李玲玉，鄭海英，陳明棠，唐麗萍，尚江華，楊春艷

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水牛遺傳與繁育技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530001)

在過(guò)去的10年中，水牛作為一種乳肉兼用的經(jīng)濟(jì)型家畜受到了越來(lái)越多的關(guān)注，尤其是奶水牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展使水牛的開(kāi)發(fā)和利用邁入了一個(gè)新階段。然而，水牛繁殖周期長(zhǎng)、繁育率普遍較低，嚴(yán)重制約了水牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。近年來(lái)，科學(xué)家們嘗試使用不同的輔助生殖技術(shù)(ART)提高水牛的繁殖效率，包括性別控制、活體采卵(OPU)、體外受精(IVF)、體外胚胎生產(chǎn)(IVEP)、體細(xì)胞核移植(SCNT)和徒手克隆[1-4]等技術(shù)。其中，SCNT可充分利用豐富的沼澤型水牛卵巢，其卵母細(xì)胞可作為核移植的受體，采集并培養(yǎng)具有優(yōu)良遺傳基因的河流型水牛體細(xì)胞作為核移植的供體，在短期內(nèi)可生產(chǎn)大量的優(yōu)秀河流型水牛[4]。

在家畜上，關(guān)于屠宰場(chǎng)(SLH)和活體采卵來(lái)源卵母細(xì)胞體外受精及體外胚胎生產(chǎn)結(jié)果并不完全一致。水?；铙w采卵-體外受精胚胎的囊胚率顯著高于屠宰場(chǎng)卵巢-體外受精胚胎，但其分裂率無(wú)顯著差異[5]，黃?；铙w采卵-體外受精胚胎的囊胚率顯著低于屠宰場(chǎng)卵巢組[6]。對(duì)山羊的研究發(fā)現(xiàn)，活體采卵和屠宰場(chǎng)來(lái)源卵母細(xì)胞不影響其體外成熟率、受精胚胎的分裂率及囊胚率[7]。此外，在體外胚胎生產(chǎn)研究中發(fā)現(xiàn)，囊胚中的E-鈣黏蛋白(E-cadherin)可介導(dǎo)細(xì)胞黏著和胞外信號(hào)到胞質(zhì)的傳遞，且作為一種依賴Ca2+的細(xì)胞黏連糖蛋白，在早期胚胎發(fā)育過(guò)程的細(xì)胞識(shí)別、遷移和組織分化中具有關(guān)鍵作用[8]，常被用以預(yù)測(cè)早期胚胎發(fā)育。而轉(zhuǎn)錄因子Sox2是胚胎發(fā)育的先鋒因子，在早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中表達(dá)，因此Sox2標(biāo)志著早期胚胎發(fā)育的發(fā)生[9]。目前，SCNT的受體卵母細(xì)胞主要來(lái)源為屠宰場(chǎng)卵巢，多為淘汰的低繁殖性能或高齡母水牛，其卵母細(xì)胞質(zhì)量較差，而活體采卵技術(shù)可反復(fù)從適齡的良種河流型水牛體內(nèi)得到優(yōu)質(zhì)的卵母細(xì)胞用于SCNT[10]。本實(shí)驗(yàn)室已通過(guò)SCNT技術(shù)先后培育了30余頭克隆水牛[11-12]。然而，與屠宰場(chǎng)來(lái)源卵巢相比，通過(guò)活體采卵技術(shù)獲得的卵母細(xì)胞數(shù)量有限，在一定程度上會(huì)限制SCNT的應(yīng)用。因此，本研究擬將屠宰場(chǎng)卵巢和活體采卵來(lái)源的卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)后用于SCNT，比較SCNT重構(gòu)胚的融合率、分裂率、囊胚率及胚胎發(fā)育潛能相關(guān)蛋白E-cadherin和Sox2的表達(dá)水平，以探明卵母細(xì)胞來(lái)源對(duì)SCNT重構(gòu)胚發(fā)育能力及發(fā)育潛能關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

TCM199、牛血清白蛋白(BSA)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和胎牛血清(FBS)均購(gòu)自Gibco公司；卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、丙酮酸鈉、半胱氨酸、細(xì)胞松弛素B等均購(gòu)自Sigma公司；35 mm培養(yǎng)皿、載玻片及蓋玻片等耗材均購(gòu)自Thermo Fisher公司；兔源E-cadherin(ab16505)、鼠源Sox2(ab97959)一抗及Hochest 33342購(gòu)自Abcam公司；山羊抗兔IgG H&L、山羊抗鼠IgG H&L二抗均購(gòu)自Bioworld公司。試驗(yàn)需用的主要儀器包括超聲波活體采卵儀(2100，TOKYO公司)、集卵杯(CCA-200，富士平公司)、體視顯微鏡(DM750，萊卡公司)、紡錘體觀察儀(CRI，Nikon公司)、倒置顯微鏡(TE200-S，Nikon公司)、電融合儀(ECM-2001，BTX公司)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Heracell VIOS V160i，Thermo公司)、激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1，Nikon公司)。

1.2 卵母細(xì)胞的采集

試驗(yàn)共分為2組，分別為活體采卵組(OPU組)和屠宰場(chǎng)卵巢組(SLH組)。OPU組所用10頭非泌乳期尼里-拉菲水牛供體來(lái)自廣西水牛研究所種畜場(chǎng)，年齡、營(yíng)養(yǎng)狀況和飼養(yǎng)條件一致，年齡(6.40±0.65)歲，體重(602.0±80.0)kg。利用B超或內(nèi)窺鏡監(jiān)測(cè)并穿刺水牛卵巢上的可見(jiàn)卵泡，進(jìn)行活體采卵，具體操作參照Liang等[13]所述方法。SLH組所用屠宰場(chǎng)尼里-拉菲水牛卵巢來(lái)自廣西南寧屠宰場(chǎng)，當(dāng)天宰殺取得的新鮮卵巢置于37 ℃生理鹽水中保存，2～3 h運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用連接有10 mL注射器的17號(hào)針頭抽吸所有3～8 mm卵泡，收集的卵泡液在體視顯微鏡下挑選包裹3層以上卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)。

1.3 SCNT重構(gòu)胚的構(gòu)建

1.3.1 卵母細(xì)胞體外成熟 挑選包裹2層及以上卵丘細(xì)胞的COCs，每10～20枚COCs放入覆蓋石蠟油的40 μL體外成熟培養(yǎng)液(TCM199+10% FBS+5 μg/mL FSH+10 μg/mL LH+0.2 mmol/L丙酮酸鈉+1 μg/mL E2+50 μmol/L半胱氨酸+25 ng/mL EGF)微滴中，38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)22～24 h。卵母細(xì)胞成熟以排出第一極體為標(biāo)志。

成熟率(%)=排出第一極體卵母細(xì)胞數(shù)/入孵總卵母細(xì)胞數(shù)×100%

1.3.2 供體細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的水牛耳纖維細(xì)胞，37 ℃水浴解凍后，加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM+10% FBS)混勻，2 500 r/min離心5 min，細(xì)胞沉淀用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，接種至40 μL微滴中繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h換液。待細(xì)胞長(zhǎng)至40%～50%，更換為含0.5% FBS的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行血清饑餓處理3～5 d，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，1 500 r/min離心5 min收集細(xì)胞用于SCNT。

1.3.3 重構(gòu)胚的融合和激活 COCs成熟后，用移液槍反復(fù)吹吸去除COCs周圍的卵丘細(xì)胞。挑選具有第一極體的卵母細(xì)胞并將其移入去核液(TCM199+10% FBS+7.5 μg/mL細(xì)胞松弛素B)中，利用紡錘體觀測(cè)儀進(jìn)行精確去核，然后沿著去核時(shí)留下的透明帶切口將單個(gè)供體細(xì)胞注入卵母細(xì)胞的卵周間隙，使之與卵母細(xì)胞緊密接觸，獲得SCNT重構(gòu)胚。將SCNT重構(gòu)胚移至融合液(250 mmol/L山梨醇+0.1 mmol/L醋酸鈣+0.5 mmol/L醋酸鎂+0.5 mmol/L HEPES+0.1% BSA)中清洗2次后，轉(zhuǎn)入含融合液的1 mm3融合槽內(nèi)，撥動(dòng)重構(gòu)胚使卵母細(xì)胞與體細(xì)胞的接觸面與電流方向垂直，施加2次電脈沖(1 kV/cm，10 μs)進(jìn)行電融合。電融合后，將重構(gòu)胚移入胚胎培養(yǎng)液(TCM199+10% FBS)中，在38.5 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，體視顯微鏡下觀察卵周隙，未見(jiàn)體細(xì)胞則視為融合成功。

融合后的重構(gòu)胚用5 μmol/L離子霉素激活處理5 min，然后用2 mmol/L的二甲氨基嘌呤(dimethylaminopurine,6-DMAP)培養(yǎng)3～4 h。激活的重構(gòu)胚轉(zhuǎn)移到含有單層顆粒細(xì)胞的40 μL培養(yǎng)液微滴中，在38.5 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2 d換液1次，培養(yǎng)48 h，觀察并統(tǒng)計(jì)重構(gòu)胚的分裂率，5～8 d觀察并統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.4 E-cadherin和Sox2蛋白免疫熒光檢測(cè)

發(fā)育至7 d的SCNT重構(gòu)胚用PBS清洗3次，在室溫下于4%多聚甲醛溶液中固定30 min，PBST(含0.1% Tween-20的PBS)清洗3次，5 min/次，而后轉(zhuǎn)移到含有0.1% Triton X-100的滲透液中通透30 min，用PBST清洗后移入封閉液(PBST+5% BSA)中室溫封閉1 h，PBST清洗后轉(zhuǎn)移到一抗(E-cadherin 1∶250，Sox2 1∶200)中，陰性對(duì)照組不孵育一抗，置于濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜；PBST清洗后轉(zhuǎn)入二抗(山羊抗兔IgG H&L，1∶1 000，山羊抗鼠IgG H&L，1∶1 000)中室溫孵育2 h，PBST清洗后移入10 μg/mL的Hoechst 33342中進(jìn)行核復(fù)染15 min，PBST清洗后轉(zhuǎn)入玻片上少量的抗淬滅劑微滴中，用蓋玻片覆蓋固定，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。利用Image J v1.8.0軟件對(duì)其熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，用平均熒光強(qiáng)度半定量表征特異性蛋白E-cadherin及Sox2的表達(dá)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同來(lái)源卵母細(xì)胞體外成熟效果

由表1可知，OPU組卵母細(xì)胞體外成熟率顯著高于SLH組(P<0.05)。

表1 各組卵母細(xì)胞體外成熟率

2.2 不同來(lái)源卵母細(xì)胞對(duì)SCNT重構(gòu)胚發(fā)育潛能的影響

由表2、圖1可知，OPU組SCNT重構(gòu)胚的融合率和分裂率與SLH組相比差異均不顯著(P>0.05)，囊胚率顯著高于SLH組(P<0.05)。

表2 各組SCNT重構(gòu)胚的融合率、分裂率和囊胚率

圖1 各組SCNT重構(gòu)胚不同發(fā)育階段的狀態(tài)(200×)Fig.1 State of SCNT reconstructed embryos at different developmental stages in each group (200×)

2.3 不同來(lái)源卵母細(xì)胞SCNT胚胎E-cadherin和Sox2蛋白表達(dá)水平

由圖2可知，E-cadherin蛋白定位于細(xì)胞膜上，Sox2蛋白分布在細(xì)胞核膜及細(xì)胞質(zhì)中。由圖3可知，OPU組SCNT胚胎E-cadherin和Sox2蛋白的平均熒光強(qiáng)度均顯著高于SLH組(P<0.05)。

圖2 各組SCNT重構(gòu)胚E-cadherin及Sox2蛋白免疫熒光檢測(cè)(400×)Fig.2 Imunofluorescence detection of E-cadherin and Sox2 proteins of SCNT reconstructed embryos in each group (400×)

*,差異顯著(P<0.05)*,Significant difference (P<0.05)圖3 各組SCNT重構(gòu)胚E-cadherin及Sox2蛋白的平均熒光強(qiáng)度Fig.3 Mean fluorescence intensity of E-cadherin and Sox2 of SCNT reconstructed embryos in each group

3 討 論

體細(xì)胞核移植在科學(xué)研究和遺傳繁育應(yīng)用方面均具有重要意義，但目前體細(xì)胞克隆效率較低，其應(yīng)用受到了很大的限制。在體細(xì)胞核移植中，卵母細(xì)胞作為受體可以為供體核遺傳物質(zhì)的重編程提供材料，同時(shí)為胚胎的進(jìn)一步發(fā)育提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[14-15]，因此卵母細(xì)胞的質(zhì)量被認(rèn)為是影響SCNT效率的一個(gè)關(guān)鍵因素。有研究表明，利用活體采卵穿刺母牛卵泡獲得的卵母細(xì)胞，在體外成熟24 h的成熟率[16]、體外受精后的胚胎分裂率和囊胚率[17]均顯著高于屠宰場(chǎng)卵巢卵母細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，OPU組獲得的卵母細(xì)胞體外成熟率顯著高于SLH組，SCNT胚胎的囊胚率也顯著高于SLH組，此結(jié)果與黃牛不同來(lái)源卵母細(xì)胞的體外受精胚胎發(fā)育效率[8,17]相似。這可能是由于每周2次的活體采卵，致使卵巢卵泡發(fā)育波反復(fù)重置并增加了卵泡發(fā)生波的頻率[18-19]，使更多的原始卵泡發(fā)育成為成熟卵泡，且活體采集操作會(huì)在卵泡閉鎖前將卵母細(xì)胞吸出，減少了成熟卵泡的閉鎖，從而提升了活體采集卵母細(xì)胞的質(zhì)量。相比于活體牛卵巢的繁殖性能狀態(tài)，屠宰場(chǎng)的水牛多為淘汰母牛，卵巢繁殖性能相對(duì)低下，且卵巢處于的卵泡發(fā)生波階段不定，導(dǎo)致活體采集卵母細(xì)胞的質(zhì)量高于屠宰場(chǎng)來(lái)源卵母細(xì)胞，從而影響之后的胚胎發(fā)育能力。

本研究利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了不同來(lái)源卵母細(xì)胞SCNT胚胎的E-cadherin和Sox2蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)OPU組SCNT胚胎中的E-cadherin和Sox2表達(dá)水平均高于SLH組SCNT胚胎。E-cadherin蛋白是一種黏附連接蛋白，在細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附連接、緊實(shí)連接及細(xì)胞核形成中起著關(guān)鍵作用[20-21]，且可以作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)劑，維持細(xì)胞及胚腔結(jié)構(gòu)的完整性[22]。有研究表明，健康囊胚中E-cadherin蛋白大量表達(dá)，其低表達(dá)水平會(huì)導(dǎo)致胚胎在致密化過(guò)程中產(chǎn)生極性，抑制胚胎細(xì)胞的分化，從而引起胚胎發(fā)育能力低下，甚至發(fā)育停滯[22-23]。Sox2蛋白是胚胎發(fā)育的先鋒轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)維持胚胎干細(xì)胞(ES)多能狀態(tài)起關(guān)鍵作用[12]。在哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，Sox2轉(zhuǎn)錄因子是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的形成標(biāo)志[12,24]，也是早期胚胎發(fā)育發(fā)生的標(biāo)志。前人的研究發(fā)現(xiàn)，Sox2定位于細(xì)胞核中，在胚胎發(fā)育的2-細(xì)胞期合子基因組中表達(dá)，且桑椹胚期和囊胚期之間的表達(dá)顯著增加[25]。利用基因編輯手段全身性敲除Sox2會(huì)致死胚胎[12]，條件性敲除Sox2會(huì)影響胚胎干細(xì)胞的特性，同時(shí)抑制了胚胎干細(xì)胞的增殖[26]，而在減數(shù)分裂的卵母細(xì)胞中敲除Sox2，并不會(huì)影響卵母細(xì)胞的形成[27]，說(shuō)明Sox2對(duì)于卵母細(xì)胞成熟不是必需的，但在控制早期胚胎發(fā)育及誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞的多能分化中具有重要功能。本研究中OPU組SCNT胚胎的Sox2蛋白表達(dá)量高，進(jìn)一步提示了OPU與屠宰場(chǎng)組SCNT重構(gòu)胚的發(fā)育能力差異可能與其胚胎多能性分化能力相關(guān)。

本研究中OPU組SCNT重構(gòu)胚的E-cadherin及Sox2蛋白表達(dá)均顯著高于SLH組SCNT胚胎，表明OPU組SCNT重構(gòu)胚細(xì)胞間具有更強(qiáng)的黏附能力和胚胎完整性，且高表達(dá)的Sox2蛋白可能上調(diào)了SCNT胚胎的干細(xì)胞向神經(jīng)或生殖細(xì)胞方向分化，滋養(yǎng)層細(xì)胞分化后分泌合成更多的促生長(zhǎng)發(fā)育因子，繼而促進(jìn)SCNT胚胎發(fā)育，但具體的信號(hào)傳導(dǎo)通路仍需要進(jìn)一步研究探討。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，OPU組卵母細(xì)胞的體外成熟效率顯著高于SLH組的卵母細(xì)胞，OPU組SCNT重構(gòu)胚E-cadherin和Sox2蛋白的表達(dá)水平顯著高于SLH組SCNT重構(gòu)胚，初步揭示了SLH組SCNT效率低下的原因。 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步解釋了屠宰場(chǎng)來(lái)源水牛卵母細(xì)胞SCNT重構(gòu)胚低發(fā)育潛能的原因，也為研究活體和屠宰場(chǎng)卵巢來(lái)源卵母細(xì)胞SCNT重構(gòu)胚的后續(xù)發(fā)育潛力及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)提供理論基礎(chǔ)。