馮志強(qiáng)，王騰飛，趙善江，郝海生，杜衛(wèi)華，趙學(xué)明，鄒惠影，朱化彬，龐云渭

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

氧化還原平衡的維持是機(jī)體或細(xì)胞發(fā)揮正常生理功能的基礎(chǔ)。當(dāng)機(jī)體受到外界各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基或活性氧(reactive oxygen species，ROS)會(huì)超過(guò)自身的清除能力，過(guò)量的ROS破壞機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化的平衡穩(wěn)態(tài)，造成DNA損傷，引發(fā)氧化應(yīng)激。隨著中國(guó)集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，高溫高濕、有害氣體、高脂高蛋白飼糧等因素都會(huì)引起動(dòng)物的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致畜禽抗病能力下降，嚴(yán)重阻礙畜禽健康生長(zhǎng)和生產(chǎn)性能的提高。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor，Nrf2)/Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)-抗氧化應(yīng)答元件(antioxidant response element，ARE)信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的機(jī)體內(nèi)源性抗氧化信號(hào)途徑。由Nfe2l2基因編碼的Nrf2是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控下游300多個(gè)靶基因的表達(dá)[1]。Keap1是Nrf2的胞質(zhì)抑制因子，發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Keap1上的關(guān)鍵“傳感器”半胱氨酸巰基被修飾，破壞其對(duì)Nrf2的降解，游離和新生的Nrf2易位到細(xì)胞核內(nèi)，與小Maf(small Maf，sMaf)蛋白形成異二聚體并識(shí)別ARE序列，開(kāi)啟基于Nrf2的細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)[2-3]。Nrf2/Keap1-ARE通路可參與包括維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡、細(xì)胞增殖/分化、代謝、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和炎癥的調(diào)節(jié)以及疾病的發(fā)生發(fā)展等多種細(xì)胞過(guò)程[4-5]。以下主要就Nrf2/Keap1-ARE信號(hào)通路的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)、生物學(xué)功能及Nrf2信號(hào)的調(diào)控機(jī)制作一簡(jiǎn)要綜述，為緩解氧化應(yīng)激損傷、提高畜禽生產(chǎn)性能提供理論基礎(chǔ)。

1 Nrf2/Keap1-ARE通路的分子結(jié)構(gòu)

1.1 Nrf2的結(jié)構(gòu)

Nrf2是一種具有保守堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(basic-region leucine zipper，bZIP)的cap “n” collar(CNC)轉(zhuǎn)錄因子，含有7個(gè)Nrf2-ECH同源結(jié)構(gòu)域(Nehl～Neh7)[6](圖1，參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]繪制)。Nehl結(jié)構(gòu)域包含CNC-bZIP區(qū)，與細(xì)胞核內(nèi)sMaf蛋白形成異二聚體，識(shí)別并結(jié)合ARE上的DNA分子，也可與E2泛素連接酶UbcM2相互作用，調(diào)節(jié)Nrf2蛋白的穩(wěn)定性[8]。Neh2結(jié)構(gòu)域含有DLG和ETGE兩個(gè)高度保守的氨基酸基序，介導(dǎo)Nrf2負(fù)調(diào)控因子Keap1與賴氨酸殘基相互作用[9]。Neh3位于Nrf2的C端，與轉(zhuǎn)錄輔激活因子CHD6相互作用，負(fù)責(zé)染色質(zhì)重塑后ARE調(diào)控相關(guān)基因的反式激活[10]。Neh4和Neh5屬于轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，不僅可與輔激活因子環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP-responsive element-binding protein，CREB)結(jié)合促進(jìn)Nrf2轉(zhuǎn)錄，還可與核輔因子RAC3/AIB1/SRC3相互作用，增強(qiáng)ARE下游基因的表達(dá)[11]。Neh6結(jié)構(gòu)域是一段富含絲氨酸的非依賴Keap1的負(fù)調(diào)控Nrf2穩(wěn)定性的區(qū)域，包含DSGIS和DSAPGS兩個(gè)保守的肽基序，這兩個(gè)基序能夠被β-轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)序列蛋白(β-TrCP)識(shí)別；在糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)介導(dǎo)DSGIS基序磷酸化后，β-TrCP結(jié)合到Neh6結(jié)構(gòu)域，促進(jìn)泛素連接酶復(fù)合物募集和Nrf2蛋白酶體降解[12-13]。Neh7通過(guò)與視黃醇類X受體α相互作用，抑制Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性[14]。

圖1 Nrf2蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.1 The protein domain of Nrf2

1.2 Keap1的結(jié)構(gòu)

Keap1是一種分子質(zhì)量為69 ku的蛋白，包含5個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為NTR、BTB/POZ、IVR、DGR和CTR結(jié)構(gòu)域[15-16](圖2，參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]繪制)。NTR和CTR區(qū)分別為N-末端結(jié)構(gòu)域和C-末端結(jié)構(gòu)域。BTB/POZ區(qū)與肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白結(jié)合形成同源二聚體，在E3泛素連接酶的作用下參與Nrf2的泛素化和降解[17]。IVR結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸殘基，對(duì)親電試劑和氧化劑敏感，在發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，IVR構(gòu)象改變，導(dǎo)致Nrf2與Keap1解離；IVR區(qū)還包含一個(gè)核輸出信號(hào)基序，對(duì)Keap1在胞質(zhì)中的定位至關(guān)重要[17]。DGR結(jié)構(gòu)域又稱Kelch結(jié)構(gòu)域，DGR與CTR共同形成六葉β-螺旋結(jié)構(gòu)，直接與Nrf2-Neh2區(qū)的DLG和ETGE基序結(jié)合，使Keap1二聚體能夠識(shí)別一個(gè)Nrf2分子[15]。

圖2 Keap1蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.2 The protein domain of Keap1

1.3 ARE的結(jié)構(gòu)

ARE是具有5′-TGACXXXGC-3′核心序列的特異DNA啟動(dòng)子序列，最初被鑒定為NADPH醌脫氫酶1(NADPH quinone dehydrogenase 1，NQO1)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)基因的順式調(diào)控元件。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，ARE編碼的基因涉及藥物解毒、抗氧化反應(yīng)、NADPH再生和代謝調(diào)節(jié)等一系列過(guò)程[18]，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)、谷氨酸-半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteine ligase，GLC)、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、硫氧還蛋白(thioredoxin，TXN)、硫氧還蛋白還原酶1(thioredoxin reductase 1，Txnrd1)等。Nrf2是ARE最重要的激活因子，在應(yīng)激條件下，Nrf2與Keap1解離，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，與sMaf 蛋白形成異二聚體并識(shí)別ARE序列，激活下游細(xì)胞保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄，即Nrf2/Keap1-ARE通路(圖3，參考相關(guān)文獻(xiàn)[19]繪制)。Nrf2退化或受抑制會(huì)使細(xì)胞變敏感，易受氧化損傷[17]。

圖3 Nrf2/Keap1-ARE信號(hào)通路在生理(A)和應(yīng)激(B)狀態(tài)下的調(diào)控Fig.3 Regulation of Nrf2/ Keap1-ARE signaling pathway in physiological (A) and stress (B) states

2 Nrf2/Keap1-ARE通路的生物學(xué)功能

2.1 維持胞內(nèi)氧化還原平衡及代謝穩(wěn)態(tài)

Nrf2/Keap1被認(rèn)為是“巰基驅(qū)動(dòng)的主開(kāi)關(guān)”，一方面通過(guò)調(diào)節(jié)GR、GPx和GST等的表達(dá)，維持胞內(nèi)還原型GSH的水平[18]；另一方面通過(guò)調(diào)控胞質(zhì)TXN、Txnrd1等的表達(dá)，提供ROS產(chǎn)生的區(qū)域性傳感和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[20-21]，在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。 Nrf2誘導(dǎo)劑萊菔硫烷(sulforaphane,SFN)不僅可增強(qiáng)氧化應(yīng)激環(huán)境下牛顆粒細(xì)胞的活力，降低細(xì)胞毒性，上調(diào)Nrf2下游靶基因(CAT、PRDX1、SOD1和TXN1)表達(dá)[22]；還可保護(hù)精子抵抗冷凍-解凍氧化損傷，減少對(duì)精子的不利影響[23]。熱應(yīng)激導(dǎo)致的奶牛產(chǎn)奶量下降和乳腺功能障礙是乳制品行業(yè)面臨的重大難題，Yang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激顯著增加了牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)ROS積累和丙二醛含量，降低了SOD和GPx活性，而膽堿處理可通過(guò)調(diào)節(jié)PERK/Nrf2信號(hào)通路有效抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，研究結(jié)果為緩解奶牛熱應(yīng)激和改善其繁殖性能提供了參考。

此外，Nrf2可調(diào)節(jié)編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸酶1和檸檬酸脫氫酶1等基因的表達(dá)，參與NADPH的再生[25]，影響磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)。5-磷酸核糖是PPP的主要產(chǎn)物，可代謝為嘌呤或嘧啶核苷的前體——磷酸核糖焦磷酸。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2通過(guò)間接調(diào)控磷酸核糖焦磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶和亞甲基四氫葉酸脫氫酶2來(lái)促進(jìn)嘌呤的合成[25]。在脂質(zhì)代謝中，Nrf2通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶和?；o酶A來(lái)控制脂肪酸氧化的效率[25]。鐵作為一種必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被用作氧氣運(yùn)輸、氧化磷酸化和代謝產(chǎn)物氧化酶的輔助因子[26]，但是過(guò)量的鐵會(huì)促進(jìn)ROS生成，破壞生物分子。Nrf2通過(guò)調(diào)控NQO1、HO-1和膽綠素還原酶(biliverdin reductase，BVR)基因的表達(dá)，參與血紅素和鐵的代謝[27]。

2.2 抗炎抗衰老作用

Nrf2調(diào)節(jié)的抗氧化和細(xì)胞保護(hù)酶能防止親電氧化損傷和抑制促炎癥介質(zhì)的過(guò)度生成[28]。沉默Nrf2后，環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)的表達(dá)顯著增加[29]；而激活Nrf2則會(huì)降低COX-2和iNOS的表達(dá)，表明Nrf2對(duì)促炎癥介質(zhì)具有抑制作用[30]。妊娠期奶牛易受致病菌感染，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎。在用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型中，研究人員發(fā)現(xiàn)，LPS可造成乳腺上皮細(xì)胞損傷和凋亡[31]。Gao等[32]用桃葉珊瑚甙處理LPS誘導(dǎo)的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)桃葉珊瑚甙能降低子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中TNFα、IL-1β、IL-6、COX-2和iNOS mRNA的表達(dá)，激活Nrf2/Keap1通路，促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)移，并提高Keap1、Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明Nrf2/Keap1通路對(duì)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。非瑟酮是一種天然的多酚類黃酮，具有多種藥理活性。最新的研究發(fā)現(xiàn)，非瑟酮也可通過(guò)激活Nrf2/HO-1通路有效抑制LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[33]。

在多種細(xì)胞類型中，Nrf2的表達(dá)水平和活性均隨年齡的增長(zhǎng)而下降[34]，通過(guò)Nrf2激動(dòng)劑SFN增強(qiáng)Nrf2活性和內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)機(jī)制是預(yù)防衰老引起的肌肉和心臟功能障礙的有效手段[35]。Nrf2/Keap1途徑激活還能夠延緩或逆轉(zhuǎn)Ⅱ型糖尿病對(duì)胰腺、心臟、皮膚以及其他細(xì)胞和組織造成的損傷[36]。Nrf2基因沉默抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的遷移、增殖和分泌，加劇其氧化應(yīng)激水平和衰老；而激活Nrf2可保護(hù)EPCs免受氧化應(yīng)激和細(xì)胞衰老的影響，改善糖尿病小鼠EPCs的生物學(xué)功能[37]。

2.3 對(duì)疾病的調(diào)控作用

Nrf2/Keap1-ARE通路的激活是抗腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。在腫瘤發(fā)生早期，Nrf2的激活使癌細(xì)胞能夠適應(yīng)不利的微環(huán)境和高內(nèi)源性ROS水平[27]；而在快速增殖的細(xì)胞中，Nrf2可通過(guò)促進(jìn)核苷酸和氨基酸的生物合成來(lái)支持中間代謝[38]。Keap1的功能缺失性突變或Nrf2的功能獲得性突變是非小細(xì)胞肺癌和環(huán)境因素誘發(fā)的其他癌癥的重要病因[39]。Nrf2的活化增強(qiáng)了抗腫瘤免疫，從而防止肺癌的發(fā)生，但在腫瘤發(fā)生后卻能加速其生長(zhǎng)[40]。與野生型小鼠相比，化學(xué)致癌的Nrf2基因敲除小鼠腫瘤數(shù)量明顯增多，但體積顯著減小[41]。這些結(jié)果表明，低活性Nrf2促進(jìn)腫瘤發(fā)生，而持續(xù)的高活性Nrf2可加速癌癥進(jìn)展及對(duì)治療的耐受。

已有研究證實(shí)，Nrf2能夠降低帕金森病(Parkionson’s disease,PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)等疾病的發(fā)生。Lewy小體是PD患者腦內(nèi)的特征性標(biāo)志物，其主要成分是α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)，編碼α-syn的SNCA基因的三倍化引起α-syn的過(guò)量表達(dá)，促進(jìn)Lewy小體的形成；Nrf2通過(guò)清除α-突觸核蛋白，阻止Lewy小體的形成和PD的發(fā)生[42]。β-淀粉樣多肽(amyloid-β peptides,Aβ)沉積是AD發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵事件，在AD動(dòng)物模型中，Nrf2活化可降低Aβ生成限速酶BACE1的產(chǎn)生并改善認(rèn)知缺陷[43]。動(dòng)物研究和臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Nrf2/Keap1途徑在Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的防御作用[44]，如敲除Nrf2的胰島β細(xì)胞抗氧化酶水平降低，而過(guò)表達(dá)Nrf2可誘導(dǎo)β細(xì)胞的增殖[45-46]。

3 Nrf2信號(hào)的多層調(diào)控

Nrf2處于復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心，其活性可通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位、翻譯后修飾等在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行控制(圖4，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]繪制)。

→，表示激活調(diào)節(jié)；-|，表示抑制調(diào)節(jié)→，Indicate activating regulation；-|，Indicate inhibitory regulation圖4 Nrf2活性調(diào)節(jié)機(jī)制Fig.4 Mechanisms of regulation of Nrf2 activity

3.1 Nrf2的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

Nfe2l2基因啟動(dòng)子的近端區(qū)域包含ARE樣元件，使Nrf2能夠直接激活自身的轉(zhuǎn)錄，正反饋調(diào)節(jié)其自身的表達(dá)。在多環(huán)芳烴的暴露下，Nrf2由芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AhR)誘導(dǎo)產(chǎn)生。AhR與AhR核轉(zhuǎn)運(yùn)體形成異二聚體并結(jié)合到Nfe2l2基因啟動(dòng)子區(qū)的外源反應(yīng)元件序列，從而反式激活Nfe2l2基因的轉(zhuǎn)錄，表明外源配體能夠通過(guò)誘導(dǎo)AhR激活Nrf2通路[47]。Nfe2l2基因啟動(dòng)子區(qū)還包含核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)結(jié)合位點(diǎn)，在發(fā)生炎癥的牛乳腺上皮細(xì)胞中，NF-κB亞基p65表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)Nrf2易位[48]。此外，致癌基因Kras、B-Raf和Myc[49]以及Notch信號(hào)通路[50]均能增強(qiáng)Nfe2l2的轉(zhuǎn)錄。

Nfe2l2 mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾在Nrf2激活和功能校正中發(fā)揮重要作用。 轉(zhuǎn)錄后修飾包括microRNA(miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和Nfe2l2轉(zhuǎn)錄本的選擇性剪接。miRNAs通過(guò)直接靶向Nrf2或Keap1 mRNA的3′-UTR序列，下調(diào)或上調(diào)Nrf2蛋白的表達(dá)[51]。在牛顆粒細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-28、miR-153和miR-708會(huì)下調(diào)Nrf2表達(dá)，造成ROS累積、線粒體活性和細(xì)胞增殖能力受損[52]。 然而，在生理狀態(tài)下，miRNA對(duì)Nrf2的調(diào)控還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。lncRNA也能調(diào)控Nrf2的激活，如HOTAIR可提高Nrf2啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白H4乙?；健ALAT1能負(fù)調(diào)控Keap1的表達(dá)、TUG1直接與Nrf2蛋白互作等[53]。Nrf2活性還可通過(guò)Nfe2l2轉(zhuǎn)錄本的選擇性剪接進(jìn)行調(diào)控。一些腫瘤細(xì)胞表達(dá)Nfe2l2的轉(zhuǎn)錄變體，這些變體缺失編碼Keap1相互作用域的外顯子，導(dǎo)致Nrf2通路過(guò)度活躍[54]。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Nfe2l2 mRNA核輸出和穩(wěn)定的調(diào)節(jié)由兩種靶向新生轉(zhuǎn)錄本3′-UTR區(qū)的mRNA結(jié)合蛋白(HuR和AUF1)調(diào)控[55]。

3.2 Nrf2蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控

Keap1是調(diào)節(jié)Nrf2蛋白穩(wěn)定性的主要因子，其敲低或缺失會(huì)造成Nrf2在核內(nèi)累積，刺激細(xì)胞保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄[56]。 泛素結(jié)合蛋白p62(又稱SQSTM1)基因啟動(dòng)子區(qū)含有ARE序列，通過(guò)與Nrf2競(jìng)爭(zhēng)介導(dǎo)Keap1的自噬降解以增強(qiáng)Nrf2蛋白的穩(wěn)定性[57]。Tang等[58]研究乳酸鋅對(duì)豬腸上皮細(xì)胞增殖、抗氧化能力等的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳酸鋅處理可增加Nrf2蛋白的表達(dá)豐度，降低Keap1和p62蛋白表達(dá)，表明乳酸鋅通過(guò)激活Nrf2-p62通路提高豬腸上皮細(xì)胞的抗氧化能力，可作為一種新型仔豬飼料添加劑。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21Cip1/WAF1、蛋白去糖酶DJ-1、腫瘤抑制因子BRCA1和乙酰轉(zhuǎn)移酶p300等均可通過(guò)破壞Nrf2-Keap1的相互作用來(lái)增強(qiáng)Nrf2蛋白的穩(wěn)定性[56,59]。此外，Nrf2蛋白穩(wěn)定性也可通過(guò)非依賴Keap1的方式調(diào)節(jié)，包括β-TrCP/Cul1依賴途徑和Hrd1依賴途徑。對(duì)糖尿病腎病大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β/β-TrCP軸的活化可加速Nrf2的降解，導(dǎo)致腎細(xì)胞存活受損[60]。Hrd1是一種E3泛素連接酶，條件性敲除小鼠肝臟中的Hrd1可顯著增強(qiáng)Nrf2及其靶基因的表達(dá)[61]。 最新研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2上的QSLVPDI基序是其與Hrd1相互作用的活性位點(diǎn)，X-box結(jié)合蛋白1下調(diào)通過(guò)抑制Hrd1介導(dǎo)的Nrf2泛素化保護(hù)腎缺血再灌注損傷[62]。

3.3 Nrf2亞細(xì)胞定位的調(diào)控

Nrf2核易位是Nrf2基因誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。熱應(yīng)激會(huì)造成動(dòng)物的胃腸損傷，Xu等[63]采用石榴苷處理大鼠腸上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)石榴苷處理能誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，并以時(shí)間和劑量依賴性方式增加Nrf2核易位，其上游信號(hào)通路PI3K/Akt在石榴苷誘導(dǎo)的Nrf2核易位中起重要的調(diào)控作用。 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是一種常見(jiàn)的霉菌毒素，不僅會(huì)影響動(dòng)物的采食量和生長(zhǎng)性能，還會(huì)對(duì)妊娠母畜和胎兒造成毒性損傷。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是DON誘導(dǎo)胚胎毒性的重要因素，DON處理后，Nrf2/HO-1通路被激活，Nrf2從細(xì)胞核易位到細(xì)胞質(zhì)，說(shuō)明Nrf2核易位可能對(duì)其起重要作用[64]。鎘是一種重金屬有毒元素，其引起的生態(tài)環(huán)境污染對(duì)人類和畜禽健康造成嚴(yán)重危害。Dong等[65]的研究發(fā)現(xiàn)，在鎘暴露的原代腎小管細(xì)胞中自噬流被阻斷，p62蛋白在胞內(nèi)累積，Nrf2核易位增強(qiáng)，抑制AMPK磷酸化，使AKT/mTOR信號(hào)失活，最終導(dǎo)致腎小管細(xì)胞的氧化損傷。DJ-1是一種泛素化和多功能蛋白，可作為Nrf2的轉(zhuǎn)錄輔助激活因子。正常條件下，敲低DJ-1后Nrf2的核易位下降，表明DJ-1通過(guò)輔助Nrf2的核定位，正調(diào)控其介導(dǎo)的細(xì)胞抗氧化防御[66]。染色體維持蛋白1(chromosomal region maintenance 1，CRM1)是典型的核輸出蛋白受體，可調(diào)控Nrf2的核輸出。在內(nèi)源性或外源性一氧化氮的暴露下，CRM1發(fā)生S-亞硝基化，CRM1的失活促進(jìn)了Nrf2在核內(nèi)的累積及其調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄激活[67]。此外，一些生物活性物質(zhì)，如褪黑素[68]、生育三烯酚[69]、黃岑素[70]等均能激活Nrf2的核易位，啟動(dòng)抗氧化保護(hù)相關(guān)機(jī)制。

3.4 Nrf2信號(hào)的翻譯后修飾調(diào)控

Nrf2可發(fā)生廣泛的蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modifications，PTMs)，如磷酸化、乙酰化、泛素化和SUMO化修飾等。在氧化應(yīng)激條件下，Akt激活的GSK-3β使酪氨酸激酶Fyn的蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致Nrf2在核內(nèi)積聚；反之，F(xiàn)yn催化Nrf2上Tyr568磷酸化，促進(jìn)Nrf2由核內(nèi)向胞質(zhì)轉(zhuǎn)出，抑制下游HO-1和NQO1基因的轉(zhuǎn)錄[71-72]。在脂毒性條件下，SQSTM1誘導(dǎo)Unc-51樣自噬激活激酶1磷酸化，細(xì)胞發(fā)生巨自噬，導(dǎo)致Keap1降解和Nrf2激活[73]。

組蛋白修飾對(duì)Nrf2/Keap1通路也有影響。在組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)p300/CREB結(jié)合蛋白(CREB binding protein，CBP)的作用下，Nrf2在Neh1區(qū)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域發(fā)生乙酰化，啟動(dòng)依賴Nrf2的基因轉(zhuǎn)錄[74]。HAT p300與Nrf2相互作用，干擾Nrf2/Keap1復(fù)合物的形成，增加Nrf2蛋白豐度和穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)Nrf2的核定位[59]。同時(shí)，p300/CBP還參與NF-κB亞基p65介導(dǎo)的Nrf2活性的調(diào)節(jié)，招募組蛋白去乙酰酶3抑制ARE依賴的基因轉(zhuǎn)錄[75]。組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶SetD7介導(dǎo)的H3K4me有利于轉(zhuǎn)錄因子Sp1與Keap1啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而上調(diào)Keap1的轉(zhuǎn)錄并抑制Nrf2表達(dá)[76]。

SUMO化修飾是一種涉及小泛素樣蛋白修飾分子(small ubiquitin-like modifier，SUMO)與含有SUMO結(jié)合基序的靶蛋白共價(jià)連接的修飾方式，通過(guò)影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)之間的互作等調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程[77]。Nrf2在SUMO1和SUMO2/3作用下發(fā)生SUMO化修飾，之后被部分轉(zhuǎn)運(yùn)到核體中，在多聚SUMO特異E3泛素連接酶RNF4作用下降解[78]。而另一種多聚SUMO特異E3泛素連接酶RNF11可增加Nrf2蛋白穩(wěn)定性[79]。最新研究表明，SUMO2介導(dǎo)的Nrf2中K110和K533發(fā)生SUMO化修飾，通過(guò)增強(qiáng)Nrf2穩(wěn)定性和核易位部分調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性[80]。

4 結(jié) 語(yǔ)

Nrf2處于一個(gè)復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心，是調(diào)控細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)機(jī)體受到紫外線、輻射或炎性因子等外界應(yīng)激因素刺激時(shí)，Nrf2介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)基因上調(diào)表達(dá)變得尤為關(guān)鍵。 Nrf2的活性除了受其負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白Keap1的精確調(diào)控外，還由細(xì)胞類型、活化刺激、ARE識(shí)別、輔激活因子/競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、靶基因啟動(dòng)子區(qū)的表觀遺傳修飾等因素決定。 畜禽的繁殖障礙、抗病力弱、畜產(chǎn)品品質(zhì)下降等均與氧化應(yīng)激導(dǎo)致的氧化損傷有關(guān)。目前，關(guān)于Nrf2/Keap1-ARE信號(hào)通路的研究多集中在各種慢性疾病和癌癥治療以及Nrf2相關(guān)藥物的臨床篩選上，而Nrf2對(duì)畜禽抗氧化應(yīng)激的調(diào)控仍處于不斷探索中。 因此，深入了解Nrf2/Keap1-ARE信號(hào)通路的生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制，將有助于為畜禽健康及疾病治療提供新的生物標(biāo)志物和治療策略。