安曉羽，郝 偉，孫利婷，楊丹妮，常 悅，趙 婷，李 康，李喻瞳，張智精，楊慧娣

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第三臨床學院，呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第一臨床學院，呼和浩特 010110；4.湖北中醫(yī)藥高等?？茖W校，荊州 434020)

肥胖是一種在世界范圍內(nèi)發(fā)生率很高的疾病，它與許多代謝性疾病有關，如Ⅱ型糖尿病和非酒精性脂肪肝[1]。肥胖是由于能量平衡態(tài)(能量的攝入與能量消耗)的失衡，從而導致脂肪在身體不同區(qū)域的過度積累。肝臟脂肪積累過多會導致脂肪變性，其特征是肝細胞中甘油三酯(TG)的積累。此外，肝臟新生的脂肪也會產(chǎn)生TG，這個過程由轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(SREBP-1c)。新生的脂肪增多可使脂肪肝和肥胖的發(fā)生率增加3倍[1-2]。

腺苷激活蛋白激酶(AMPK)是一種內(nèi)源性和中樞的代謝傳感器，脂肪細胞中的AMPK對維持線粒體完整性和對熱應激的反應以及改善非酒精性脂肪肝至關重要[3]。在白色脂肪組織中，磷酸化的AMPK通過調(diào)節(jié)新生脂肪和脂肪酸氧化的關鍵代謝酶來改變細胞的代謝狀態(tài)，這些酶包括乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)[3-4]。最近，有證據(jù)證明，AMPK在調(diào)節(jié)棕色和米色脂肪組織的代謝活性中發(fā)揮著重要作用，棕色和米色脂肪可以增加細胞的產(chǎn)熱，是預防肥胖發(fā)生的靶細胞[3,5]。在大鼠中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，中藥桑葉激活AMPK通路后，腹股溝脂肪的幾種棕色脂肪細胞標記基因解偶聯(lián)蛋白-1(UCP1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)、PPARα和PR結(jié)構(gòu)域蛋白16(Prdm16)表達均被上調(diào)[5]。但有關AMPK對肝臟脂肪細胞褐色化的作用還不清楚。

應用飲食中的化合物來減少體重和體脂的增加正成為一種預防肥胖的新方法。以前的研究發(fā)現(xiàn)，ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3 PUFAs)是減少肥胖誘導代謝綜合征的有效飲食成分之一[6]。如在嚙齒動物中，ω-3 PUFAs激活脂肪酸的β-氧化，調(diào)節(jié)脂肪生成相關酶的活性，上調(diào)相關基因氧化磷酸化的表達。同時，ω-3 PUFAs參與各種線粒體的生化過程[7-10],特別是二十二碳六烯酸(DHA)能刺激線粒體基因的表達、激活脂肪酸氧化的關鍵酶肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A(CPT1A)和抑制脂肪酸合成基因的表達[9]。研究發(fā)現(xiàn)，飼喂DHA后，C57BL/6小鼠內(nèi)臟脂肪的UCP1、PGC-1α、PPARγ和Prdm16 mRNA的表達被激活[7]。然而，大多數(shù)的研究都聚焦于DHA對白色脂肪組織代謝的異常，但是，DHA對肝臟脂質(zhì)代謝異常的機制還不清楚。 本試驗通過給C57BL/6小鼠飼喂高脂飼糧或高脂飼糧添加不同劑量的DHA，利用實時熒光定量PCR和Western blotting等方法，研究DHA在高脂飼糧誘導的體脂增加對肝臟脂質(zhì)代謝的作用及調(diào)節(jié)機制，為進一步理解DHA對高脂飼糧誘導的肝臟脂質(zhì)紊亂的預防作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 32只雄性SPF級C57BL/6小鼠，體重14～16 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【許可證號：SCXK(京)2016-0006】，飼養(yǎng)在內(nèi)蒙古大學實驗動物中心【許可證號：SYXK(蒙)2014-0002】。在溫度為(23±1)℃，光照為12L∶12D (Light∶Dark,12 h∶12 h)的動物房內(nèi)飼養(yǎng)。動物進行單籠(30 cm×15 cm×20 cm)飼養(yǎng)適應1周，自由取食和飲水。所有操作遵循內(nèi)蒙古醫(yī)科大學動物使用相關倫理要求【YKD201901028】，在內(nèi)蒙古大學省部共建國家重點實驗室完成。

1.1.2 試驗動物飼糧 脂肪普通飼糧(D12450K)：100 g飼糧中含2 g豬油、2.5 g大豆油、20 g蛋白質(zhì)、70 g碳水化合物，復合維生素和復合礦物質(zhì)共5.5 g；高脂飼糧(D12451)：100 g飼糧中含20.68 g豬油、2.91 g大豆油、20 g蛋白質(zhì)、50.91 g碳水化合物，復合維生素和復合礦物質(zhì)共5.5 g。兩種飼糧均購自Research Diets公司。

1.1.3 主要試劑 TGELISA檢測試劑盒(YS-H5445)購自上海研生實業(yè)有限公司；脂聯(lián)素ELISA檢測試劑盒(JL23094)購自上海江萊生物科技有限公司；RNAiso Plus Total試劑盒(9109)和PrimeScript RT Reagent試劑盒(3733)均購自TaKaRa公司；一抗兔抗α-tubulin抗體(F2168)、兔抗AMPK抗體(SAB4502329)、兔抗p-AMPK抗體(pThr172,SAB4503754)、兔抗pACC抗體(Ser79,07-303)、兔抗AKT抗體(SAB4500797)、兔抗p-AKT(pSer 473,SAB4504331)抗體均購自Sigma公司；二抗羊抗兔IgG(ab6721)購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組及處理 試驗共分為4組：飼喂普通飼糧的對照組(Con)，飼喂高脂飼糧的模型組(Model)及在高脂飼糧中添加0.2 g DHA(DHAL)和1.0 g DHA(DHAH)組，試驗周期為20周。第21周眼眶取血后，頸椎脫臼處死動物取肝臟。

1.2.2 體重和攝食量測定 每天上午08：00-09：00用電子天平稱量動物的體重(精確到0.1 g)。食物攝入采用食物平衡法測定。試驗開始時稱量動物體重，定時、定量放入足夠的飼料。3 d后于相同時間稱量食物重量。 用電子天平稱食物重量(精確到0.001 g)。72 h平均攝食量=(提供的食物重量-剩余食物重量)/3。

1.2.3 體脂含量測定 動物的胴體(不包含胃、小腸和盲腸等器官)在60 ℃烘箱內(nèi)烘干后，用索氏抽提法(Soxhlet)測定體脂含量。 將取出內(nèi)臟各器官和消化道后(保留消化道上的脂肪)的動物尸體稱重，作為胴體鮮重，然后置于烘箱中60 ℃烘干至恒重，稱重，作為胴體干重。將烘干后的動物胴體剪成小塊，用粉碎機磨碎后充分混勻，稱取1～2 g樣品，作為樣品重，包于濾紙包內(nèi)(提前1 d烘干濾紙)，用棉線將其系緊，然后稱重，作為抽提前樣總重；然后放入抽提筒內(nèi)。樣品脂肪的抽提用福斯脂肪抽提儀(Soxtex Avanti 2050，F(xiàn)oss公司)。詳細操作步驟參照說明書。將抽提完畢的樣品置于烘箱中(60 ℃)烘至恒重，作為抽提后樣品總重。體脂重量的計算公式如下：

體脂重量(g)=胴體干重(g)×[(抽前樣總重-抽后樣總重)/樣品重]

1.2.4 肝臟中TG、脂聯(lián)素含量測定 按照ELISA試劑盒說明書測定肝臟中TG和脂聯(lián)素含量。采用分光光度計讀數(shù)，根據(jù)標準曲線換算成樣品TG和脂聯(lián)素的濃度。TG的含量以mmol/L表示，脂聯(lián)素含量以ng/mL表示。

1.2.5 實時熒光定量PCR 用RNAiso Plus Total試劑盒提取肝臟的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用PrimeScript RT Reagent試劑盒進行實時熒光定量PCR擴增。 根據(jù)GenBank中登錄的PPARα、CPT-1A、ACOX、PPARγ等基因的序列信息，利用Primer Premier 5.0軟件設計各基因PCR特異性引物(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系、擴增條件和計算均參照Sheng等[5]方法進行。

表1 引物信息

1.2.6 Western blotting 取肝臟組織0.2 g，研磨，直至粉末狀，加入1 mL蛋白裂解液和PMSF的混合液，震蕩混勻，裂解30 min，然后4 ℃、12 000 r/min離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液至1.5 mL離心管，-80 ℃保存。用BCA蛋白定量分析試劑盒測定蛋白樣品濃度。將肝臟組織蛋白樣品進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，加一抗(α-tubulin 1∶4 000，AMPK 1∶1 000，p-AMPK 1∶1 000，pACC 1∶1 000，AKT1∶1 000，p-AKT1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；加二抗(1∶10 000)，常溫孵育2 h。利用Supersignal West Pico化學底物顯影，在Invitrogen iBright CL750凝膠成像分析系統(tǒng)下拍照，用Image LabTM Software(Bio-Rab Laboratories)軟件分析條帶的灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)用Kolmogorov-Smirnov and Levene tests檢測數(shù)據(jù)的齊性和正態(tài)分布，然后用SPSS 22.0進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，用LSD法進行組間比較分析。結(jié)果用平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 DHA對C57BL/6小鼠攝食量、終體重、體脂和TG的影響

由表2可知，各組間小鼠攝食量均沒有顯著差異。Model組小鼠終體重最重，顯著高于其他3組(P<0.05)，DHAL和DHAH組的終體重與Con組均無顯著差異(P>0.05)，且DHAL和DHAH組終體重也無顯著差異(P>0.05)。Model組小鼠體脂重量和肝臟TG含量均顯著高于其他3組(P<0.05)。DHAL和DHAH組體脂重量和肝臟TG含量均顯著低于Modle組(P<0.05)；DHAH組體脂重量和肝臟TG均顯著低于DHAL組(P>0.05)。

表2 各組小鼠攝食量、體重、體脂重量和TG含量

2.2 DHA對肝臟脂聯(lián)素含量的影響

由圖1可知，Model組肝臟脂聯(lián)素含量顯著低于Con組(P<0.05)；DHAL和DHAH 組的脂聯(lián)素濃度均顯著高于Model組(P<0.05)。DHAL組脂聯(lián)素的含量與Con組差異不顯著(P>0.05)，DHAH組脂聯(lián)素的含量顯著高于DHAL和Con組(P<0.05)。

肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖1 各組小鼠肝臟脂聯(lián)素含量Fig.1 Liver adiponectin content of mice in different groups

2.3 DHA對肝臟脂質(zhì)代謝相關基因的影響

2.3.1 新生脂肪合成關鍵酶SREBP-1c、FAS mRNA和p-ACC蛋白的表達 由圖2可知，SREBP-1c和FAS mRNA表達與p-ACC蛋白表達變化一致。與Con組相比，Model和DHAL組SREBP-1c和FAS mRNA表達(圖2A)及p-ACC蛋白表達(圖2B、2C)均顯著增加(P<0.05)。DHAH組SREBP-1c、FAS mRNA和p-ACC蛋白表達均低于DHAL組(P<0.05)，與Con組無顯著差異(P>0.05)(圖2A、2B和2C)。

圖2 各組小鼠肝臟SREBP-1c和FAS mRNA(A)及p-ACC蛋白(B、C)的表達Fig.2 The expression of liver SREBP-1c and FAS mRNA (A) and p-ACC protein (B and C) of mice in different groups

2.3.2 脂肪酸氧化關鍵基因PPARα、PPARγ、CPT-1A和ACOX的表達 由圖3可知，與Con組相比，Model、DHAL和DHAH組PPARα mRNA表達量均顯著降低(P<0.05)。DHAL和DHAH組PPARα mRNA表達量均顯著高于Model組(P<0.05)，DHAL和DHAH組間PPARα mRNA水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05)。各組PPARγ mRNA表達差異不顯著(P>0.05)。 CPT-1A和ACOX mRNA表達一致，Model組均顯著低于Con組(P<0.05)。DHAL和DHAH組均顯著高于Model組(P<0.05)，DHAH組顯著低于DHAL組(P<0.05)。

圖3 各組小鼠肝臟PPARα、PPARγ、CPT-1A和ACOX mRNA的表達Fig.3 The expression of liver PPARα,PPARγ,CPT-1A and ACOX mRNA of mice in different groups

2.3.3 肝臟線粒體基因PGC-1α及褐色脂肪化基因Prdm16和UCP1 mRNA的表達 由圖4可知，Model組PGC-1α mRNA表達量顯著低于Con組(P<0.05)，DHAL和DHAH組PGC-1α mRNA表達量均顯著高于Model和Con組(P<0.05)，且DHAH組PGC-1α mRNA表達量顯著高于DHAL組(P<0.05)。Model組Prdm16 mRNA表達與Con組沒有顯著差異(P>0.05)，DHAL和DHAH組Prdm16 mRNA表達量顯著高于Model和Con組(P<0.05)。Model組UCP1 mRNA表達量顯著低于Con組(P<0.05)，DHAL和DHAH組UCP1 mRNA表達量均顯著高于Model組(P<0.05)。DHAL和DHAH組Prdm16和UCP1 mRNA表達均無顯著差異(P>0.05)。

圖4 各組小鼠肝臟PGC-1α、Prdm16和UCP1 mRNA的表達Fig.4 The expression of liver PGC-1α,Prdm16 and UCP1 mRNA of mice in different groups

2.3.4 AMPK、p-AMPK、AKT和p-AKT蛋白的表達 由圖5可知，Model組p-AMPK/AMPK顯著低于Con組(P<0.05)，Model和DHAL組的p-AMPK/AMPK差異不顯著(P>0.05)，DHAH組p-AMPK/AMPK顯著高于Model和DHAL組(P<0.05)，p-AMPK/AMPK在DHAH與Con組間無顯著差異(P>0.05)(圖5A、5B)。與Con組相比，Model組p-AKT/AKT顯著降低(P<0.05)。與Model組相比，DHAL和DHAH組p-AKT/AKT均顯著升高(P<0.05)，p-AKT/AKT在DHAL與DHAH組間差異不顯著(P>0.05)(圖5C、5D)。

3 討 論

本試驗結(jié)果表明，DHA逆轉(zhuǎn)了高脂飼糧誘導的終體重、體脂和肝臟TG的增加；增加了肝臟脂聯(lián)素的濃度，具有劑量依賴性。DHA通過激活AMPK通路，抑制肝臟新生脂肪合成關鍵酶SREBP-1c、FAS mRNA和p-ACC蛋白表達，上調(diào)脂肪酸氧化的關鍵代謝基因PPARα、CPT-1A和ACOX的mRNA的表達，促進肝臟線粒體基因PGC-1α mRNA和褐色脂肪化基因Prdm16和UCP1 mRNA的表達，從而預防了高脂飼糧誘導的肝臟脂肪的積累。

過量食用高脂飼糧會導致肝臟脂肪積累，引起一系列肝臟的變化，包括單純的肝臟脂肪變性和炎癥等[8-9]。本試驗中，高脂飼糧導致C57BL/6小鼠的終體重、體脂重量和肝臟TG含量的增加，表明高脂飼糧可誘導肝臟脂肪的積聚。DHA可預防高脂飼糧誘導的終體重、體脂重量和肝臟TG含量增加，促進肝臟AMPK蛋白磷酸化，增加其下游基因PPARα、CPT-1A和ACOX的mRNA水平，表明AMPK及其下游基因可能是DHA在肝臟中的重要靶點。此外，一些研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素/AMPK信號通路的改變也可能對脂肪的積聚發(fā)揮重要的作用[10-11]。小鼠肝臟脂聯(lián)素/AMPK通路激活能減少高脂飼糧誘導的脂肪肝[12-14]和腎臟脂肪毒性[15]。本研究結(jié)果表明，DHAH組C57BL/6小鼠肝臟脂聯(lián)素的濃度顯著增加，DHA導致肝臟AMPK蛋白磷酸化升高，表明DHA預防高脂誘導的肝臟脂肪的積累可能通過脂聯(lián)素觸發(fā)AMPK通路實現(xiàn)。另有研究認為，小鼠飼喂補充DHA飼糧后脂聯(lián)素濃度增加是PPARγ上調(diào)所導致的[3]。但是，本研究中DHA對PPARγ的表達沒有顯著影響，而是上調(diào)了AMPK通路下游的PPARα mRNA的表達，且PPARα的下游靶基因CPT-1A和ACOXmRNA的表達也升高了，這進一步證明DHA通過上調(diào)肝臟PPARα而不是PPARγ的表達預防肝臟脂肪的積累，該結(jié)果與Yang等[6]給患有非酒精性脂肪肝的C57BL/6J小鼠飼喂DHA后，PPARα mRNA表達上升的研究結(jié)果一致。DHA是PPARα的天然配體，當DHA與PPARα結(jié)合后，可以促進脂肪酸代謝過程基因的表達[8，16-19]，可進一步支持DHA通過AMPK通路激活PPARα上調(diào)肝臟氧化的關鍵代謝基因的表達，加速肝臟脂肪酸氧化分解。此外，有證據(jù)表明，PPARα激活會抑制大鼠肝臟AKT的磷酸化[20]。但在本研究中，DHA激活了PPARα，也逆轉(zhuǎn)了高脂飼糧導致的肝臟pAKT/AKT表達的降低。因此，DHA是否通過PPARα調(diào)節(jié)AKT通路從而緩解肝臟脂肪積累還需要進一步研究。

SREBP-1c是激活脂肪酸和TG合成的首要基因[15-16]。 SREBP-1c信號增強與ACC和FAS mRNA表達上調(diào)有關[21]。作者發(fā)現(xiàn)，DHA降低了高脂飼糧誘導C57BL/6小鼠肝臟新生脂肪合成基因SREBP-1c和FASmRNA表達，且DHA的作用具有劑量依賴性。ACC是脂肪酸合成的限速酶[17]，本研究結(jié)果表明低劑量DHA促進了ACC蛋白磷酸化，而高劑量DHA降低了ACC蛋白磷酸化，這一結(jié)果暗示不同劑量的DHA對ACC蛋白磷酸化的作用不同，還需要進一步驗證。

UCP1是唯一只在棕色脂肪組織中表達的解偶聯(lián)蛋白質(zhì)，棕色脂肪組織通過大量表達UCP1引起線粒體氧化呼吸的電子傳遞和ATP產(chǎn)生解偶聯(lián)作用，降低脂肪酸氧化代謝的產(chǎn)能，使能量以熱量形式散失，從而抵御肥胖和相關疾病的發(fā)生[22-23]。許多研究都證明，肥胖的人群和小鼠白色脂肪的線粒體功能受損[23-24]。PGC-1α功能的改變可以導致線粒體功能障礙[23,25]。Prdm16是調(diào)節(jié)棕色脂肪細胞形成的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，是控制棕色和白色脂肪細胞特異基因表達程序的分子開關[24]。本研究結(jié)果表明，DHA增加了肝臟Prdm16 mRNA的表達，暗示肝臟中的白色脂肪細胞可能轉(zhuǎn)化為棕色脂肪細胞。此外，高脂飼糧導致肝臟UCP1 mRNA的表達下降，而DHA上調(diào)了UCP1 mRNA的表達，這也證明了DHA可以誘導肝臟白色脂肪細胞分化成棕色細胞，減少白色脂肪的含量。本研究結(jié)果還表明，DHA增加PPARα和PGC-1α mRNA的表達上調(diào)。PGC-1α的上調(diào)有利于其與PPARα結(jié)合，促進脂肪酸氧化酶的轉(zhuǎn)錄[8]，增強線粒體的呼吸活動，有利于增加能量的消耗。總之，這些數(shù)據(jù)表明，DHA可能激活肝臟PPARα-AMPK-PGC-1α信號通路，增強線粒體的功能，從而增加能量的消耗。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，DHA可降低高脂飼糧導致的C57BL/6小鼠終體重、體脂和TG含量的升高，增加肝臟脂聯(lián)素的水平；DHA可從2個方面預防高脂飼糧誘導的肝臟脂肪積累：首先，通過激活AMPK蛋白，上調(diào)PPARα mRNA表達，抑制ACC蛋白的磷酸化，抑制脂肪合成基因SREBP-1c和FASmRNA的表達，并促進脂肪酸氧化基因的表達;其次，通過增加肝臟UCP1、PGC-1α和Prdm16褐色基因的表達，促進肝臟脂肪白色細胞褐色化。