李 麗，朱 盼，郭興蘭，潘炳強，周敬凱，陳 俊

(廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西高校中藥藥理重點實驗室，南寧 530200)

肥胖是一種慢性疾病，也是Ⅱ型糖尿病、血脂異常癥、心血管疾病等發(fā)生的主要誘因，對人們的健康和生活質量造成嚴重威脅[1]。目前，市場上用于治療肥胖的化學合成藥雖然很多，但長期服用效果并不理想，而且存在嚴重的副作用，如頭疼、嘔吐、腸胃不適和血壓升高等。研究表明，許多中草藥植物提取精華和植物中活性成分可作為膳食補充劑干預肥胖[2]。近年來，富含多糖的植物的提取物用于降脂減肥作用的研究受到了廣泛關注[3-4]。地菍(別名地稔、鋪地稔)為野牡丹科植物地菍(MelastomadodecandrumLour.)的全草，植物資源豐富，是瑤醫(yī)的常用藥材之一[5-6]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，地菍具有降血糖、調(diào)血脂、抗氧化和保肝等多種藥理活性[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，地菍不同部位提取物對胰島素抵抗、鏈脲佐菌素(STZ)所致高血糖大鼠和小鼠模型(空腹血糖FBG>11.1 mmol/L)均有不同程度的降血糖和降血脂作用[8-14]，其中地菍粗多糖可降低STZ所致高血糖小鼠的血糖和血脂水平，提高小鼠的抗氧化能力[15]。地菍粗多糖還具有較強的自由基清除作用，并能抑制人紅細胞膜脂質過氧化[16]。乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是脂肪酸合成的關鍵限速酶，其表達上調(diào)會促進脂肪酸合成和脂肪積累，可作為肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪肝等慢性代謝疾病潛在的治療靶點[17-18]。目前鮮見關于地菍粗多糖對高脂飲食誘導肥胖小鼠干預作用的研究報道，本研究參考《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》的規(guī)定，在給予高脂、高糖食物誘發(fā)小鼠肥胖的同時用地菍粗多糖進行干預，檢測肥胖小鼠體重、血脂水平等生理生化指標變化及地菍粗多糖對肥胖小鼠體內(nèi)脂肪酸合成關鍵酶ACC1基因表達的影響，探究地菍粗多糖對肥胖發(fā)生的干預作用及其可能的作用機制，以期為地菍藥材的臨床應用提供試驗基礎和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 地菍粗多糖及飼料 地菍購自南寧小瑤王藥店，由廣西中醫(yī)藥大學藥學院藥用植物教研室鑒定為地菍干燥全草。本試驗所用的地菍粗多糖提取工藝如下：提取溶劑無水乙醇，固液比1∶3，加熱回流提取3次，過濾，得到藥渣揮發(fā)至無任何醇味備用。提取溶劑水，固液比1∶3，加熱回流提取3次，紗布過濾，得到水溶液，4 ℃、3 000 r/min離心15 min 后濃縮至藥與溶劑比為1∶1.5，在藥液中加入75%乙醇進行沉淀，靜置24 h后4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取沉淀水浴蒸干，獲得地菍粗多糖備用。普通維持飼料(粗脂肪≥4%)購自上海斯萊克實驗動物有限公司；高脂飼料參考《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》的規(guī)定由實驗室自行制作，配方為：蔗糖15%、豬油15%、蛋黃粉8%、膽固醇1%、膽酸鈉0.2%及普通維持飼料60.8%。

1.1.2 試驗動物 SPF級昆明種雄性小鼠，17～21 g，購自湖南斯萊克景實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2019-0004。

1.1.3 主要試劑及儀器 奧利司他膠囊購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司；羧甲基纖維素鈉購自天津市大茂化學試劑廠；無水乙醇、二甲苯、中性樹膠均購自國藥集團化學試劑有限公司；HE染液、分化液、返藍液與總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒購自普洛麥格生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒、SYBRTMGreen Master Mix均購自Thermo Fisher Scientific公司。TECAN全波長酶標儀(Infinite M200PRO)購自TECAN公司；冷凍低溫離心機(5430R)購自Eppendorf公司；電熱恒溫水浴鍋(HWS-26)購自上海齊欣科學儀器有限公司；脫水機(JJ-12J)、包埋機(JB-P5)均購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(RM2016)購自上海徠卡儀器有限公司；正置光學顯微鏡(Nikon Eclipse E100)、成像系統(tǒng)(Nikon DS-U3)均購自Nikon公司；實時熒光定量PCR儀(LightCycler96)購自Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組與處理 SPF級昆明種雄性小鼠72只，于(22±2)℃、30%～70%濕度的動物房適應性喂養(yǎng)3 d后，按照體重隨機分為6組：空白組、模型組、陽性組(奧利司他0.025 mg/g)、地菍粗多糖高、中、低劑量組(1.2、0.6、0.3 mg/g)。除空白組給予普通維持飼料外，其余各組均給予高脂飼料。造模時配合灌胃給與相應藥物，灌胃藥物為0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液配制而成，灌胃時間為每天晚上19：00。飼養(yǎng)期間各組小鼠均自由采食和飲水，每天統(tǒng)計小鼠的攝食量(每只鼠每天攝取食物的重量)。

1.2.2 樣本收集與處理 30 d后，各組小鼠禁食12 h，稱重，摘眼球采血，隨即頸椎脫臼處死。剝離腎臟及附睪周圍脂肪、肝臟，用冰冷的生理鹽水清洗表面血水后用吸水紙擦干，稱重，一部分用4%多聚甲醛溶液固定48 h，用于HE染色；一部分于-80 ℃保存。

1.2.3 小鼠體重、Lee’s指數(shù)測定 在試驗過程中，每3 d測1次小鼠體重；試驗結束后，測小鼠體長(鼻尖到肛門的長度)，計算Lee’s指數(shù)。

Lee’s指數(shù)=[體重(g)×103/體長(cm)]1/3

1.2.4 小鼠肝臟指數(shù)和脂肪指數(shù)的測定 將小鼠處死后，取肝臟及附睪和腎臟周圍的脂肪組織，稱量其濕重，并計算肝臟指數(shù)和脂肪指數(shù)。

肝臟指數(shù)(%)=肝濕重(g)/體重(g)×100%

脂肪指數(shù)(%)=脂肪濕重(g)/體重(g)×100%

1.2.5 生化指標檢測 采集的血樣于4 ℃、3 500 r/min離心10 min，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。按試劑盒說明書測定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C及肝臟TC、TG含量。

1.2.6 組織病理學觀察 取小鼠肝臟和脂肪組織，用4%多聚甲醛溶液固定48 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，顯微鏡下觀察組織病理學特征。

1.2.7 肝臟脂代謝相關基因表達水平的測定 用總RNA提取試劑盒提取小鼠肝臟總RNA，并測定RNA樣品濃度。按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，用于實時熒光定量PCR反應。 根據(jù)GenBank中小鼠ACC1(登錄號：NM_133360.2)、β-actin(登錄號：NM_007393.5)基因的mRNA序列，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物信息見表1。引物均由上海捷瑞股份有限公司合成。PCR反應體系20 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補至20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸60 s，共45個循環(huán)。每個樣本重復3次。

表1 引物信息

1.3 數(shù)據(jù)處理

實時熒光定量PCR結果用2-ΔΔCt法進行計算。用SPSS 20.0進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間采用t檢驗進行比較。結果用平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 地菍粗多糖對高脂飲食誘導肥胖小鼠的體重、Lee’s指數(shù)、攝食量、臟器重量及臟器系數(shù)的影響

由表2可知，在未灌胃藥物前，各組小鼠的體重均無差異。試驗結束時，與空白組相比，模型組小鼠的終體重、Lee’s指數(shù)、肝臟重量及附睪和腎臟周圍脂肪重量均顯著高于空白組(P<0.05)，表明小鼠肥胖模型建立成功。與模型組相比，高、中劑量地菍粗多糖組小鼠終體重、Lee’s指數(shù)、攝食量、肝臟及附睪和腎臟周圍脂肪的重量均顯著降低(P<0.05)，低劑量地菍粗多糖組小鼠體重、脂肪重量變化不大(P>0.05)，陽性組小鼠攝食量、肝臟重量變化不大(P>0.05)。由圖1可知，與空白組相比，模型組小鼠肝臟指數(shù)、脂肪指數(shù)均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性組、高劑量地菍粗多糖組小鼠的脂肪指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。

表2 各組小鼠體重、Lee’s指數(shù)、攝食量、臟器重量

與空白組相比，#，差異顯著(P<0.05)；與模型組相比，*，差異顯著(P<0.05)；無*，差異不顯著(P>0.05)。圖4同Compared with blank group，#，Significant difference( P<0.05)；Compared with model group，*，Significant difference (P<0.05)；No *,No significant difference (P>0.05).The same as fig.4圖1 各組小鼠肝臟指數(shù)及脂肪指數(shù)Fig.1 The liver and fat indexes of mice in each group

2.2 地菍粗多糖對小鼠血脂、肝臟脂類水平的影響

由表3可知，與空白組相比，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C含量及肝臟TC、TG含量均顯著升高(P<0.05)，血清HDL-C含量下降，但差異不顯著(P>0.05)；與模型組比較，陽性組、高劑量地菍粗多糖組小鼠血清TC、TG、LDL-C及肝臟TC、TG含量均顯著降低(P<0.05)，HDL-C含量差異不顯著(P>0.05)；中劑量地菍粗多糖組小鼠血清TC、TG及肝臟TC含量均顯著降低(P<0.05)。

表3 各組小鼠血脂及肝臟脂類測定結果

2.3 地菍粗多糖對高脂飲食誘導肥胖小鼠肝臟、脂肪組織的影響

由圖2可知，空白組脂肪細胞體積較小，大小均一，形態(tài)清晰，結構完整；與空白組相比，模型組脂肪細胞體積明顯增大，細胞大小不均勻，排列不規(guī)則，相同視野范圍內(nèi)，模型組脂肪細胞數(shù)量明顯減少，脂肪細胞體積明顯增大；與模型組相比，陽性組和高、中、低劑量地菍粗多糖組小鼠脂肪細胞均不同程度的變小，相同視野范圍內(nèi)的脂肪細胞數(shù)量明顯增多。

A，空白組；B，模型組；C，陽性組；D，高劑量組；E，中劑量組；F，低劑量組。圖3同A，Blank group；B，Model group；C，Positive group；D，High dose group；E，Medium dose group；F，Low dose group.The same as fig.3圖2 各組小鼠脂肪組織切片(200×)Fig.2 Mouse adipose tissue section in each group (200×)

由圖3可知，空白組小鼠肝臟組織結構完整，肝細胞形態(tài)大小正常，無變性壞死，未見脂肪變性現(xiàn)象，肝細胞內(nèi)未出現(xiàn)脂滴；與空白組相比，模型組細胞內(nèi)出現(xiàn)了大小、數(shù)量不等的脂滴小空泡；與模型組相比，陽性組和高、中、低劑量地菍粗多糖組小鼠肝細胞內(nèi)脂滴小空泡明顯減少。

圖3 各組小鼠肝臟組織切片(200×)Fig.3 Mouse liver tissue section in each group (200×)

2.4 地菍粗多糖對小鼠肝臟脂代謝基因表達的影響

由圖4可知，與空白組相比，模型組ACC1基因的相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05)；與模型組相比，陽性組、各劑量地菍粗多糖組ACC1基因的相對表達量均顯著下調(diào)(P<0.05)，分別降低了20%、42%、15%和11%。

圖4 各組小鼠肝臟ACC1基因相對表達量Fig.4 The relative expression of ACC1 gene in liver of mice in each group

3 討 論

體重、Lee’s指數(shù)和體內(nèi)脂肪含量是衡量肥胖程度的重要指標[19-21]，控制體重或者減少體內(nèi)脂肪的積累是預防代謝性疾病的關鍵。本試驗在用高脂飼料飼喂正常小鼠的同時，加以地菍粗多糖干預，結果發(fā)現(xiàn)，各劑量地菍粗多糖組均能不同程度地抑制小鼠體重的增長，降低Lee’s指數(shù)與脂肪指數(shù)，尤其是高劑量地菍粗多糖組更明顯，說明地菍粗多糖具有一定的抑制體重增長的作用，可以降低高脂飲食小鼠體內(nèi)脂肪重量，抑制脂肪堆積。陽性藥奧利司他雖能抑制膳食脂肪吸收，但短期內(nèi)并不抑制小鼠攝食量，而地菍粗多糖能在一定程度上抑制小鼠食欲，減少攝食量，降低終體重、Lee’s指數(shù)、肝臟重量和脂肪重量的效果優(yōu)于陽性組，其影響原因有待進一步探究。

血脂反映了脂肪代謝的情況，主要與體內(nèi)脂肪含量和機體對脂肪的利用有關，高脂飲食通常會導致血脂升高和血脂異常。研究表明，血清TC、TG和LDL-C水平的降低能有效地預防或減少心血管疾病的發(fā)生[22]。本試驗結果顯示，地菍粗多糖能抑制高脂飲食誘導的血清TC、TG和LDL-C及肝臟TC水平升高，其效果與陽性組沒有差異，說明地菍粗多糖具有預防血脂和肝臟脂質升高的作用，但HDL-C水平升高不顯著，可能是由于試驗周期過短。肥胖是Ⅱ型糖尿病發(fā)病的危險因素，且隨體重的增加危險性增加，當血脂異常時，脂肪組織分泌因子的功能不能正常發(fā)揮，會使胰島素抵抗加重而誘導糖尿病的發(fā)生[23]。研究表明，地菍粗多糖能夠降低糖尿病小鼠TC、TG、LDL-C水平，改善脂代謝紊亂，具有降血脂作用[15]，這與本試驗地菍粗多糖能夠降低高脂飲食小鼠血脂及肝臟脂類結果一致。

肝臟是體內(nèi)脂肪代謝的主要器官，機體脂肪代謝異常與肝臟組織病變密切相關[24]。本試驗中，模型組小鼠肝臟重量、肝臟系數(shù)均高于空白組，表明高脂飲食會引起肝臟脂肪沉積，但其他劑量組無顯著性變化，肝臟組織病理切片未發(fā)現(xiàn)明顯肝臟脂肪變性，說明地菍粗多糖對高脂飲食誘導小鼠的肝臟異常具有一定的預防作用。脂肪組織病理切片結果表明，高脂飲食可以增大脂肪細胞體積，增加細胞內(nèi)脂肪含量，而地菍粗多糖能有效減小小鼠脂肪細胞的體積，其效果與陽性組沒有差異。

體內(nèi)脂肪酸合成和氧化分解的調(diào)節(jié)與肝臟中各種代謝酶及其相關基因的表達有著密切聯(lián)系。ACC基因可以催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A，而后者作為長鏈合成的前體，既為脂肪酸合成提供供體，又可變構抑制脂肪酸轉運至線粒體氧化，因此，ACC基因在脂肪酸合成和代謝中發(fā)揮至關重要的作用。劉海燕等[25]通過構建小鼠預防肥胖模型探討幾種植物多糖結構與預防高脂飲食小鼠肥胖活性的關系時發(fā)現(xiàn)，白茶多糖、枸杞多糖、桑葉多糖均能下調(diào)脂質合成基因ACC1的表達，有效改善脂質代謝紊亂。本研究結果表明，高、中、低劑量地菍粗多糖均可以降低小鼠肝臟ACC1基因的表達水平，抑制脂肪酸合成，減少肝臟的脂肪積累，且高劑量地菍粗多糖對ACC1基因表達的抑制作用優(yōu)于奧利司他，提示地菍粗多糖對高脂飲食誘導肥胖小鼠脂代謝具有調(diào)節(jié)作用，進而干預肥胖的發(fā)生。試驗結果可為廣西瑤藥地菍藥材的研發(fā)應用提供新的思路和試驗依據(jù)，但地菍粗多糖干預肥胖發(fā)生的具體機制還需進一步深入研究。

4 結 論

本試驗結果表明，對高脂飲食誘導的肥胖小鼠進行地菍粗多糖干預可減輕小鼠體重、降低血清及肝臟血脂水平、減少肝臟細胞內(nèi)的脂滴、抑制脂肪細胞的膨大，其作用機制可能與參與脂肪酸合成的ACC1基因的表達有關。