李曉霞，肖紅衛(wèi)，曹平華，徐志謙，張 芳，張志陽，荊鵬華，禹學禮，栗穎華

(1.河南科技大學動物科技學院，洛陽 471023；2.動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064)

哺乳動物卵母細胞超低溫冷凍保存對于維持珍稀或瀕危動物的遺傳多樣性和促進優(yōu)良品種育種具有重要意義[1]，同時也為輔助生殖技術(shù)和不孕癥治療產(chǎn)生重大影響[2]。卵母細胞冷凍大多以減數(shù)分裂Ⅱ(MⅡ)期為研究對象，但從理論上推測，處于生發(fā)泡(GV)和減數(shù)分裂Ⅰ(MⅠ)期的未成熟卵母細胞更適于冷凍[3-4]。因為MⅡ期卵母細胞冷凍易造成紡錘體、染色體的紊亂和錯位，而未成熟卵母細胞冷凍可避免紡錘體的損傷[3]。目前，未成熟卵母細胞冷凍效果仍遠遠低于MⅡ期卵母細胞，因此，冷凍技術(shù)方法亟待突破。相較于慢速冷凍技術(shù)，玻璃化冷凍技術(shù)對卵母細胞的損傷更小[5]，是一種簡單、快速、高效、低成本和低風險的技術(shù)[6]。玻璃化是基于含有高濃度冷凍保護劑的玻璃化溶液與液氮直接接觸后凝固而不形成冰晶。冷凍保護劑是一種能夠減少細胞在冷凍和解凍過程中損傷的化學物質(zhì)，然而，由于滲透作用和化學毒性，它可能會影響卵母細胞的結(jié)構(gòu)和發(fā)育能力[7-8]。目前，常通過加入無毒的冷凍保護劑(如糖)來減少冷凍造成的損傷[9]。

糖在玻璃化過程中能夠阻礙滲透性休克，保護和穩(wěn)定細胞膜蛋白，并提高細胞內(nèi)冷凍保護劑達到玻璃化狀態(tài)的能力[10]。海藻糖已被證明在穩(wěn)定冷凍和干燥細胞方面特別有效[11]。海藻糖是一種自然產(chǎn)生的雙糖，在各種應(yīng)激條件下具有保護細胞的作用，如氧化損傷[12]、脫水[13]和溫度變化[14]。這些特性表明海藻糖可能適合作為體外培養(yǎng)基的補充。研究表明，在卵母細胞和胚胎的玻璃化冷凍或解凍液中添加海藻糖可提高超低溫保存后的存活率和胚胎發(fā)育能力[15-16]。海藻糖作為冷凍保護劑曾被用于不同物種卵母細胞的低溫保存，如人[3]、牛[15]、豬[17]和羊[18]。線粒體是參與細胞代謝和凋亡的重要細胞器，在卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育中起著重要作用[19]，研究不同濃度海藻糖對玻璃化冷凍牛卵母細胞活性線粒體分布的影響具有重要意義。本研究在玻璃化冷凍液和解凍液中分別添加不同濃度海藻糖，探討海藻糖對牛未成熟卵母細胞玻璃化冷凍-解凍后的形態(tài)正常率、活性線粒體分布和體外成熟率的影響，以期為將海藻糖用于提高冷凍卵母細胞的發(fā)育能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TCM-199購自Gibco公司；胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)均購自杭州四季青生物工程有限公司；促卵泡素(FSH)、促黃體素(LH)均購自中國科學院動物研究所；其他試劑除特別注明外均購自Sigma公司。

冷凍基礎(chǔ)液(HM)：TCM-199+20% FBS。

卵母細胞玻璃化冷凍液(VS)：VS1：80% HM+10% (V/V) EG+10% (V/V) DMSO;VS2：60% HM+20% (V/V) EG+20% (V/V) DMSO+0.5 mol/L蔗糖或不同濃度的海藻糖(0.25、0.5和1 mol/L)。

卵母細胞解凍液(WM)：WM1：HM+0.5 mol/L蔗糖或不同濃度的海藻糖(0.25、0.5和1 mol/L);WM2：HM+0.25 mol/L蔗糖或不同濃度的海藻糖(0.125、0.25和0.5 mol/L);體外成熟培養(yǎng)液：TCM199+100 μmol/L半胱氨酸+0.5 μg/mL FSH+5 μg/mL LH+5% FBS。

1.2 卵母細胞采集

從洛陽周邊屠宰場收集牛卵巢,置于35 ℃含有青霉素、鏈霉素的生理鹽水中，于6 h內(nèi)運送回實驗室，再用生理鹽水洗滌3次備用。用帶有12號針頭的10 mL一次性注射器抽吸卵巢表面直徑為2～8 mm卵泡，除去蜘蛛網(wǎng)狀卵、透明帶變形卵和裸卵，余下的卵母細胞用于玻璃化冷凍。

1.3 卵母細胞OPS玻璃化冷凍和解凍

1.3.1 卵母細胞的冷凍 玻璃化冷凍所需冷凍液提前15 min在39 ℃加熱板上預(yù)熱。首先，將牛未成熟卵母細胞在HM液中洗滌3遍后移入VS1中平衡1 min后，再分別移入含有0.5 mol/L蔗糖或海藻糖(0.25、0.5和1 mol/L)的10 μL VS2微滴中，然后快速地將卵母細胞移入1.5 μL VS2微滴中，立即用OPS管細端輕觸液滴，通過虹吸作用將卵母細胞連同VS2液一起吸入OPS管細端(每管裝入5～8枚卵母細胞)，隨后立即浸入液氮中保存。卵母細胞與VS2液吸入OPS管后被投入液氮，整個過程不超過30 s。

1.3.2 卵母細胞的解凍 卵母細胞解凍的操作在39 ℃加熱板上進行。解凍時，將OPS細管從液氮罐中取出，在空氣中停留3 s后直接將OPS管細端分別浸入預(yù)熱好的含0.5 mol/L蔗糖或海藻糖(0.25、0.5和1 mol/L)的1 mL WM1液中，用手指封住OPS管粗端，使細管內(nèi)空氣受熱膨脹，卵母細胞即可排出到WM1液中，停留5 min。隨后，將卵母細胞分別移入含有0.25 mol/L蔗糖或海藻糖(0.125、0.25和0.5 mol/L)的100 μL WM2液滴中，停留5 min；然后將卵母細胞相繼移入2個100 μL HM液滴中，均停留5 min。解凍后的卵母細胞可用于形態(tài)評估、活性線粒體分布檢測和體外成熟培養(yǎng)。

1.4 卵母細胞的形態(tài)評估

牛未成熟卵母細胞在冷凍、解凍液中添加0.5 mol/L蔗糖或0.25、0.5和1 mol/L海藻糖經(jīng)冷凍-解凍后，與新鮮組一同進行形態(tài)評估。未冷凍組即新鮮組及解凍后的卵母細胞依據(jù)卵丘細胞包裹度、膜完整性和胞質(zhì)顏色等指標評估其形態(tài)正常率。形態(tài)正常卵母細胞至少有3層致密卵丘細胞包裹，形狀呈球形、對稱，胞質(zhì)均勻光亮，透明帶完整光滑，無明顯細胞溶解、細胞膜損傷、膨脹、空泡形成、退化或細胞內(nèi)容物泄露等現(xiàn)象；形態(tài)異常卵母細胞會出現(xiàn)透明帶破裂或不完整，細胞質(zhì)顏色偏暗、松散、不均勻，卵周隙的有無、大小等現(xiàn)象。

1.5 卵母細胞活性線粒體分布檢測

用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1,Beyotime)檢測未冷凍新鮮組和解凍后牛卵母細胞的活性線粒體分布情況，每組重復(fù)3次，每次卵母細胞數(shù)量不少于20枚。具體操作如下：將卵母細胞置于含0.5% BSA的PBS溶液中，用200 μL移液槍輕輕吹掉卵母細胞周圍的卵丘細胞后經(jīng)0.5% BSA的PBS溶液洗滌2遍;將洗滌后卵母細胞放入50 μL PBS液(含0.5% BSA)+ 50 μL JC-1染色液組成的微滴中避光37 ℃孵育30 min;將卵母細胞在JC-1染色緩沖液中洗滌2遍后置于載玻片預(yù)先用記號筆畫好的小圓圈中心位，然后在圓圈邊緣線上涂少量凡士林后輕輕蓋上蓋玻片，以免造成卵母細胞的破損；將制好的載玻片置于熒光顯微鏡綠光(發(fā)射波長580～610 nm)和藍光(發(fā)射波長510～520 nm)下,觀察卵母細胞的活性線粒體分布。

1.6 卵母細胞的體外成熟及核成熟評估

經(jīng)形態(tài)評估正常的卵母細胞在預(yù)先平衡的體外成熟液中洗滌2～3遍，隨即放入覆蓋石蠟油的成熟液微滴(50 μL/滴)中，每滴25～30枚卵母細胞，最后置于39 ℃、5% CO2和100%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。體外成熟培養(yǎng)24 h后，放入預(yù)平衡后的體外成熟液中，然后加入0.1%透明質(zhì)酸酶去掉其周圍的卵丘細胞，即可在體視顯微鏡下觀察卵周隙內(nèi)是否有第一極體(PB1)排出，排出第一極體則為核成熟的卵母細胞。記錄后統(tǒng)計卵母細胞的核成熟率。

核成熟率(%)=排出第一極體卵母細胞數(shù)/入孵總卵母細胞數(shù)×100%

1.7 統(tǒng)計分析

用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差(One-Way ANOVA)分析，用Duncan氏法進行多重比較。結(jié)果用平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 海藻糖對OPS法冷凍保存牛未成熟卵母細胞形態(tài)的影響

由表1可知，冷凍、解凍液中添加0.5 mol/L海藻糖冷凍-解凍后的形態(tài)正常率顯著高于0.25、1 mol/L海藻糖組(P<0.05)，且后兩組間也存在顯著差異(P<0.05)；0.5 mol/L海藻糖組的形態(tài)正常率也顯著高于0.5 mol/L蔗糖組(P<0.05)，且0.5 mol/L蔗糖組與1 mol/L海藻糖組差異不顯著(P>0.05)；但各冷凍組的卵母細胞形態(tài)正常率均顯著低于新鮮組(P<0.05)。

表1 各組牛未成熟卵母細胞玻璃化冷凍后形態(tài)正常率

2.2 海藻糖對OPS法冷凍保存牛未成熟卵母細胞活性線粒體分布的影響

線粒體活性檢測結(jié)果表明：新鮮牛未成熟卵母細胞的活性線粒體均勻地分布在細胞質(zhì)中，呈現(xiàn)出強烈的熒光(圖1A、1a)，其中在熒光顯微鏡藍光下呈現(xiàn)強的黃綠色熒光；0.5 mol/L海藻糖組卵母細胞的活性線粒體集中分布在細胞膜內(nèi)側(cè)區(qū)域且分布區(qū)域明顯少于新鮮組，在綠光和藍光下分別呈現(xiàn)強的紅色熒光和黃綠色熒光(圖1D、1d)；0.25 mol/L海藻糖組(圖1C、1c)卵母細胞的活性線粒體分布區(qū)域、熒光強度均明顯低于0.5 mol/L海藻糖組，其中藍光下呈現(xiàn)的熒光顏色由新鮮和0.5 mol/L海藻糖組的黃綠色變成了綠色并呈現(xiàn)不連續(xù)的散點分布；而0.5 mol/L蔗糖組(圖1B、1b)和1 mol/L海藻糖組(圖1E、1e)卵母細胞活性線粒體分布區(qū)域極少、甚至無線粒體活性，藍光下觀察其熒光顏色則由0.25 mol/L海藻糖組的綠色變成了暗綠色，熒光強度均弱于0.25 mol/L海藻糖組。

①A～E，在熒光顯微鏡綠光下觀察活性線粒體的分布；a～e，在熒光顯微鏡藍光下觀察活性線粒體的分布。②A、a，新鮮組；B、b，0.5 mol/L蔗糖組；C、c，0.25 mol/L海藻糖組；D、d，0.5 mol/L海藻糖組；E、e，1 mol/L海藻糖組。③箭頭所示為活性線粒體分布區(qū)域①A-E,The active mitochondrial distribution was tested by excited green light of fluorescence;a-e,The active mitochondrial distribution was tested by excited blue light of fluorescence.②A and a,Fresh group;B and b,0.5 mol/L sucrose group;C and c,0.25 mol/L TRH group;D and d,0.5 mol/L TRH group;E and e,1 mol/L TRH group.③The arrows indicate the distribution area of active mitochondria圖1 各組牛未成熟卵母細胞玻璃化冷凍后活性線粒體分布(200×)Fig.1 The distribution of active mitochondrial of bovine immature oocytes after vitrification in different group (200×)

2.3 海藻糖對OPS法冷凍保存牛未成熟卵母細胞體外成熟的影響

牛未成熟卵母細胞冷凍-解凍后，體外成熟培養(yǎng)24 h成熟率結(jié)果表明，冷凍、解凍液中添加0.5 mol/L海藻糖冷凍-解凍后卵母細胞的體外成熟率顯著高于0.25和1 mol/L海藻糖組(P<0.05)，且后兩組間無顯著差異(P>0.05);0.5 mol/L海藻糖組的成熟率也顯著高于0.5 mol/L蔗糖組(P<0.05)，且后者與1 mol/L海藻糖組差異不顯著(P>0.05);但各冷凍組的卵母細胞體外成熟率均顯著低于新鮮組(P<0.05)(表2)。

表2 各組牛未成熟卵母細胞玻璃化冷凍后體外成熟率

3 討 論

建立一種高效的家畜卵母細胞超低溫保存方法對畜牧業(yè)具有重要意義[20]。OPS玻璃化冷凍可增加冷凍降溫和解凍升溫的速率，極大程度上改善細胞冷凍-解凍后的發(fā)育能力和妊娠率[21-22]，是目前冷凍牛卵母細胞最有效的方法之一。冷凍保護劑組成及濃度是影響OPS玻璃化冷凍效率的關(guān)鍵因素。海藻糖作為一種非滲透性冷凍保護劑，可通過降低在玻璃化過程中達到玻璃化狀態(tài)所需的濃度來降低滲透性冷凍保護劑可能產(chǎn)生的毒性作用，并減少在OPS玻璃化冷凍和解凍過程中細胞的損傷[16]。

海藻糖的低溫保護作用是由于這種雙糖優(yōu)良的玻璃形成特性[23]，以及其在低溫下的低結(jié)晶傾向[24]和玻璃態(tài)的高穩(wěn)定性。本研究用不同濃度海藻糖或蔗糖玻璃化冷凍-解凍牛未成熟卵母細胞發(fā)現(xiàn)，0.25和0.5 mol/L海藻糖組的細胞形態(tài)正常率均顯著高于0.5 mol/L蔗糖和1 mol/L海藻糖組，且0.5 mol/L海藻糖組效果最佳。Fakhrildin等[18]在未成熟綿羊卵母細胞冷凍和解凍液中添加0.25 和0.5 mol/L海藻糖進行玻璃化冷凍-解凍發(fā)現(xiàn)，與用0.25 mol/L海藻糖玻璃化處理的結(jié)果相比，用0.5 mol/L海藻糖玻璃化處理后可明顯提高未成熟綿羊卵母細胞的活力和形態(tài)正常率。Sanaei等[16]將成熟的綿羊卵母細胞分別置于含不同濃度海藻糖的冷凍液中進行玻璃化冷凍處理后，0.5 mol/L海藻糖組的卵母細胞活力顯著高于其他冷凍組，卻明顯低于未冷凍新鮮組。對牛卵母細胞的冷凍也得到了相似的結(jié)果，Arav等[25]用含0.25、0.5和1 mol/L海藻糖或蔗糖冷凍液玻璃化冷凍牛未成熟卵母細胞后發(fā)現(xiàn)，海藻糖降低冷凍對細胞損傷的效果優(yōu)于蔗糖，且0.25 mol/L海藻糖組卵母細胞受精率最高。以上研究結(jié)果說明，玻璃化冷凍過程中使用不同濃度的海藻糖會影響玻璃化冷凍的效果，且海藻糖作為冷凍保護劑比蔗糖更有效和安全[26]。低溫保存過程中，卵母細胞的細胞質(zhì)膜是受冷凍損傷的主要部位。海藻糖在膜穩(wěn)定方面的作用優(yōu)于其他糖，也是最有效的糖，在干燥過程中可以穩(wěn)定脂質(zhì)體，對保存干燥和冷凍生物材料有其獨特的作用[27]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.5 mol/L海藻糖組未成熟卵母細胞經(jīng)玻璃化冷凍-解凍后的形態(tài)正常率顯著高于0.5 mol/L蔗糖組，說明了海藻糖作為冷凍保護劑的有效性。但目前海藻糖在牛卵母細胞冷凍后對其形態(tài)評估的相關(guān)報道還較少，本研究結(jié)果可為其廣泛應(yīng)用提供理論參考。

許多研究表明，玻璃化會導(dǎo)致線粒體功能障礙[28]和線粒體分布異常[29]。線粒體是參與多種細胞活動的重要細胞器[30]，包括能量供應(yīng)、胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和細胞器遷移等[31]。因此，線粒體的損傷或線粒體分布的改變可能會導(dǎo)致減數(shù)分裂和有絲分裂紡錘體的缺陷，并抑制卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育[32]。小鼠MⅡ期卵母細胞玻璃化冷凍后線粒體活性和線粒體極性分布率比新鮮組明顯降低[33]?；钚跃€粒體的數(shù)量在玻璃化冷凍和新鮮的牛成熟卵母細胞間存在顯著差異變化[34]。Abe等[35]也得到了相似的結(jié)果，他們利用透射電子顯微鏡觀察在含有蔗糖的冷凍液中對牛未成熟卵母細胞進行一步或逐步玻璃化冷凍后，逐步玻璃化冷凍組的超微結(jié)構(gòu)與新鮮組類似且細胞器畸變率低；而一步玻璃化冷凍組的大多數(shù)卵母細胞具有多空泡的細胞質(zhì)和膜破裂的線粒體，冷凍效果明顯低于逐步冷凍組和未冷凍新鮮組。這些研究結(jié)果說明玻璃化冷凍會造成線粒體功能的變化，而這種變化可能是由于玻璃化冷凍卵母細胞會增加活性氧(ROS)的水平，造成氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激與卵母細胞線粒體損傷有關(guān)，它會改變線粒體膜電位和結(jié)構(gòu)，使ATP產(chǎn)量減少，進而影響卵母細胞的成熟[36]。海藻糖作為低溫保護劑，除了能幫助生物分子維持玻璃空間結(jié)構(gòu)[37]及結(jié)合蛋白質(zhì)表面周圍的水分子外[38],還具有潛在的抵抗?jié)B透應(yīng)激、缺氧和氧化應(yīng)激的能力[39]。本研究結(jié)果也證實了海藻糖的這一特性，在冷凍液中添加0.5 mol/L海藻糖經(jīng)玻璃化冷凍-解凍處理后的牛未成熟卵母細胞活性線粒體分布區(qū)域明顯高于0.5 mol/L蔗糖組和0.25和1 mol/L海藻糖組，但各處理組均低于未冷凍新鮮組，說明海藻糖在玻璃化冷凍-解凍過程中可能減少了卵母細胞ROS的產(chǎn)生，從而提高卵母細胞的線粒體活性和體外成熟能力。

目前，細胞外糖作為冷凍保護劑為超快速玻璃化提供了一種新的前景。細胞外糖的作用是吸收細胞內(nèi)的水。細胞外糖、非滲透性和滲透性冷凍保護劑的結(jié)合可以防止冰晶體形成對細胞產(chǎn)生的損害[40]。海藻糖在預(yù)防低溫損傷[41]和穩(wěn)定水介質(zhì)中細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能完整性方面具有重要作用[42]，糖的穩(wěn)定作用一般與生物分子在雙層膜中的特定相互作用有關(guān)[16]。本研究嘗試在牛未成熟卵母細胞的OPS玻璃化冷凍和解凍液中添加海藻糖，與其他冷凍組相比，添加0.5 mol/L海藻糖均可顯著提高冷凍-解凍后牛未成熟卵母細胞的體外成熟率，但卻顯著低于未冷凍新鮮組。Park等[15]將牛未成熟卵母細胞經(jīng)逐步冷凍(先放入含0.1 mol/L海藻糖或蔗糖冷凍液中3 min，后放入含0.25 mol/L海藻糖或蔗糖冷凍液中1 min)后，比較海藻糖、蔗糖對冷凍后發(fā)育到MⅡ 期比率及受精后卵裂率和囊胚率的影響，發(fā)現(xiàn)海藻糖與蔗糖組發(fā)育到MⅡ期的比率無顯著變化，但海藻糖組的卵裂率和囊胚率均明顯高于蔗糖組。說明海藻糖和蔗糖在低溫保存前對未成熟的牛卵母細胞沒有毒性，且海藻糖在卵母細胞低溫保存的成功率優(yōu)于蔗糖[26]。Martins等[43]研究表明，牛未成熟卵母細胞在含1 mol/L海藻糖或蔗糖冷凍液中經(jīng)玻璃化冷凍后，兩者發(fā)育到MⅡ期的比率均顯著低于未冷凍的新鮮組，這與本研究結(jié)果一致。而牛未成熟卵母細胞在含40% EG、20%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和0.3 mol/L海藻糖的冷凍液中經(jīng)玻璃化冷凍-解凍后，卵母細胞的體外成熟率與新鮮組無明顯差異[44]。這些結(jié)果的不同可能是由于物種、低溫保存的載體或滲透性或非滲透性冷凍保護劑類型和濃度的不同造成的[16]，這些因素均會影響卵母細胞的玻璃化冷凍效果。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，0.5 mol/L海藻糖可顯著提高牛未成熟卵母細胞玻璃化冷凍-解凍后的形態(tài)正常率和體外成熟率，增加活性線粒體分布區(qū)域及其熒光強度，其效果優(yōu)于目前常用的冷凍保護劑蔗糖，可為優(yōu)化未成熟卵母細胞玻璃化冷凍保存體系、提高玻璃化冷凍后卵母細胞的發(fā)育潛能提供參考。