張大靈　王源元　劉莉　周嫣　李華

[摘要]目的：研究上調(diào)Notch胞內(nèi)區(qū)域（Notch Intracellular Domain，NICD）對人牙周膜干細胞增殖及遷移能力的影響。方法：將細胞分為上調(diào)組、對照組及空白組，使用MTT比色法檢測細胞增殖能力，流式細胞儀檢測細胞凋亡能力，采用細胞劃痕實驗檢測細胞遷移情況，并使用Western blot檢測人牙周膜干細胞中Wnt/β-catenin信號通路蛋白（TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Caspase-3、Bax、Bcl-2）表達量。結果：對照組各時間點的人牙周膜干細胞增殖率、堿性磷酸酶活性、遷移、黏附個數(shù)、TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達量均低于空白組，且凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表達量高于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。上調(diào)組各時間點人牙周膜干細胞增殖率、堿性磷酸酶活性、遷移、黏附個數(shù)、TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達量均高于空白組和對照組，且凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表達量均低于空白組和對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：上調(diào)NICD基因能促進人牙周膜干細胞的增殖和遷移，其機制可能與Wnt/β-catenin通路有關。

[關鍵詞]Notch胞內(nèi)結構域;人牙周膜干細胞;增殖;凋亡;遷移;信號通路

[中圖分類號]R781? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）01-0097-05

Effect of Upregulation of NICD on Proliferation and Migration of Human Periodontal Ligament Stem Cells

ZHANG Daling1，WANG Yuanyuan1，LIU Li2，ZHOU Yan1，LI Hua3

（1.Department of Orthodontics，People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530021，Guangxi，China;

2.Department of Stomatology，Affiliated Stomatological Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541000，Guangxi，China;

3.Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Hospital of Stomatology，Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi，China）

Abstract： Objective? To investigate the effect of up regulating Notch intracellular domain （NICD） on the proliferation and migration of human periodontal ligament stem cells. Methods? NICD cells were divided into the up regulation group， the control group and the blank group. MTT colorimetry was used to detect cell proliferation， flow cytometry was used to detect cell apoptosis， cell migration was detected by cell scratch test， and the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway protein in human periodontal ligament stem cells was detected by Western blot （TGF-β、BMP-2， β-caten， LEF-1， Cyclin D1， Caspase-3， Bax， Bcl-2）. Results? The proliferation rate， alkaline phosphatase activity， migration， number of adhesion and TGF-β， BMP-2， β-caten， LEF-1， Cyclin D1， Bcl-2 protein expression of human periodontal ligament stem cells in the control group at each time point were lower than those in the blank group， and the apoptosis rate， the expression of Caspase-3 and Bax protein in the blank group were higher than those in the blank group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The proliferation rate， alkaline phosphatase activity， migration， number of adhesion and TGF-β， BMP-2， β-caten， LEF-1， Cyclin D1， Bcl-2 protein expression of human periodontal ligament stem cells in the up regulation group at each time point were higher than those in the blank group and the control group （P<0.05）. The apoptosis rate， the expression of Caspase-3 and Bax protein in the up regulation group were lower than those in the blank group and the control group （P<0.05）. Conclusion? Upregulation of NICD gene can promote the proliferation and migration of human periodontal ligament stem cells， and its mechanism may be related to Wnt/β-catenin pathway.

Key words： Notch intracellular domain;human periodontal ligament stem cells; proliferation; apoptosis; migration; signaling pathways

慢性牙周炎是常見的一種口腔疾病，可對人們的口腔健康以及生活產(chǎn)生嚴重影響，甚者導致牙齒廢用[1]。其主要特征包括：牙齦出血、不同深度的牙周袋、牙齒松動、牙槽骨吸收等，對人類牙齒健康帶來嚴重損害[2]。牙周膜干細胞能夠通過維持自身數(shù)量來實現(xiàn)自我更新能力，經(jīng)誘導可分化為成骨樣細胞和脂肪樣細胞[3]。其是一種位于口腔位置的間充質(zhì)干細胞，是由釉基質(zhì)蛋白主要組成。有研究表明[4]，Notch胞內(nèi)區(qū)域（Notch intracellular domain，NICD）能夠促進牙周組織的再生修復作用，但目前對于NICD作用調(diào)控牙周膜干細胞增殖、遷移機制研究較少，且尚無統(tǒng)一定論，因此在本研究中，上調(diào)NICD的表達研究其對牙周膜干細胞增殖、遷移的影響，以尋找其作用機制，為臨床上人牙周膜干細胞的研究提供新的方向。

1? 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究細胞：人牙周膜干細胞NICD（上海研生實業(yè)有限公司），本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑：兔抗人TGF-β抗體（武漢菲恩生物科技有限公司）;大鼠抗小鼠BMP-2抗體、LEF-1抗體、Cyclin D1抗體（上海恒斐生物科技有限公司）;人抗大鼠β-caten抗體（上海優(yōu)予生物科技有限公司）;大鼠抗小鼠Caspase-3抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體（上海科敏生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染及分組：取人牙周膜干細胞，在培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，當其融合率為75%左右時，使用胰酶進行消化，消化完成后則終止消化（在新鮮培養(yǎng)基中），隨之便用細胞計數(shù)法測量終止消化后的細胞，測量其密度后，將其種植在六孔板中，每個板中種植4×105個細胞，加至新鮮的培養(yǎng)基中（3ml），進行培養(yǎng)，在溫度為37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，當期融合率達到40%～80%時，取1.5μl的放入100μl的雙抗培養(yǎng)基中（去除血清），并進行完全混合，混合后進行離心處理，放置EP管底，并在管內(nèi)加入12μl的PolyFect Reagent，進行上下重復顛倒，反復5次后，進行混合處理，然后放置室內(nèi)靜置，時間為5～10min，對轉(zhuǎn)染復合物起到促進作用，將新鮮培養(yǎng)基中加入六孔板中的培養(yǎng)基（3ml），將600μl培養(yǎng)基加入EP管中，上下顛倒2次，放入六孔板，水平晃蕩，然后培養(yǎng)24h后，換液處理。再次培養(yǎng)24h，倒置，使用熒光顯微鏡進行觀察。NICD受體基因序列根據(jù)質(zhì)粒特點進行引物設計，引入SacⅠ酶切位點（由上海生工生物工程技術服務有限公司完成），構建NICD上調(diào)慢病毒載體，分為上調(diào)組。對照組中加入一段無義序列空白載體;空白組只加生理鹽水。

1.2.2 熒光定量qRT-PCR檢測NICD的水平：采集樣本5ml，置于一次性真空無抗凝劑的采血管中，使用Ficoll液分離單個核細胞。TRIzol提取細胞RNA，經(jīng)過電泳檢測RNA并定量，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。之后進行實時熒光定量PCR實驗，探針或SYBR 反應體系25μl，反應條件滿足：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)，設置標準組和空白對照。將PCR反應實驗前3～15個循環(huán)熒光信號作為熒光本底信號，調(diào)節(jié)基線，采用2-△△Ct分析NICD基因表達。NICD引物序列：上游cDNA為模板、GAPDH為內(nèi)參照，用以下引物（上游：5’-CGCGGATCCATGCACCTGGATGCCGCTGACCTG-3’;下游：5’-ACGTCTAGACTTGAAGGCCTCCGGAATGCG-3’）。

1.2.3 堿性磷酸酶活性檢測：取第三代成長較好細胞hPDLSCs消化離心制成細胞懸液，按1×104 cell/ml的密度接種于96孔板中，24 h后，細胞貼壁后將培養(yǎng)液摒棄，PBS連續(xù)沖洗3次，在每孔180 μl中加無酚紅成骨誘導培養(yǎng)液。各組分別在成骨誘導培養(yǎng)1、3、5、7 d后停止培養(yǎng)，使用PBS反復沖洗后按堿性磷酸酶活性試劑盒進行操作，酶標儀檢測各孔520 nm波長處的吸光度值，取平均值。

1.2.4 人牙周膜干細胞增殖能力檢測：MTT比色法檢測三組人牙周膜干細胞增殖，在96孔培養(yǎng)板中對人牙周膜干細胞懸液進行接種，加入90μl細胞懸液放置每個孔內(nèi)，將三組不同濃度曲古霉素A培養(yǎng)液劃分為24 h、48h和72 h，并設置5個復孔。在加入10 μl的培養(yǎng)液中放入不同濃度的曲古霉素A進行培養(yǎng)。等達到相應時間后，加入150 μl的DMSO，搖晃10 s，增殖率=（細胞OD值/參照值-1）×100%。

1.2.5 人牙周膜干細胞凋亡能力檢測：使用流式細胞儀對三組人牙周膜干細胞凋亡進行檢測，對細胞進行傳代處理，至5孔板中，在5% CO2、37 ℃的環(huán)境下對其進行培養(yǎng)，在24 h、48 h、72 h后，加入蛋白酶依次進行消化處理和離心處理，使用離心機將其離心，轉(zhuǎn)速為2 000 r/min，離心時間5 min，收集離心后的細胞，使用PBS沖洗兩次，每次3 min，然后再次離心處理和收集細胞，加入1MlPI，放置1h（避光），之后用特異性熒光進行標記，標記后在流動期間發(fā)射光子，利用發(fā)光信號對光子數(shù)值進行檢測，最后使用流式細胞儀對人牙周膜干細胞凋亡進行檢測。

1.2.6 人牙周膜干細胞遷移能力檢測：將人牙周膜干細胞NICD在18板孔內(nèi)進行接種，在細胞增長到90%時，垂直劃出三條直線，使用100μl槍頭。采用PBS緩沖液連續(xù)沖洗3次，加0.5%血清培養(yǎng)基24h，在倒置顯微鏡下觀察細胞遷移狀況。

1.2.7 人牙周膜干細胞黏附能力檢測：在96孔板中加入30 mg/L的纖維和50μl連接蛋白，過夜風干;通過3% BSA PBS液化，封存2 h;每孔中加RPM-1640清洗，將細胞稀釋5×105個/毫升置于200 μl 10% FBS溶液中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h;采用PBS反復清兩次;每孔中100 μl無血清培養(yǎng)基，20 μl MTS（5 g/L）溶液;拍照，再次進行4 h培養(yǎng)，棄上清，加入100 μl的DMSO，晃蕩10 min，溶解后，通過酶標儀觀察490 nm波長的吸光值。

1.2.8 Western blot檢測：將采集到的標本10 000×g離心處理10 min，對上清液進行提取后，BCA進行蛋白定量檢測，在2×SDS凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在100℃環(huán)境中加熱5 min有助于蛋白發(fā)生變性。凝膠電泳完、轉(zhuǎn)膜，取膜，4℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時間為1h，將一抗使用0.05%～0.1% TBST給予稀釋（TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Caspase-3、Bax、Bcl-2一抗為1：1 000），4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次為5 min，二抗被0.05%～0.1% TBST稀釋（1：10 000），搖動孵育時間為 1h，再次采用TBST連續(xù)洗膜3次，處理時間為5 min。DAB顯色，定量分析蛋白表達情況。以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析處理。計量資料采用均數(shù)±標準差（xˉ±s）描述，多組間比較采用F檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1 三組NICD表達量比較：上調(diào)組NICD表達量高于空白組和對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;空白組NICD表達量高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1～2。

2.2 三組人牙周膜干細胞成骨誘導后不同時間點堿性磷酸酶活性比較：如圖3所示，對照組堿性磷酸酶活性低于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;上調(diào)組堿性磷酸酶活性高于空白組和對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 三組人牙周膜干細胞不同時間點增殖、凋亡情況比較：如圖4所示，對照組各時間點人牙周膜干細胞增殖率低于空白組，且人牙周膜干細胞凋亡率高于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;上調(diào)組各時間點人牙周膜干細胞增殖率高于空白組和對照組，且凋亡率低于空白組和對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.4 三組人牙周膜干細胞遷移、黏附情況比較：如圖5～8所示，上調(diào)組人牙周膜干細胞遷移、黏附個數(shù)均高于對照組及空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.5 三組人牙周膜干細胞中Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達量比較：如圖9～10所示，對照組人牙周膜干細胞中TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達量均低于空白組，且Caspase-3、Bax蛋白表達量高于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;上調(diào)組人牙周膜干細胞中TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達量均高于空白組和對照組，且Caspase-3、Bax蛋白表達量低于空白組和對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3? 討論

有學者指出，將牙周膜干細胞移植到牙槽骨缺陷區(qū)，可促使牙周組織的再生，從而為牙周干細胞的研究提供了新的理論依據(jù)[5]。Nagata M等[6]研究中認為培養(yǎng)牙周膜干細胞可增強牙周再生。牙周膜干細胞能夠分化成為牙骨質(zhì)和牙周膜樣組織等，在維持牙周組織健康起著重要作用[7]。有研究表明[8]，轉(zhuǎn)錄激活結構區(qū)和CDC10重復序列與胞內(nèi)區(qū)激活有關，且能夠改變引起轉(zhuǎn)錄活性的增強，而RAM結構蛋白域能夠促進NICD與轉(zhuǎn)錄因子更好地結合[9]。

TGF-β能夠在成熟有機體和發(fā)育中參與細胞生長、分化、凋亡過程，維持細胞動態(tài)平衡，能夠與Ⅱ型受體結合而形成的受調(diào)控的SMAD蛋白[10-11]。有研究表明，BMP-2可通過轉(zhuǎn)染基因上調(diào)牙周膜干細胞中的NICD等基因的表達[11]。BMP-2可通過激活Wnt信號通路中β-catenin通路來促進牙周膜干細胞的分化和遷移，有研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2還可與其他因子相互作用[12]。LEF-1是Wnt通路中重要的調(diào)節(jié)因子，能夠通過與DNA的結合，激活轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控基因的表達[13]。Cyclin D1是一種周期性蛋白，能夠調(diào)控細胞周期的轉(zhuǎn)化，在調(diào)節(jié)細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換中也發(fā)揮著重要作用。其還能夠促進細胞增殖，能夠激活G1周期蛋白依賴性激酶CDK4。有研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1除了能夠促進細胞分裂外還能夠促進基因轉(zhuǎn)錄的功能。Cyclin D1屬于細胞周期依賴性激酶CDKs的調(diào)控者，不同周期蛋白表現(xiàn)其不同特異性和降解性，有益于每個有絲分裂時間的協(xié)調(diào)性[14]。Caspase-3屬于Caspase家族中的一員，Caspase-3是凋亡反應中最為主要的凋亡蛋白[15]。Caspase-8參與執(zhí)行凋亡，誘導Caspase-3激活，使Caspase啟動聯(lián)級反應，活化執(zhí)行Caspase裂解特異性底物致使細胞凋亡。有研究表明，降低激活Caspase-3可有效抑制細胞凋亡的發(fā)生[16]。Bax是Bcl-2家族中重要促凋亡蛋白，是線粒體膜上離子通道的主要組成部分，誘導細胞色素C進入線粒體，激活Caspase-9，然后進一步激活Caspase-3，促進細胞凋亡[17-18]。Bcl-2具有抗凋亡的作用，能夠阻止線粒體細胞色素C釋放發(fā)揮其作用。有研究表明，Bcl-2能夠促進細胞增殖和細胞周期，過表達則可抑制細胞凋亡，Bax能夠?qū)cl-2抑制凋亡起對抗作用[19]。Bcl-2/Bax屬于一個平衡體系，Bcl-2過多時則可抑制凋亡，而Bax過多時，則可促進凋亡[20]。Wnt信號通路是生物過程中極為保守的一條通路，主要存在于細胞核生物代謝活動中。在本文中上調(diào)NICD受體基因，將Wnt/β-catenin信號通路激活，β-catenin蛋白能夠在細胞內(nèi)聚集，并與細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結合，調(diào)節(jié)下游因子Cyclin D1、LEF-1、Caspase-3、Bax、BMP-2等表達，進一步調(diào)控干細胞的增殖、凋亡、遷移等一系列活動。

綜上所述，上調(diào)人牙周膜干細胞NICD，可有效促進人牙周膜干細胞的增殖和遷移，其機制可能與Wnt/β-catenin通路激活，調(diào)控其下游因子有關。

[參考文獻]

[1]Cardoso E M，Reis C，Manzanares-Céspedes M C.Chronic periodontitis， inflammatory cytokines， and interrelationship with other chronic diseases[J].Postgrad Med，2018，130（1）：98-104.

[2]Smith M M，Knight E T，Al-Harthi L，et al.Chronic periodontitis and implant dentistry[J].Periodontol 2000，2017，74（1）： 63-73.

[3]Tomokiyo A，Wada N，Maeda H.Periodontal ligament stem cells： regenerative potency in periodontium[J].Stem Cells Dev，2019，28（15）： 974-985.

[4]Onizuka S，Iwata T.Application of periodontal ligament-derived multipotent mesenchymal stromal cell sheets for periodontal regeneration[J].Int J Mol Sci，2019，20（11）： 2796.

[5]Trubiani O，Pizzicannella J，Caputi S，et al.Periodontal ligament stem cells： current knowledge and future perspectives[J].Stem Cells Dev，2019，28（15）：995-1003.

[6]Nagata M，Iwasaki K，Akazawa K，et al.Conditioned medium from periodontal ligament stem cells enhances periodontal regeneration[J].Tissue Eng Part A，2017，23（9-10）：367-377.

[7]Zhang L N，Wang X X，Wang Z，et al.Berberine improves advanced glycation end products induced osteogenic differentiation responses in human periodontal ligament stem cells through the canonical Wnt/β catenin pathway[J].Mol Med Rep，2019，19（6）：5440-5452.

[8]Boriushkin E，Zhang H，Becker M，et al.Kruppel-like factor 4 regulates developmental angiogenesis through disruption of the RBP-J-NICD-MAML complex in intron 3 of Dll4[J].Angiogenesis，2019，

22（2）：295-309.

[9]Binesh A，Devaraj S N，Halagowder D.Molecular interaction of NFκB and NICD in monocyte-macrophage differentiation is a target for

intervention in atherosclerosis[J].J Cell Physiol，2019，234（5）：

7040-7050.

[10]Vander Ark A，Cao J，Li X.TGF-β receptors： In and beyond TGF-β signaling[J].C12ell Signal，2018，52：112-120.

[11]Tanyildiz H G，Kaygusuz G，Unal E，et al.The prognostic importance of TGF-β， TGF-β receptor， and fascin in childhood solid tumors[J].Pediatr Hematol Oncol，2017，34（4）：238-253.

[12]Khalilzadeh B，Shadjou N，Kanberoglu G S，et al.Advances in nanomaterial based optical biosensing and bioimaging of apoptosis via caspase-3 activity： a review[J].Mikrochim Acta，2018，185（9）：

434-434.

[13]Shah A A，Oliai B R，Bishop J A.Consistent LEF-1 and MYB immunohistochemical expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma： a potential diagnostic pitfall[J].Head Neck Pathol，2019，13（2）：220-224.

[14]Song J Y，Song L，Herrera A F，et al.Cyclin D1 expression in peripheral T-cell lymphomas[J].Mod Pathol，2016，29（11）：1306-1312.

[15]Tammaro S，Simoniello P，Ristoratore F，et al.Expression of Caspase 3 in ovarian follicle cells of the lizard Podarcis sicula[J].Cell Tissue Res，2017，367（2）：397-404.

[16]Liu F S，Zhou F Y，Zhang Y，et al. Effects of acupotomy therapy on mRNA expressions of Bcl-2， Bax， Caspase-3 in posterior cervical extensor muscles in cervical spondylosis rabbits[J].Zhen Ci Yan Jiu，2017，42（6）：514-517.

[17]Tian Z Y，Li S M，Guo H，et al.Acupuncture of intraorbital and extraorbital acupoints reduces apoptosis of retinal ganglion by down-regulating expression of Caspase-3 and ratio of Bax/Bcl-2 in rabbits with nonarteritis anterior ischemic optic neuropathy[J].Zhen Ci Yan Jiu，2019，44（4）：282-287.

[18]Subbarayan S，Subramanian S，Senthil Kumar N.Recombinant Pierisin-5 induces apoptosis and differential expression of Bcl-2， Bax， and p53 in human cancer cells[J].DNA Cell Biol，2019，38（8）：773-785.

[19]Saleem M，Asif J，Asif M，et al.Amygdalin from apricot kernels induces apoptosis and causes cell cycle arrest in cancer cells： an updated review[J].Anticancer Agents Med Chem，2018，18（12）：

1650-1655.

[20]Qiu X G，Chen Y D，Yuan J，et al.Functional BCL-2 rs2279115 promoter noncoding variant contributes to glioma predisposition， especially in males[J].DNA Cell Biol，2019，38（1）：85-90.

[收稿日期]2020-07-13

本文引用格式：張大靈，王源元，劉莉，等.上調(diào)NICD對人牙周膜干細胞增殖及遷移能力的影響[J].中國美容醫(yī)學，2022，31（1）：97-101.