趙玉強(qiáng)，陳 鑫，李清春，馬繼林，董銀河，汪德明，郭凌云，黃 濤

(1.烏魯木齊正大畜牧有限公司博士后科研工作站，烏魯木齊 830000；2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000)

烯醇化酶(enolase,ENO)，又稱為磷酸丙酮酸脫氫酶，是一種金屬酶，負(fù)責(zé)催化糖酵解途徑中磷酸烯醇丙酮酸和2-磷酸甘油酸的相互轉(zhuǎn)化[1]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中ENO存在3種亞型：α或非神經(jīng)元性烯醇化酶(NNE，ENO1)、γ或神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE，ENO2)和β或肌肉特異性烯醇化酶(MSE，ENO3)，它們是參與糖酵解或異生的細(xì)胞質(zhì)酶[2]。ENO1在許多組織中都有表達(dá)，ENO2只在神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞中表達(dá)，而ENO3定位于肌肉組織[3]。豬ENO3基因(Gene ID：692156)位于12號(hào)染色體上[4]，含有12個(gè)外顯子。Fougerousse等[5]研究表明，ENO3在增殖的成肌細(xì)胞和分化的肌管中表達(dá)，是人肌源性分化的最早標(biāo)志物之一。在肌管的功能成熟階段，ENO3的數(shù)量增加[6]；ENO3缺乏會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)端糖酵解代謝性肌病[7]，提示ENO3可能參與調(diào)控肌肉的生長(zhǎng)過(guò)程。Wu等[8]研究表明，ENO3基因的表達(dá)量在梅山豬和大白豬之間存在差異，且ENO3基因多態(tài)性與豬脂肪率、平均背膘厚、大理石紋及肌內(nèi)脂肪有關(guān)。以上研究提示，ENO3基因可能與肌肉的生成及豬的生長(zhǎng)有關(guān)。目前，ENO3基因多態(tài)性與大白豬生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)以大白豬為研究對(duì)象，應(yīng)用混池PCR擴(kuò)增目的區(qū)段，通過(guò)CE測(cè)序挖掘多態(tài)位點(diǎn)，結(jié)合GenoPlexs分型技術(shù)辨別試驗(yàn)個(gè)體的基因型，并與試驗(yàn)群體的校正體重達(dá)100 kg時(shí)的日齡、日增重、背膘厚、眼肌面積、眼肌厚共5個(gè)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，挖掘與生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，以期為大白豬的分子標(biāo)記輔助選育提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從新疆某公司下屬的種豬場(chǎng)選取316頭生長(zhǎng)表現(xiàn)正常且表型記錄完整的經(jīng)產(chǎn)大白母豬，用耳缺鉗收集大白母豬的耳緣組織于裝有1 mL 75%酒精的1.5 mL離心管中，母豬耳標(biāo)號(hào)與離心管編號(hào)依次對(duì)應(yīng)記錄，低溫運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

瓊脂糖購(gòu)自Biowest公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。梯度PCR儀購(gòu)自SensoQuest公司；電泳儀(DDY-8C型)購(gòu)自北京六一生物科技公司；NanoDrop 2000型超微量分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.3 基因組DNA提取

用眼科剪在離心管中剪碎耳組織，按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)操作步驟提取DNA，分別用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)進(jìn)行DNA完整性、濃度和純度檢驗(yàn)，選擇條帶完整、明亮且濃度、純度均符合要求的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載豬ENO3基因全長(zhǎng)序列(登錄號(hào)：NC_010454.4)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增ENO3基因的各個(gè)外顯子及其附近區(qū)域，引物序列見(jiàn)表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.5 混池建庫(kù)與PCR測(cè)序

從試驗(yàn)群體DNA樣本中隨機(jī)選取40個(gè)樣本，每個(gè)樣本用移液器各取5 μL至同一個(gè)1.5 mL無(wú)菌離心管中，輕微振蕩混勻，利用表1引物對(duì)混合DNA樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系10 μL：2×EsTaqMasterMix(Dye) 5 μL，去離子水2 μL，Primer Mix(10 μmol/L) 1 μL，DNA模板 2 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火(退火溫度見(jiàn)表1)30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定合格后將引物和混合DNA樣本送至生工生物工程(上海)股份有限公司，利用ABI測(cè)序儀進(jìn)行CE測(cè)序，利用Chromas DNA分析軟件篩選多態(tài)位點(diǎn)。

1.6 GenoPlexs分型

篩選出基因多態(tài)位點(diǎn)后，利用多重PCR的靶向基因捕獲技術(shù)(GenoPlexs)對(duì)每個(gè)個(gè)體的目標(biāo)SNP及其附近區(qū)域設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增富集目的片段，結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行高深度測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)目標(biāo)個(gè)體進(jìn)行基因分型[9]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

在育種場(chǎng)測(cè)定并記錄316頭大白豬的表型信息：結(jié)測(cè)日齡、結(jié)測(cè)體重、結(jié)測(cè)背膘厚、結(jié)測(cè)眼肌面積和結(jié)測(cè)眼肌厚。利用電子過(guò)道秤測(cè)定活體體重，待讀數(shù)穩(wěn)定后記錄數(shù)值；利用B超儀測(cè)定大白豬正常站立情況下倒數(shù)3-4肋間左側(cè)距背中線5 cm處的活體背膘、眼肌厚及眼肌面積，參照《種豬生產(chǎn)性能測(cè)定規(guī)程》(NY/T 822-2004)計(jì)算以上表型的校正數(shù)據(jù)。利用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD進(jìn)行多重比較，分析各SNP位點(diǎn)與大白豬體重達(dá)100 kg時(shí)的日齡、日增重、背膘厚、眼肌面積和眼肌厚的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

對(duì)大白豬ENO3基因外顯子1～10進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示，7對(duì)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶長(zhǎng)度分別為675、801、499、633、420、684和706 bp(圖1)，均符合預(yù)期大小，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1～7，ENO3基因外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M，DL5000 DNA Marker1-7，PCR amplification products of ENO3 gene exons;M，DL5000 DNA Marker圖1 ENO3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of ENO3 gene

2.2 突變位點(diǎn)測(cè)序峰圖

由圖2可知，通過(guò)混池PCR直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)9個(gè)SNPs位點(diǎn)，均為已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)含子突變位點(diǎn)，分別為：rs325279236(A/G)、rs342598032(A/G)、rs341541240(C/T)、rs329283992(G/C)、rs327882211(G/A)、rs345530479(G/C)、rs324943047(T/C)、rs786427749(A/-)和rs196953768(A/G)。其中rs196953768、rs324943047、rs327882211、rs341541240、rs325279236、rs342598032為轉(zhuǎn)換；rs345530479和rs329283992為顛換；rs786427749為缺失。

rs325279236、rs342598032、rs341541240、rs327882211和rs324943047是由反向測(cè)序獲得，其余位點(diǎn)均是由正向測(cè)序獲得rs325279236，rs342598032，rs341541240，rs327882211 and rs324943047 were obtained by reverse sequencing,and the remaining sites were obtained by forward sequencing圖2 ENO3基因突變位點(diǎn)測(cè)序峰圖Fig.2 Sequencing peak map of mutation sites of ENO3 gene

2.3 分型結(jié)果及群體遺傳學(xué)分析

送樣個(gè)體中有2個(gè)樣本由于嚴(yán)重降解導(dǎo)致分型失敗，其余樣本分型成功，基因分型結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，9個(gè)SNPs位點(diǎn)中，rs196953768、rs324943047、rs345530479、rs329283992、rs342598032和rs786427749的優(yōu)勢(shì)基因型分別為AG、TC、GC、GC、AG和A/-，均為雜合型，rs327882211、rs341541240和rs325279236位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型分別為GG、CC和AA，均為純合型；9個(gè)SNPs位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。ENO3基因遺傳多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，rs196953768、rs324943047、rs345530479、rs329283992和rs342598032位點(diǎn)雜合度較高，rs786427749、rs327882211、rs341541240和rs325279236位點(diǎn)純合度較高；多態(tài)信息含量(PIC)均屬于中度多態(tài)，說(shuō)明這些位點(diǎn)所受到的選擇壓力較小，可用作候選分子標(biāo)記。

表2 ENO3基因的基因型頻率及基因頻率

表3 ENO3基因遺傳多樣性分析

2.4 連鎖不平衡分析

由圖3可知，rs196953768與rs324943047、rs345530479、rs329283992間完全連鎖(D’=1，r2=1)，與rs342598032呈強(qiáng)連鎖(D’=1,r2=0.99)；rs327882211與rs341541240、rs325279236呈強(qiáng)連鎖(D’=1,r2>0.7)，其余多態(tài)位點(diǎn)間呈弱連鎖。

淺灰色表示D’<0.3；灰色表示0.3≤D’<0.6；深灰色表示0.6≤D’<1；黑色表示D’=1；數(shù)字表示r2值的小數(shù)點(diǎn)后兩位，不顯示數(shù)字表示完全連鎖(r2=1，D’=1)Light gray indicates D’<0.3；Gray means 0.3≤D’<0.6；Dark grey indicates 0.6≤D’<1；Black indicates D’=1；And a number indicates the r2 value to two decimal places，no number indicates full linkage (r2=1，D’=1)圖3 ENO3基因SNP連鎖分析Fig.3 SNP linkage analysis of ENO3 gene

2.5 ENO3基因多態(tài)性與大白豬生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表4可知，rs196953768位點(diǎn)GG基因型個(gè)體體重達(dá)100 kg時(shí)的日齡顯著小于AG基因型(P<0.05)，日增重顯著高于AG基因型(P<0.05)，其余性狀各基因型間差異均不顯著(P>0.05)；rs327882211位點(diǎn)AA基因型個(gè)體體重達(dá)100 kg時(shí)的眼肌面積和眼肌厚均顯著小于GA和GG基因型(P<0.05)，其余性狀各基因型間差異均不顯著(P>0.05)；rs341541240位點(diǎn)CC基因型個(gè)體體重達(dá)100 kg時(shí)的眼肌面積和眼肌厚均顯著高于TT基因型(P<0.05)，其余性狀各基因型間差異均不顯著(P>0.05)；rs325279236位點(diǎn)AA基因型個(gè)體體重達(dá)100 kg時(shí)的眼肌面積顯著高于GG基因型(P<0.05)，其余性狀各基因型間差異均不顯著(P>0.05)；rs786427749、rs342598032位點(diǎn)各性狀在各基因型間差異均不顯著(P>0.05)。

表4 ENO3基因SNPs與大白豬生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

生豬育種在中國(guó)的發(fā)展相對(duì)較晚，雖然近年來(lái)逐漸受到重視，但仍有待完善。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，動(dòng)物育種技術(shù)已進(jìn)入分子水平，分子育種技術(shù)對(duì)豬的育種和生產(chǎn)產(chǎn)生了巨大影響[10]，其中，分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合常規(guī)育種方法加速了遺傳改良進(jìn)程[11]。因此，挖掘與性狀相關(guān)的SNPs作為輔助選擇的分子標(biāo)記位點(diǎn)，對(duì)提高生豬養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益、增強(qiáng)中國(guó)育種能力有著重要意義。多重PCR靶向捕獲技術(shù)是在單一PCR反應(yīng)體系中加入2對(duì)或2對(duì)以上引物，用于富集目的片段，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑盒操作過(guò)程與一般PCR相同[9]，且MPprimer[12]、MultiPLX[13]等軟件均可用于多重PCR引物的設(shè)計(jì)。同時(shí)結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)對(duì)富集到的目的片段構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，上機(jī)進(jìn)行深度測(cè)序[14]，用以獲得高質(zhì)量的目的序列。通過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)控、過(guò)濾及質(zhì)量評(píng)估，比對(duì)到參考基因組，對(duì)目標(biāo)區(qū)域序列進(jìn)行基因組定位和功能注釋，分析SNP、InDel后對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確分型。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是支持針對(duì)任一位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，其特異性、測(cè)序深度及覆蓋度均較高，能夠明顯提高效率，降低經(jīng)濟(jì)成本[15]。本試驗(yàn)中獲得了較好的基因分型結(jié)果，送測(cè)316個(gè)樣本，成功檢測(cè)314個(gè)樣本，多態(tài)位點(diǎn)檢出率為99.37%，充分說(shuō)明了該技術(shù)的可靠性。

ENO3基因在豬肌肉發(fā)育不同階段存在明顯的表達(dá)差異，但其多態(tài)性對(duì)豬生長(zhǎng)性狀的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。 ENO3定位于肌肉組織，α-烯醇化酶在肌肉發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)換成β-烯醇化酶[16]。在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，橫紋肌分化伴隨著β-烯醇化酶的增加和α-烯醇化酶的減少[5,17]。提示ENO3基因可能參與調(diào)控肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ENO3基因存在9個(gè)SNPs位點(diǎn)，均符合Hardy-Weinberg平衡定律，處于中度多態(tài)，且與大白豬生長(zhǎng)性狀有一定的關(guān)聯(lián)。

生物群體中，由于2個(gè)位點(diǎn)在染色體上的距離足夠近，導(dǎo)致這些位點(diǎn)上的等位基因經(jīng)常出現(xiàn)在同一染色體上，使得遺傳時(shí)位點(diǎn)上的等位基因出現(xiàn)非隨機(jī)組合的現(xiàn)象，就是連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)，又稱基因的連鎖遺傳[18]。位點(diǎn)間的距離與LD程度呈明顯的負(fù)相關(guān)，即距離越近，LD程度越高。SNP的連鎖性在遺傳中普遍存在，彭婭鑫等[19]、李常紅等[20]研究均發(fā)現(xiàn)存在完全連鎖或強(qiáng)連鎖的SNP。本試驗(yàn)中，rs196953768與rs324943047、rs345530479、rs329283992間完全連鎖(D’=1，r2=1)，與rs342598032呈強(qiáng)連鎖，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，rs342598032位點(diǎn)SNP與其余SNPs間沒(méi)有完全連鎖，可能是由于測(cè)序錯(cuò)誤造成該位點(diǎn)判定的基因型與真實(shí)基因型產(chǎn)生偏離，也可能是由于該位點(diǎn)與其余位點(diǎn)距離較遠(yuǎn)使得LD程度降低。

Li等[21]通過(guò)分析豬編碼基因區(qū)公共SNP發(fā)現(xiàn)，豬ENO3基因BV726865_302位點(diǎn)與剪切力呈顯著相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，人ENO3基因的2個(gè)錯(cuò)義突變與一種罕見(jiàn)的代謝性肌病有關(guān)[22]；ENO3蛋白與綿茵安瓊奶牛的肌肉嫩度和大理石紋密切相關(guān)[23]；ENO3的轉(zhuǎn)錄及蛋白水平在瘦肉型豬和脂肪型豬間存在顯著差異[8,24-25]。上述研究均提示，ENO3基因可能對(duì)動(dòng)物骨骼肌的發(fā)育有著重要的影響。本研究通過(guò)對(duì)大白豬ENO3基因的9個(gè)SNPs位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，rs196953768、rs324943047、rs345530479、rs329283992與體重達(dá)100 kg時(shí)的日齡和日增重呈顯著相關(guān)，rs327882211、rs341541240與體重達(dá)100 kg時(shí)的眼肌面積和眼肌厚呈顯著相關(guān)，rs325279236與體重達(dá)100 kg時(shí)的眼肌面積呈顯著相關(guān)，說(shuō)明這些位點(diǎn)均可作為對(duì)應(yīng)性狀的候選分子輔助標(biāo)記。而rs786427749和rs342598032與上述表型的相關(guān)性均不顯著，可能不是影響這些性狀的重要標(biāo)記，不適用于本試驗(yàn)大白豬群體生長(zhǎng)性狀選育。綜上所述，ENO3基因多態(tài)性顯著影響大白豬部分生長(zhǎng)性狀，但這些位點(diǎn)能否作為大白豬生長(zhǎng)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，還需要在更多、更大的群體中驗(yàn)證；同時(shí)，還需要從ENO3基因的功能及其SNP的作用機(jī)制出發(fā)加以驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究共鑒定到9個(gè)SNPs，其中rs196953768與rs324943047、rs345530479、rs329283992完全連鎖，與大白豬體重達(dá)100 kg時(shí)的日齡和日增重均呈顯著相關(guān)，rs327882211、rs341541240與大白豬體重達(dá)100 kg時(shí)的眼肌面積和眼肌厚均呈顯著相關(guān)，rs325279236與大白豬體重達(dá)100 kg時(shí)的眼肌面積呈顯著相關(guān)；共篩選到7個(gè)與生產(chǎn)性狀顯著相關(guān)的SNPs，可為大白豬的分子標(biāo)記輔助選育提供數(shù)據(jù)支撐。