劉在霞，段 仕，孫燕勇，呂 琦，付紹印，何小龍，張文廣，劉永斌

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)基因組大數(shù)據(jù)工程研究中心，呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010031；4.和田師范專科學(xué)校，和田 848000)

綿羊在全球畜牧業(yè)中占有很大比例，而繁殖效率是畜牧業(yè)收入水平的關(guān)鍵指標(biāo)，大多數(shù)綿羊品種是單胎，季節(jié)性繁殖，繁殖率低[1]，迫切需要采用兩年三產(chǎn)的繁殖模式。在提高綿羊繁殖效率的實(shí)踐中，對(duì)母羊的研究較多，最常見的方法是利用生殖輔助技術(shù)來改善發(fā)情時(shí)間[2]、增加母羊的排卵次數(shù)[3]和進(jìn)行人工授精[4]。但綿羊的成功繁殖取決于綿羊兩性，獲能、受精和胚胎發(fā)生過程中的失敗可能是公羊精子的原因[5]。研究發(fā)現(xiàn)，其他物種精子中有超過14 000個(gè)轉(zhuǎn)錄本在受精時(shí)被轉(zhuǎn)移到卵子中，這些轉(zhuǎn)錄影響早期胚胎發(fā)育和受孕是否成功，Hodge等[6]收集了3個(gè)綿羊品種的精液，在不同品種和射精質(zhì)量對(duì)比中共鑒定出754個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)，這些基因在維持精子發(fā)生、受精、受孕、胚胎發(fā)育和后代生產(chǎn)性能中發(fā)揮著重要作用。睪丸是產(chǎn)生精子和分泌雄激素的重要器官，睪丸發(fā)育和精子發(fā)生是一個(gè)高度復(fù)雜和精確的過程，在發(fā)育過程中睪丸的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了一系列的變化[7-8]。隨著睪丸大小的改變，產(chǎn)生精子的效率也會(huì)改變。營(yíng)養(yǎng)不足影響性成熟雄性睪丸質(zhì)量，降低生精效率和精子運(yùn)動(dòng)速度，并增加性成熟雄性綿羊的精子DNA損傷[9]。此外，睪丸發(fā)育和精子發(fā)生主要受mRNA調(diào)控，這是動(dòng)態(tài)并具有階段性的[10]。蛋白質(zhì)是一切生物的物質(zhì)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction，PPI)在任何生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝中都起著極其重要的作用，即使在單個(gè)細(xì)胞也是如此[11]，PPI通過連接相關(guān)的蛋白質(zhì)，在每個(gè)單細(xì)胞中啟動(dòng)各種功能或結(jié)構(gòu)蛋白的作用[12]。Jansen等[13]使用貝葉斯網(wǎng)絡(luò)方法預(yù)測(cè)全基因組酵母中的PPI，用串聯(lián)親和純化試驗(yàn)(TAP)驗(yàn)證了預(yù)測(cè)，提供了酵母PPI的全面視角。為全面探索綿羊睪丸在不同品種、不同營(yíng)養(yǎng)水平和不同發(fā)育階段差異基因及PPI網(wǎng)絡(luò)，本研究使用課題組前期利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法預(yù)測(cè)的綿羊全基因組820 072對(duì)PPI關(guān)系[14]，構(gòu)建睪丸的PPI網(wǎng)絡(luò)，識(shí)別可能調(diào)控綿羊睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的關(guān)鍵基因，以期進(jìn)一步提高綿羊的繁殖效率，為今后的綿羊繁殖研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 綿羊睪丸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲取

綿羊睪丸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于NCBI的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)存儲(chǔ)庫(kù)SRA(sequence read archive)，獲取碼：PRJEB19199、PRJNA282344和PRJNA421437，共獲得74個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括50只特克塞爾羊與蘇格蘭黑頭羊雜交后代(TB)、16只澳洲美利奴綿羊(8只在65 d內(nèi)增重10%的高飼糧綿羊(M+)和8只在65 d內(nèi)減重10%的低飼糧綿羊(M-))、9只不同發(fā)育階段的小尾寒羊(ST，2、6和12月齡各3只)。

1.2 睪丸中基因表達(dá)量的計(jì)算

利用SRAtoolkit軟件的fast-dump參數(shù)將高通量測(cè)序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)閒astq文件，利用FastQC軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，使用Trimmomatic軟件過濾接頭、低質(zhì)量和未知堿基數(shù)目過多的reads，獲得高質(zhì)量的clean data；利用Hisat2軟件將clean data與綿羊參考基因組(Oar_v4.0)比對(duì)，利用Stringtie軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行組裝，之后采用R軟件的Ballgown包計(jì)算基因在每個(gè)樣本中的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量；使用FPKM(Fragment Per Kilobase of per Million mapped reads)值來衡量基因的表達(dá)水平。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因的選擇與分析

PPI數(shù)據(jù)集來自于課題組前期采用隨機(jī)森林(random forest,RF)和十折交叉驗(yàn)證法構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型，對(duì)28 592個(gè)綿羊蛋白質(zhì)最終預(yù)測(cè)到820 072對(duì)蛋白質(zhì)具有互作關(guān)系[14]。將820 072對(duì)互作關(guān)系中的睪丸表達(dá)基因和睪丸DEGs使用Cytoscape軟件(version 3.7.2)構(gòu)建睪丸PPI網(wǎng)絡(luò)。 使用Cytoscape軟件中的MCODE(molecular complex detection)插件[15]對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行密度聚類，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中最重要的節(jié)點(diǎn)和集合(cluster)，PPI網(wǎng)絡(luò)中選擇集合標(biāo)準(zhǔn)如下：Degree Cutoff≥2;Node Score Cutoff=0.2;K-core≥2;Max Depth=100。

1.4 睪丸DEGs分析

綿羊睪丸DEGs數(shù)據(jù)集來自3類：①不同綿羊品種(8只M+和8只TB綿羊共16個(gè)RNA-Seq)，使用R語言limma軟件包對(duì)2個(gè)品種(M+vsTB)進(jìn)行DEGs分析，在差異基因檢測(cè)過程中，將log2|FoldChange|≥1且P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)；②通過文獻(xiàn)挖掘16只不同飼喂?fàn)I養(yǎng)水平的澳洲美利奴綿羊(M+vsM-)[16]；③9只不同發(fā)育階段(2、6、12月齡)ST，分別代表睪丸發(fā)育過程中性成熟前、性成熟、性成熟后3個(gè)階段[17]。

1.5 構(gòu)建加權(quán)綿羊睪丸差異基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(weight gene co-expression network analysis,WGCNA)[18]，為減少因測(cè)序批次不同帶來的誤差，選取同一批次的樣本進(jìn)行WGCNA分析，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的2 058個(gè)DEGs表達(dá)量來自8個(gè)M+樣本。采用分層聚類和動(dòng)態(tài)樹切割算法對(duì)模塊進(jìn)行識(shí)別，最小模塊數(shù)設(shè)置為30個(gè)基因，并將合并高度相似的模塊的最小高度設(shè)置為0.25。

1.6 功能富集分析

為了研究模塊及其基因潛在功能，使用在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Metascape (https:∥metascape.org/)對(duì)所選模塊中的基因進(jìn)行富集分析，并使其服從GO功能和KEGG通路富集分析，P<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)(Min Overlap=3，Min Enrichment=1.5)，利用Cytoscape插件AutoAnnotate自動(dòng)識(shí)別基因集簇,并對(duì)基因集進(jìn)行注釋。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊睪丸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.1.1 睪丸表達(dá)基因分析 通過對(duì)74個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，共鑒定到18 650個(gè)睪丸表達(dá)基因。為降低基因表達(dá)的假陽性，篩選3%的樣本中FPKM≠0，且至少有一個(gè)樣本FPKM≥3，最終獲得11 884個(gè)基因用于后續(xù)分析，其中425個(gè)基因位于X染色體，11 150個(gè)基因位于常染色體，309個(gè)為“unplaced”。

2.1.2 睪丸PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對(duì)睪丸中最終獲得的11 884個(gè)基因在820 072對(duì)互作關(guān)系中提取PPI，僅有8 291個(gè)基因獲得12 621個(gè)蛋白質(zhì)(節(jié)點(diǎn)，Node)，產(chǎn)生237 366對(duì)PPI(邊，Edge)，占綿羊總PPI的28.9%，并構(gòu)建237 366對(duì)的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖1A)。對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行MCODE分析，共確定366個(gè)集合，其中集合1的分值最大為142.69，且關(guān)系對(duì)最多，是由200個(gè)Nodes和18 535個(gè)Edges構(gòu)成；集合7中Nodes最多為411個(gè)，對(duì)排名前100的集合繪制柱狀圖(圖1B)。

2.2 綿羊睪丸DEGs分析

2.2.1 綿羊睪丸DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 不同綿羊品種(M+vsTB)共獲得735個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因324個(gè)，下調(diào)基因411個(gè)；不同營(yíng)養(yǎng)飼喂水平(M+vsM-)共獲得2 243個(gè)DEGs；不同發(fā)育階段共獲得13個(gè)DEGs。綜上，去除重復(fù)的基因后共獲得2 058個(gè)綿羊睪丸DEGs。對(duì)2 058個(gè)DEGs在237 366對(duì)PPI中提取互作關(guān)系，構(gòu)建差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)僅有1 644個(gè)DGEs對(duì)應(yīng)2 020個(gè)蛋白質(zhì)，產(chǎn)生46 169對(duì)PPI，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行MCODE分析，確定了87個(gè)集合(圖2)。選擇前4個(gè)得分高的集合，集合1得分最高為25.203，有13個(gè)基因；集合2得分為8.759，有26個(gè)基因；集合3得分為8.605，有45個(gè)基因；集合4得分為8.125，有12個(gè)基因(圖3)。

A,睪丸DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)；B,PPI蛋白集合邊、點(diǎn)統(tǒng)計(jì)A,PPI network of testis DEGs;B,Nodes and Edges counts of PPI圖2 睪丸DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析Fig.2 PPI network analysis of testis DEGs

A～D，集合1～4代表PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因A-D，Cluster 1-4 represented the core gene of PPI network圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)MCODE分析Fig.3 PPI network MCODE analysis

2.2.2 構(gòu)建加權(quán)綿羊睪丸DEGs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò) 對(duì)2 058個(gè)DEGs進(jìn)行WGCNA分析，以確定數(shù)據(jù)集中的共表達(dá)基因，參數(shù)設(shè)置為：beta=18，R2>0.8。根據(jù)基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)度的聚類，聚類度較高的基因被分配到一個(gè)模塊中，不同顏色代表不同的模塊，而灰色模塊內(nèi)基因代表其相關(guān)性較低，無法被分配到其他模塊，不進(jìn)行后續(xù)分析，本研究共獲得7個(gè)共表達(dá)模塊(圖4A)，模塊中的基因數(shù)目為51～929個(gè)(圖4B)。

A，基因平均連鎖層次聚類樹狀圖；B，模塊中的基因數(shù)量，模塊由直方圖顏色指定A,Average linkage hierarchical clustering dendogram of the genes；B,The number of genes in the module，modules were designated by color histogram圖4 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Weighted gene coexpression network analysis

2.2.3 DEGs功能富集分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)探索模塊的功能和途徑，Blue模塊共富集到106個(gè)功能術(shù)語，主要參與雄性生殖系統(tǒng)相關(guān)的功能，包括雄性配子產(chǎn)生(gamete generation)、繁殖(fertilization)、精子發(fā)生(spermatogenesis)、鞭毛運(yùn)動(dòng)(cilium movement)、細(xì)胞周期的過渡(cell cycle transition)、AMPK信號(hào)通路(AMPK signaling pathway)等。使用Cytoscape插件AutoAnnotated可視化網(wǎng)絡(luò)，把相似度>0.3的功能術(shù)語用邊連接，共產(chǎn)生14個(gè)功能集合術(shù)語，富集網(wǎng)絡(luò)圖顯示了功能集合內(nèi)和集合間功能富集結(jié)果的相似性，網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)功能術(shù)語，邊代表功能之間的連接關(guān)系，同一顏色節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)功能集合富集的過程，發(fā)現(xiàn)它們高度連接并聚成一個(gè)完整的網(wǎng)絡(luò)(圖5)，其中配子產(chǎn)生(gamete generation)包括：生殖細(xì)胞發(fā)育(germ cell development)、精子發(fā)生(spermatogenesis)、精子細(xì)胞分化(spermatid differentiation)、精子發(fā)育(spermatid development)、雄性配子產(chǎn)生(male gamete generation)和多細(xì)胞生物體內(nèi)參與生殖的細(xì)胞過程(cellular process involved in reproduction in multicellular organism)。表明Blue模塊內(nèi)基因是參與精子發(fā)生和精子細(xì)胞發(fā)育過程的重要的基因集合。

圖5 睪丸差異基因富集結(jié)果全局網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Global network diagram of testicular DEGs enrichment result

2.2.4 關(guān)鍵基因的篩選 對(duì)2 058個(gè)DEGs通過PPI網(wǎng)絡(luò)的MCODE和WGCNA聯(lián)合分析，考慮到精子發(fā)生和精子細(xì)胞的發(fā)育過程相關(guān)基因主要分布在Blue模塊，因此利用Blue模塊內(nèi)基因和PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵的4個(gè)集合，確定了25個(gè)基因(表1、圖6)，發(fā)現(xiàn)僅來自不同營(yíng)養(yǎng)水平的基因有19個(gè)：基質(zhì)重塑相關(guān)8(matrix remodeling associated 8,MXRA8)、富含亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域3(leucine rich repeats and immunoglobulin like domains 3,LRIG3)、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子2(neural cell adhesion molecule 2,NCAM2)、絲氨酸/蘇氨酸激酶17b(serine/threonine kinase 17b,STK17B)、V-集和跨膜結(jié)構(gòu)域(V-set and transmembrane domain containing,VSTM4)、恩貝酸(embigin,EMB)蛋白、免疫球蛋白超家族成員3(immunoglobulin superfamily member 3,IGSF3)、CDC樣激酶(CDC like kinase 4,CLK4)、VRK絲氨酸/蘇氨酸激酶2(VRK serine/threonine kinase 2,VRK2)、淀粉樣前體蛋白(amyloid beta precursor protein,APP)、磷脂酰肌醇-4-磷酸3-激酶催化亞單位2β(phosphatidylinositol-4-phosphate 3-kinase catalytic subunit type 2 beta,PIK3C2B)、尼沙林(nischarin,NISCH)、分揀微管連接蛋白2(sorting nexin 2,SNX2)、紅細(xì)胞膜帶4.2蛋白(erythrocyte membrane protein band 4.1 like 2,EPB41L2)、SHC適配器蛋白(SHC adaptor protein 4,SHC4)、小核糖核蛋白多肽B2(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide B2,SNRPB2)、SRA莖環(huán)相互作用的RNA結(jié)合蛋白(SRA stem-loop interacting RNA binding protein,SLIRP)、RNA結(jié)合基序單鏈相互作用蛋白2(RNA binding motif single stranded interacting protein 2,RBMS2)和RNA結(jié)合基序蛋白46(RNA binding motif protein 46,RBM46)；僅來自不同品種的基因有4個(gè)：生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白14(growth factor receptor bound protein 14,GRB14)、酪氨酸激酶2(tyrosine kinase 2,TYK2)、異種核糖核蛋白A1樣 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1-like,LOC101109899)和ELAV類RNA結(jié)合蛋白1(ELAV like RNA binding protein 1,ELAVL1)；來自不同營(yíng)養(yǎng)水平和品種的基因有2個(gè)：受體酪氨酸激酶3(receptor tyrosine kinases3,TYRO3)和肝細(xì)胞黏附因子(hepatic and glial cell adhesion molecule,HEPACAM)。25個(gè)基因分布于13條染色體上，且各基因間存在互作關(guān)系，如SLIRP與LOC101109899基因、RBM46、RBMS2和ELAVL1基因存在互作關(guān)系。

表1 Blue模塊25個(gè)關(guān)鍵基因

最外圈表示綿羊全基因組27條染色體的編號(hào)與長(zhǎng)度，格越長(zhǎng)表示染色體越長(zhǎng)，同時(shí)外圈展示了25個(gè)關(guān)鍵基因在染色體上的位置；圈里的熱圖代表關(guān)鍵基因的表達(dá)量，表達(dá)量越高，顏色越深；最內(nèi)圈的連線表示關(guān)鍵基因間互作關(guān)系The outermost ring indicates the number and length of 27 chromosomes in the whole genome of sheep，the longer the grid is,the longer the chromosome length is,meanwhile,the outermost ring shows the location of 25 key genes on the chromosome；The heat map in the circle represents the expression of key genes，the higher the expression,the darker the color；The innermost ring lines represent interactions between key genes圖6 關(guān)鍵基因Circos圖Fig.6 The key genes Circos map

SLIRP基因表達(dá)量最高為100.3，RBM46基因表達(dá)量為42.47，ELAVL1、RBM46和SLIRP基因顯著富集到AMPK信號(hào)通路和芳香族化合物分解代謝過程；TYK2基因表達(dá)量為39.18，主要參與白細(xì)胞介素-12、-23和-27介導(dǎo)的信號(hào)通路；TYRO3基因表達(dá)量為21.54，主要參與配子產(chǎn)生、精子發(fā)生、蛋白磷酸化。

3 討 論

PPI在任何生命的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝中都起著極其重要的作用，睪丸發(fā)育和精子發(fā)生是影響雄性綿羊生育力的重要因素。雖然已經(jīng)有大量關(guān)于睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的研究，但對(duì)睪丸PPI網(wǎng)絡(luò)的研究較少，本研究對(duì)睪丸表達(dá)的11 884個(gè)基因和2 058個(gè)DEGs分別構(gòu)建綿羊PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)睪丸的PPI網(wǎng)絡(luò)可較為緊密地形成一個(gè)大的網(wǎng)絡(luò)，只有少部分關(guān)系稀疏，對(duì)2 058個(gè)DEGs提取互作關(guān)系，僅有1 644個(gè)DGEs對(duì)應(yīng)2 020個(gè)蛋白質(zhì)，產(chǎn)生46 169對(duì)PPI，通過MCODE、WGCNA和Metascape分析，發(fā)現(xiàn)Blue模塊是與精子發(fā)生相關(guān)的基因集。 Silva等[19]構(gòu)建了人類睪丸PPT網(wǎng)絡(luò)，共鑒定出1 778個(gè)蛋白質(zhì)及它們之間的32 187對(duì)相互作用，并有少量孤立的簇；富集分析顯示，最重要的生物學(xué)過程類別都與生殖相關(guān)，如有性生殖(P=3.71E-156)、精子發(fā)生(P=5.36E-147)和受精(P=4.33E-44)，與本研究結(jié)果相近。

睪丸是轉(zhuǎn)錄最復(fù)雜的器官，其表達(dá)的基因數(shù)量是所有哺乳動(dòng)物器官中最多的，據(jù)報(bào)道，睪丸在人和其他物種中廣泛的轉(zhuǎn)錄超過所有蛋白質(zhì)編碼基因的80%，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)基因和基因組的基因間序列，包括假基因和轉(zhuǎn)座因子等，向睪丸的傾斜表達(dá)更為明顯，對(duì)人類和小鼠精子發(fā)生的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，廣泛的轉(zhuǎn)錄是通過轉(zhuǎn)錄掃描機(jī)制來糾正DNA損傷，從而維持雄性生殖系中的DNA序列完整性。在精子發(fā)生過程中表達(dá)的基因在轉(zhuǎn)錄鏈上表現(xiàn)出較低的突變率，且在群體中具有較低的多樣性[20]。Soumillon等[21]對(duì)人、恒河猴、小鼠、負(fù)鼠和雞的不同組織器官進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)睪丸分別表達(dá)20 322、20 078、21 819、18 198、14 574個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，且常染色體蛋白質(zhì)編碼基因在睪丸中的轉(zhuǎn)錄頻率高于其他器官。Clark等[22]對(duì)3頭成年公羊和3頭成年母羊的主要組織和5類細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)有19 921個(gè)基因至少在一個(gè)組織中表達(dá)。本研究通過嚴(yán)格的表達(dá)量篩選最終獲得11 884個(gè)睪丸表達(dá)基因，由于與參考基因組比對(duì)、過濾或表達(dá)量篩選時(shí)參數(shù)和條件與前人不同而產(chǎn)生差異，由此可見睪丸表達(dá)基因較為豐富。

哺乳動(dòng)物睪丸是先天免疫的特殊器官，分泌多種免疫調(diào)節(jié)因子，對(duì)外來和自身抗原耐受[23]，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)在支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞中表達(dá)，在被配體激活后引發(fā)睪丸的先天免疫，Tyro3基因負(fù)調(diào)控支持細(xì)胞中的TLR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]，降低炎癥因子表達(dá)水平，識(shí)別與結(jié)合凋亡細(xì)胞，控制睪丸對(duì)病原體的先天免疫應(yīng)答[25]。本研究通過MCODE分析發(fā)現(xiàn)，Tyro3基因位于分值最高的集合1，表明其與周邊基因的密集程度很高，處于關(guān)鍵地位，且其在不同營(yíng)養(yǎng)水平和不同品種組都是差異基因，表明其在精子發(fā)生中可能起關(guān)鍵作用。通過功能富集分析發(fā)現(xiàn),Tyro3基因主要參與配子產(chǎn)生、精子發(fā)生、蛋白磷酸化等生物學(xué)過程。唐紅梅[26]研究發(fā)現(xiàn)，Tyro3基因在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)、免疫、生殖和血管等組織中廣泛表達(dá)，并在神經(jīng)發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、精子發(fā)生、NK細(xì)胞分化、血小板功能及血管發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。

ELAVL1基因位于1號(hào)染色體上，又名HuR或Hua，與mRNA的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性。Ghosh等[27]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠出生后ELAVL1基因的缺失可導(dǎo)致造血器官萎縮、腸絨毛丟失、阻塞性小腸炎，并在10 d內(nèi)死亡。Chi等[28]對(duì)小鼠敲除和過表達(dá)HuR基因發(fā)現(xiàn)，HuR基因在原始生殖細(xì)胞中的失活與正常的減數(shù)分裂后細(xì)胞形成和精子細(xì)胞成熟是矛盾的，此外，在圓形精子細(xì)胞中過表達(dá)HuR基因延緩了精子細(xì)胞的分化，敲除ELAVL1基因使生殖細(xì)胞分化缺陷、精子完全失活，導(dǎo)致雄性不育[29]。本研究中，ELAVL1基因處于集合4，主要參與AMPK信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，在支持細(xì)胞中AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)能量代謝，連接復(fù)合體的穩(wěn)定性和增殖，一旦平衡被打破，睪丸的微環(huán)境和精子的質(zhì)量都會(huì)受到影響，如在α1 AMPK整體敲除小鼠中，精子表現(xiàn)為頭部異常、鞘彎曲和活動(dòng)能力受損[30]。以上均表明ELAVL1基因與精子發(fā)生有關(guān)。

RBM46基因位于7號(hào)染色體上，是一種新的生殖細(xì)胞特異性因子，可調(diào)節(jié)減數(shù)分裂和細(xì)胞凋亡，在性腺組織的生殖細(xì)胞中特異表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，RBM46基因突變的斑馬魚中，RBM46基因的特異性破壞導(dǎo)致突變體的雄性化和不育，雖然突變體的精原細(xì)胞基本正常，但精子發(fā)生受損，減數(shù)分裂未發(fā)生，表明RBM46基因在斑馬魚生殖細(xì)胞第一次減數(shù)分裂過程中起著至關(guān)重要的作用[31]。Zhai等[32]研究發(fā)現(xiàn)，RBM46基因分布在小鼠胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，通過靶向β-Catenin mRNA降解調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞分化，β-Catenin是Wnt信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵效應(yīng)子，RBM46基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在胚胎干細(xì)胞分化中起重要作用，RBM46基因過表達(dá)導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞向滋養(yǎng)外胚層分化，而敲除RBM46基因?qū)е屡咛ジ杉?xì)胞向內(nèi)胚層分化。本研究中RBM46基因表達(dá)量為42.47，處于集合4，顯著富集到AMPK 信號(hào)通路和芳香族化合物分解代謝過程，并與SLIRP、LOC101109899、RBMS2和ELAVL1基因存在互作關(guān)系，但其調(diào)控分子機(jī)制尚不清楚。SLIRP基因是核受體(NRs)抑制因子，其存在于核內(nèi)與NR靶基因相關(guān)的復(fù)合物中，在骨骼肌、心臟、肝臟和睪丸中表達(dá)量最高[33]，本研究中SLIRP基因表達(dá)量為100.3，與此結(jié)論相一致。 Colley等[34]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除SLIRP基因的純合雄性小鼠與野生型雌性雜交時(shí)，平均產(chǎn)仔數(shù)比野生型雄性和雌性小鼠雜交產(chǎn)仔數(shù)減少了1/3，且敲除小鼠的精子運(yùn)動(dòng)能力明顯低于野生小鼠，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)敲除小鼠精子中段/環(huán)連接處斷裂，線粒體形態(tài)發(fā)生改變，表明SLIRP基因的缺失導(dǎo)致與精子結(jié)構(gòu)和線粒體形態(tài)受損相關(guān)的弱精子癥。Shan等[35]研究表明，SLIRP基因調(diào)節(jié)雄性繁殖能力且與精子運(yùn)動(dòng)呈正相關(guān)，與正常精子相比，弱精子癥患者精子中SLIRP基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量降低，氧化損傷增加，能量代謝降低。

TYK2基因位于5號(hào)染色體上，是JAK激酶蛋白家族中第一個(gè)鑒定的成員，JAK家族還有3個(gè)成員：JAK1、JAK2和JAK3[36]。TYK2基因在細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著關(guān)鍵作用，廣泛參與免疫、細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化、遷移和細(xì)胞凋亡等過程[37]，本研究中TYK2基因顯著富集到參與白細(xì)胞介素-12、-23和-27介導(dǎo)的信號(hào)通路，與前人研究結(jié)果相似。D’Cruz等[38]通過免疫印跡和激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)到JAK家族的4個(gè)成員中僅TYK2基因在人精子尾部中表達(dá)，表明其可能調(diào)節(jié)精子活力。 本試驗(yàn)中TYK2基因表達(dá)量為39.18，處于集合2，與RBM46、SLIRP等基因存在互作關(guān)系，但未對(duì)JAK1、JAK2和JAK3基因在綿羊精子尾部的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究通過對(duì)綿羊睪丸表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，以及不同營(yíng)養(yǎng)水平、不同品種、不同發(fā)育階段差異基因的整合與構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，最終找到與睪丸精子發(fā)生有互作關(guān)系的25個(gè)基因，進(jìn)一步了解了睪丸的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，明確了影響綿羊精子生成中的關(guān)鍵因素，為綿羊繁殖研究提供了理論依據(jù)。