劉 石，劉 靜，2，陳 莊，俞 婷，貝錦龍，王 蕾，李拯民，王志林

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心，廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保存與利用重點實驗室，廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣州 510642；3.江門新會浩田生物科技有限公司，江門 529000)

肉雞的中大雞階段是疾病的高發(fā)時期，如何高效低成本地控制集約化養(yǎng)殖帶來的疾病風險和提高動物生長性能成為十分重要的問題。在過去很長一段時間內(nèi)，飼用抗生素發(fā)揮了重要的作用[1-2]，然而，基于對公共衛(wèi)生的考量，中國已限制促生長類藥物添加劑在飼料中使用[3]。目前，依舊沒有一種可行的產(chǎn)品能夠低成本、高效率地替代抗生素在畜禽養(yǎng)殖過程中的作用，但國內(nèi)外公認益生菌可能是最具潛力的替代品之一[4-5]。益生菌作為一種安全高效的微生態(tài)制劑，在動物養(yǎng)殖過程中已被廣泛使用，如羅伊氏乳桿菌在育肥雞階段對腸炎鏈球菌感染具有潛在的益生菌活性，能提高回腸和盲腸乳酸菌的數(shù)量[6]；可通過增加JAM2和降低Claudin16的表達來增強肉雞消化道緊密連接的功能和屏障功能，提高宿主對病原微生物的抵抗力[7]；羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生的羅伊氏菌素具有極強的抑菌活性[8]。植物乳桿菌可以提高宿主腸道黏膜對大腸桿菌K88的抵抗力[9]，在肥育期或整個生長期采取益生菌干預優(yōu)于僅在起始期的處理[10]。植物乳桿菌P-8可以在保持和抗生素相似生長性能的同時為肉雞提供保護性免疫反應[11]。釀酒酵母可改善腸道形態(tài)結構，增強體液免疫功能，其保護作用可能與抑制TLR4通路及增加腸道微生物多樣性有關[12]，其細胞壁成分可以顯著提高小雞的生長性能，同時對動物腸道谷胱甘肽途徑、蛋白水解酶活性和營養(yǎng)物質(zhì)轉運有一定的調(diào)節(jié)作用[13]。但鑒于不同菌株、配伍方式及使用方法等帶來的未知問題，針對不同產(chǎn)品進行動物試驗驗證十分必要。鑒于此，本試驗研究了飲水中添加復合益生菌對嶺南黃羽肉雞生長性能和腸道微生物組的影響，以期為開發(fā)推廣復合益生菌產(chǎn)品提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取270只21日齡健康快大型嶺南黃羽肉雞(母雞)，平均體重(626.71±1.95)g，隨機分為3組，每組6個重復，每個重復15只雞，各組的平均初始體重無顯著差異。各組飼糧分別為：對照組飼喂基礎飼糧；抗生素組飼喂基礎飼糧+300 g/t 15%金霉素和40 g/t 50%維吉尼亞霉素；益生菌組飼喂基礎飼糧，同時在飲水中添加復合益生菌。

試驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學院-白云試驗基地進行，試驗雞由廣東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧所自繁自養(yǎng)。試驗前做好雞舍衛(wèi)生和消毒工作，地面平養(yǎng)，自然光照加補光，每天光照24 h，自由采食與飲水，隨時觀察并記錄雞的采食和健康狀況，試驗期5周。

1.2 試驗材料

復合益生菌：羅伊氏乳桿菌由廣東省農(nóng)業(yè)科學院基因中心微生物資源研究室分離鑒定所得，植物乳桿菌和釀酒酵母均購自廣東省微生物研究所。3種菌種按1∶1∶1的比例配制成復合益生菌，各菌種添加量參考實驗室前期研究數(shù)據(jù)，均為1.0×106CFU/mL，總活菌數(shù)量為3.0×106CFU/mL。飲水添加。

試驗飼糧：選用玉米-豆粕型基礎飼糧，參照NRC(1994)建議的雞的營養(yǎng)需要量、《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33-2004)和《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表(2005年)》，按照22～42和43～56日齡2個階段進行飼糧配制，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.3 樣品采集與處理

在42和56日齡時，每組每個重復隨機挑選出1只與該組平均體重相似的雞，頸椎脫臼處死后，采集回腸和盲腸內(nèi)容物，裝入已滅菌并做好標記的2 mL EP管中，置于液氮中，待樣品采集完后帶回實驗室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定指標與方法

1.4.1 生長性能 在42和56日齡時，分別以重復為單位稱取雞的空腹重(稱重前禁食12 h，不禁水)，并記錄耗料量。分別計算各階段的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)，并以各處理組為單位計算死淘率。

平均日增重(g/d)=(結測體重-初測體重)/(試驗雞數(shù)×試驗天數(shù))

平均日采食量(g/d)=總采食量/(試驗雞數(shù)×試驗天數(shù))

料重比=總耗料量/總增重

死淘率(%)=(初期雞數(shù)-末期雞數(shù))/初期雞數(shù)×100%

1.4.2 腸道微生物菌群結構 采用Qiagen試劑盒提取回腸和盲腸內(nèi)容物中的微生物DNA，檢測其DNA的濃度及純度，并調(diào)整到適宜濃度(D260 nm/D280 nm值為1.8～2.0)后進行PCR擴增，DNA文庫制備，上機檢測，高通量測序工作委托天津諾禾致源科技股份有限公司完成。測序結果進行微生物組Alpha多樣性及腸道微生物豐度變化分析。Alpha多樣性分析是針對一定區(qū)域內(nèi)物種的多樣性進行的統(tǒng)計分析，主要指標包括：Observed Species 指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao指數(shù)[14]和Ace指數(shù)。

1.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 試驗數(shù)據(jù)用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析和t檢驗，結果以平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結 果

2.1 飲水中添加復合益生菌對嶺南黃羽肉雞生長性能的影響

由表2可知，22～42日齡，不同處理組之間平均日增重存在顯著差異(P<0.05)；各組間平均日采食量無顯著差異；益生菌組和抗生素組料重比均顯著低于對照組(P<0.05)。43～56日齡，各組間平均日增重、平均日采食量和料重比差異均不顯著(P>0.05)。 22～56日齡，與對照組相比，益生菌組和抗生素組平均日增重均顯著提高(P<0.05)，益生菌組和抗生素組之間無顯著差異(P>0.05)，但益生菌組的平均日增重有超過抗生素組的趨勢；各組間平均日采食量和料重比均無顯著差異(P>0.05)；死淘率排列順序為抗生素組>對照組>益生菌組，由于試驗樣本量有限，死淘率僅代表有這種趨勢。

2.2 飲水中添加復合益生菌對嶺南黃羽肉雞腸道微生物菌群結構的影響

2.2.1 Alpha多樣性指數(shù) 由表3可知，對于回腸微生物，42日齡時，抗生素組Observed Species指數(shù)、Shannon指數(shù)和Ace指數(shù)均顯著高于對照組和益生菌組(P<0.05)，各組間其他指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)；56日齡時，抗生素組Observed Species指數(shù)、Chao指數(shù)和Ace指數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05)，益生菌組Chao指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)。對于盲腸微生物，42日齡時，對照組和益生菌組Observed Species指數(shù)均顯著高于抗生素組(P<0.05)，各組間其他指數(shù)無顯著差異(P>0.05)；56日齡時，各組間各指數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。

2.2.2 腸道微生物菌群豐度變化 通過與數(shù)據(jù)庫Silva132比對進行物種注釋，并對不同分類層級統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，共有1 101個OTUs，其中數(shù)據(jù)庫中可注釋的OTUs數(shù)目為1 091(99.09%)，注釋到界、門、綱、目、科的比例依次為99.09%、97.37%、95.10%、90.92%和82.11%。

2.2.2.1 基于門水平物種相對豐度 由表4可知，回腸門水平上，42日齡時，益生菌組厚壁菌門的相對豐度顯著高于抗生素組(P<0.05);擬桿菌門和變形菌門的相對豐度均顯著低于抗生素組(P<0.05)，但與對照組均無顯著差異(P>0.05)。56日齡時，益生菌組厚壁菌門的相對豐度與對照組和抗生素組均無顯著差異(P>0.05)，但抗生素組厚壁菌門的相對豐度顯著低于對照組(P<0.05)；益生菌組擬桿菌門的相對豐度顯著高于對照組(P<0.05)，但與抗生素組間無顯著差異(P>0.05)；益生菌組變形菌門和放線菌門的相對豐度顯著低于抗生素組(P<0.05)，但與對照組間無顯著差異(P>0.05)。

盲腸門水平上，42日齡時，各處理組在厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門的相對豐度上均無顯著差異(P>0.05)；56日齡時，益生菌組厚壁菌門的相對豐度顯著高于抗生素組(P<0.05)，放線菌門的相對豐度顯著低于抗生素組(P<0.05)，但與對照組間均無顯著差異(P>0.05)。

2.2.2.2 基于屬水平物種相對豐度 由表5可知，回腸屬水平上， 42日齡時， 各處理組在乳桿菌屬的相對豐度上均存在顯著差異(P<0.05)，即益生素組>對照組>抗生素組；益生菌組腸球菌屬、腸桿菌科未確定菌屬、擬桿菌屬和別樣桿菌屬的相對豐度均顯著低于抗生素組(P<0.05)，但與對照組間均無顯著差異(P>0.05)。56日齡時，益生菌組乳桿菌屬的相對豐度顯著低于對照組(P<0.05)，但與抗生素組間無顯著差異(P>0.05)；腸桿菌科未確定菌屬的相對豐度顯著低于抗生素組(P<0.05)，但與對照組間無顯著差異(P>0.05)；擬桿菌屬和別樣桿菌屬的相對豐度均顯著高于對照組(P<0.05)。

盲腸屬水平上，42日齡時，益生菌組乳桿菌屬、腸球菌屬和別樣桿菌屬的相對豐度均顯著低于抗生素組(P<0.05)，但與對照組間均無顯著差異(P>0.05)；鏈球菌屬的相對豐度顯著高于對照組(P<0.05)，但與抗生素組間無顯著差異(P>0.05)。56日齡時，益生菌組乳桿菌屬的相對豐度顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05)；鏈球菌屬的相對豐度顯著低于對照組(P<0.05)，但與抗生素組間無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 飲水中添加復合益生菌對嶺南黃羽肉雞生長性能的影響

復合益生菌可通過改善空腸黏膜屏障功能和腸道形態(tài)，改善肉雞的生長性能、養(yǎng)分存留率和血清抗氧化能力，改善腸道健康[15]。研究表明，復合益生菌可以促進白羽肉雞消化器官的生長、脂類合成及氨基酸代謝[16]，顯著提高青年白羽肉雜雞體重[17]，飼料中加入1.5%復合益生菌制劑，可以提高22～42日齡肉雞的平均日增重，顯著降低料重比[18]。本試驗結果與上述研究結果基本一致，在22～42日齡，益生菌組平均日增重顯著高于對照組，平均日采食量則無顯著差異，益生菌組和抗生素組料重比均顯著低于對照組，而益生菌組和抗生素組之間差異不顯著，這與李龍[19]的結果有高度的相似性；43～56日齡，各組間平均日增重、平均日采食量和料重比均無顯著差異，說明抗生素作用效果可能會隨著黃羽肉雞日齡增加而減弱，益生菌組呈現(xiàn)同樣趨勢，可能與43～56日齡腸道菌群結構相對更穩(wěn)定有關；22～56日齡，與對照組相比，益生菌組和抗生素組平均日增重均顯著提高，各組間平均日采食量和料重比均無顯著差異;益生菌組全階段死淘率為1.11%，遠低于對照組和抗生素組，這一結果與Tarabees等[20]結果基本一致。 整體上看，益生菌組與抗生素組在生產(chǎn)性能指標上存在較大的相似性，說明益生菌在一定程度上可以達到抗生素促生長的效果。以上各研究中，雖然添加的益生菌種類略有不同，但都體現(xiàn)出相同的趨勢，說明肉雞飼養(yǎng)過程中添加復合益生菌可以起到良好的使用效果。

3.2 飲水中添加復合益生菌對嶺南黃羽肉雞腸道微生物菌群結構的影響

腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要器官，對宿主健康和生產(chǎn)性能起著重要作用[21-22]。腸道微生物是影響腸道健康的最主要的原因之一，其數(shù)量約是宿主細胞的10倍[23]，它對宿主的胃腸道生理、生長性能和免疫系統(tǒng)等都存在積極影響[24]。腸道微生物通過競爭抑制和產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等方式，直接或間接地減少腸道中有害微生物的數(shù)量，且復合益生菌似乎顯示出比單一菌株更大的功效[25]。因此，通過飼喂益生菌來增強腸道免疫力[26]、緩解養(yǎng)殖中的疾病問題[27]成為一種不錯的選擇。

給家禽飼喂益生菌可以增加腸道益生菌種類，減少致病菌種類[28]，可能原因是高劑量益生菌持續(xù)進入到腸道中，成為相對優(yōu)勢菌群，對其他菌種造成抑制，這也很好地解釋了益生菌組在42日齡回腸和盲腸中群落多樣性相對較低的原因。在抗生素作用方面，Choi等[29]研究表明，飼喂35 d含阿維拉霉素飼糧的肉雞回腸和盲腸中的細菌群落產(chǎn)生顯著變化，阿維拉霉素組回腸細菌多樣性高于對照組，盲腸則相反，這一結果與本試驗結果基本相同，回腸多樣性在42和56日齡均為抗生素組最高，盲腸多樣性在42日齡則呈現(xiàn)相反狀況。Costa等[30]研究添加5種不同抗生素對肉雞盲腸微生物區(qū)系的影響，結果表明，各處理組主要類群的相對豐度與對照組間差異不顯著，這與本試驗結果相反，可能與抗生素添加劑量和飼養(yǎng)日齡有關[31-32]，同時腸道微生物區(qū)系之間復雜的相互作用使菌群整體對抗生素的耐受能力不同，也會造成結果上的差異[33]。

De Cesar等[34]研究表明，通過飲水方式添加乳桿菌可以顯著提高14日齡肉雞盲腸中乳桿菌的數(shù)量，同時對盲腸中有益微生物和功能基因有促進作用，飼糧中添加植物乳桿菌能降低盲腸大腸桿菌數(shù)量，增加乳酸菌的數(shù)量[35]，這與本試驗結果類似，益生菌組56日齡肉雞盲腸中乳桿菌屬豐度上升。Johnson等[36]通過對大數(shù)據(jù)的挖掘發(fā)現(xiàn)，梭狀芽孢桿菌屬、腸球菌屬和腸桿菌科未確定菌屬的豐度與肉仔雞的生產(chǎn)性能呈負相關，因為這些群體中可能含有導致肉雞疾病的典型細菌種類，如產(chǎn)氣莢膜梭菌、盲腸球菌和禽致病性大腸桿菌等。本試驗中益生菌組肉雞腸球菌屬和腸桿菌科未確定菌屬的相對豐度在42日齡回腸和盲腸中呈現(xiàn)下降趨勢，且22～42日齡階段肉雞生長性能與對照組相比顯著提高，這一變化與Johnson等[36]結果高度一致，且也表現(xiàn)出了腸球菌屬、腸桿菌科未確定菌屬與生長性能的負相關特性。然而本研究重點考慮腸道中微生物的變化情況，沒有分析腸道菌群與宿主功能基因的關聯(lián)變化，后續(xù)可以進行深入研究。

4 結 論

飲水中添加復合益生菌能夠改善22～56日齡嶺南黃羽肉雞的生長性能，同時還改善了42和56日齡嶺南黃羽肉雞回腸和盲腸的微生物菌群結構。