同濃度甘油(3%、5%和8%)對(duì)凍融后精子的DNA損傷和運(yùn)動(dòng)性能的影響，發(fā)現(xiàn)8%甘油增加了精子DNA損傷。因此，如何降低冷凍保護(hù)劑中甘油濃度，減少冷凍保存對(duì)精子的損傷尤為重要。

糖可用于精子的低溫保存，并作為滲透壓調(diào)節(jié)器及能源、細(xì)胞冰晶形成的減速劑和低溫保護(hù)劑。海藻糖是一種雙糖，其首先與膜磷脂相互作用，為膜抗冷凍損傷提供了更多的穩(wěn)定性；其次，與細(xì)胞外冰晶結(jié)合，阻止冰晶在細(xì)胞內(nèi)的形成。Bucak等[16]報(bào)道，海藻糖在公羊精液液體外儲(chǔ)存過程中達(dá)到了最高的保護(hù)效果。眾所周知，由于低溫保存過程中眾多因素的影響，解凍后精子的運(yùn)動(dòng)性和活力不及新鮮精液[17]。低溫保存過程中的冷休克和氧化應(yīng)激會(huì)對(duì)精子的結(jié)構(gòu)造成低溫?fù)p傷，尤其是精子的質(zhì)膜和頂體。已有報(bào)道顯示，通過補(bǔ)充海藻糖來降低冷凍保護(hù)劑中甘油的濃度具有有益作用[18-19]。本試驗(yàn)通過降低甘油的濃度，補(bǔ)充不同濃度的海藻糖冷凍延邊黃牛精子得到了相似的結(jié)果，冷凍解凍后精子活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整性均有所改善，尤其是添加100和150 mmol/L海藻糖組。說明本試驗(yàn)通過補(bǔ)充海藻糖達(dá)到降低甘油濃度的目的，提高了精子冷凍保存的效率。

精子獲能對(duì)成功受精和受精卵的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[20]。蛋白質(zhì)磷酸化是一種翻譯后修飾，已有證據(jù)充分證明獲能似乎與精子蛋白的酪氨酸磷酸化有關(guān)，并且通過鈣內(nèi)流介導(dǎo)[21]。 在本試驗(yàn)中,將6%甘油對(duì)照組和凍融組(3%甘油+0、100 mmol/L海藻糖)冷凍精液解凍，結(jié)果表明與6%甘油對(duì)照組相比，添加100 mmol/L海藻糖組精子蛋白的酪氨酸磷酸化蛋白條帶數(shù)量較多。證明海藻糖可提高精子酪氨酸磷酸化水平，從而影響精子的獲能狀態(tài)。

冷凍造成的精子細(xì)胞損傷包括：過度脫水、精子結(jié)構(gòu)的有害變化、形態(tài)學(xué)改變、質(zhì)膜和頂體帽損傷、線粒體損傷、細(xì)胞凋亡及精子DNA斷裂[22-23]。研究表明，線粒體呼吸過程中產(chǎn)生的能量主要用于精子的運(yùn)動(dòng)和受精[24]。精子活力和生殖能力下降與線粒體功能受損(線粒體膜電位減少)之間存在著相關(guān)性。冷凍環(huán)境會(huì)凍結(jié)細(xì)胞內(nèi)的水分子，損害線粒體膜，引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)被破壞，以及DNA雙鏈的斷裂和DNA損傷[25-26]。研究證實(shí)，海藻糖能夠保護(hù)細(xì)胞的完整性，使其免受各種環(huán)境壓力的影響，如脫水、熱應(yīng)激、冷應(yīng)激和氧化應(yīng)激[27]。據(jù)報(bào)道，海藻糖添加到公羊精液冷凍保存液中，對(duì)解凍后精子活力、線粒體活性和頂體完整性均具有改善作用[28]。另有研究稱，海藻糖通過增加谷胱甘肽水平和降低脂質(zhì)過氧化物水平而具有間接的抗氧化作用[29]。已有研究表明，含有海藻糖的冷凍保存液改善了抗氧化作用，并減少了氧化對(duì)牛[30]、羊[31]精子低溫保存引起的應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，甘油濃度從6%降低到3%后，精子活率和線粒體膜電位水平均顯著下降，膜脂質(zhì)紊亂程度顯著升高，補(bǔ)充海藻糖后均得到了顯著改善。有報(bào)道表明，冷凍可導(dǎo)致牛[32]和豬[33]精子魚精蛋白缺乏，從而降低受精能力。 目前CMA3染色法是常見的評(píng)估精子中魚精蛋白缺乏癥的檢測(cè)方法。 本試驗(yàn)結(jié)果顯示，3%甘油+100 mmol/L海藻糖組精子的魚精蛋白缺乏水平顯著低于6%甘油對(duì)照組，表明海藻糖具有保護(hù)魚精蛋白DNA結(jié)構(gòu)的作用。

為了減少冷休克和氧化應(yīng)激對(duì)精子的損傷，需在精液冷凍前向稀釋液中添加各種冷凍保護(hù)劑。因此，本研究通過降低甘油濃度并補(bǔ)充海藻糖，以減少甘油的毒性，從而可以提高公牛精子的冷凍保存效率。 結(jié)果顯示，與6%甘油對(duì)照組相比，3%甘油+100 mmol/L海藻糖組精子的獲能狀態(tài)、活率和線粒體膜電位、精子的膜脂質(zhì)紊亂水平以及DNA完整性均得到顯著改善，表明海藻糖替代冷凍液中的一部分甘油，可以改善延邊黃牛凍融精子的質(zhì)量。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在冷凍保護(hù)劑中將甘油濃度從6%降低到3%并補(bǔ)充100 mmol/L海藻糖可以顯著改善精子的活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整性、獲能狀態(tài)、活率和線粒體膜電位水平、膜脂質(zhì)紊亂水平以及DNA完整性。海藻糖的替代減少了甘油的毒性，為冷凍精子提供了更好的保護(hù)作用。