陳和禾 朱偉新 張夏軍 陳巧鴿 許美飛 祝飛虹

[摘要] 目的 探討隱丹參酮對腦卒中大鼠的保護作用及對PI3K/AKT-eNOS信號通路的影響。 方法 將40只SD大鼠隨機分為對照組、腦卒中模型組、低劑量隱丹參酮組（5 mg/kg）、中劑量隱丹參酮組（15 mg/kg）與高劑量隱丹參酮組（45 mg/kg），每組均8只，采用線栓法建立大鼠腦卒中模型。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠大腦皮質(zhì)和外周血中SOD、MDA及NO水平，Western blot法檢測大鼠腦組織PI3K及AKT的表達，qRT-PCR分析評估Bcl-2，Bax和VEGF的表達水平。 結(jié)果 與對照組相比，腦卒中模型組PI3K磷酸化、VEGF、eNOS、MDA水平增加（P<0.05）;隱丹參酮組PI3K膜易位、AKT磷酸化、VEGF、eNOS、MDA水平減弱（P<0.05）;且與劑量呈負相關(guān)（P<0.05）。與對照組相比，腦卒中組NO、SOD、Bcl-2、Bax水平顯著下降（P<0.05），隱丹參酮組NO、SOD、Bcl-2、Bax水平升高（P<0.05），且與劑量呈正相關(guān)（P<0.05）。 結(jié)論 隱丹參酮對腦卒中大鼠腦組織具有保護作用，其作用機制可能與其抑制PI3K/AKT-eNOS信號通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 腦卒中;隱丹參酮;PI3K/AKT-eNOS信號通路;蛋白質(zhì)印跡法

[中圖分類號] R542.2? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）01-0042-05

The effect of cryptotanshinone on PI3K/AKT-eNOS signaling pathway in stroke rats

CHEN Hehe? ?ZHU Weixin? ?ZHANG Xiajun? ?CHEN Qiaoge? ?XU Meifei? ?ZHU Feihong

Department of Rehabilitation， Jinhua Central Hospital in Zhejiang Province， Jinhua? ?321000， China

[Abstract] Objective To explore the protective effect of cryptotanshinone on stroke rats and its influence on PI3K/AKT-eNOS signaling pathway. Methods Forty SD rats were randomly divided into the control group， the stroke model group， the low-dose cryptotanshinone group （5 mg/kg）， the medium-dose cryptotanshinone group （15 mg/kg）， and the high-dose cryptotanshinone group （45 mg/kg）， with eight rats in each group. The rat stroke model was established by the suture method. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine the levels of SOD， MDA， and NO in rat cerebral cortex and peripheral blood. Western blot method was used to detect the expression of PI3K and AKT in rat brain tissue. The expression of Bcl-2， Bax， and VEGF was evaluated by qRT-PCR analysis. Results Compared with the control group， the levels of PI3K phosphorylation， VEGF， eNOS， and MDA in the stroke model group increased （P<0.05）; the levels of PI3K membrane translocation， AKT phosphorylation， VEGF， eNOS， and MDA in the cryptotanshinone group decreased（P<0.05），and was negatively correlated with dose（P<0.05）. Compared with the control group，the levels of NO， SOD， Bcl-2， and Bax in the stroke group significantly decreased（P<0.05）， and the levels of NO， SOD， Bcl-2， and Bax in the cryptotanshinone group increased（P<0.05）， and were positively correlated with the dose（P<0.05）. Conclusion Cryptotanshinone has a protective effect on the brain tissue of stroke rats， and its mechanism may be related to its inhibition of PI3K/AKT-eNOS signaling pathway.

[Key words] Stroke; Cryptotanshinone; PI3K/AKT-eNOS signaling pathway; Western blot

腦卒中是一種急性腦血管疾病，分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中[1]。腦卒中具有高發(fā)病、高致殘、高死亡的特點，缺血性腦卒中占腦卒中總數(shù)的60%～70%，而由內(nèi)頸動脈或椎動脈閉塞、狹窄引起的出血性腦卒中在40歲以上的患者中有著更高死亡率[2]。丹參用于治療心血管疾病、糖尿病、肝炎、缺血性腦卒中、慢性腎功能衰竭及月經(jīng)紊亂等[3]。隱丹參酮是一種從丹參中提取出的具有多種藥理活性的單體，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗糖尿病及抗肥胖等多種作用[4]。此外，臨床研究[5]表明，隱丹參酮治療急性缺血性腦卒中患者的療效確切、安全、使用方便、耐受性好。細胞試驗表明，隱丹參酮可通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）介導(dǎo)的細胞周期蛋白D1（cyclin D1）表達機制靶點來抑制腦血管內(nèi)皮細胞（endothelial cell，EC）的增殖，這表明隱丹參酮可能對治療腦卒中有一定的作用，但其機制研究甚少[6]。磷脂酰肌醇-3激酶（PI-3K）/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（Akt）通路可保護缺血性腦損傷，內(nèi)皮型NOS（eNOS）是該通路重要靶點，其生成的一氧化氮（NO）具有重要保護作用。鑒于此，本研究建立大鼠腦卒中模型，旨在探討隱丹參酮作為抗腦卒中劑的可行性，并探討其可能的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

本研究共40只SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠，體重140～160 g，購自上海實驗動物中心。本動物實驗在浙江省金華市食品藥品檢驗所實驗動物中心進行。實驗動物許可證號：SYXK（浙）2019-0045。飼養(yǎng)環(huán)境條件為溫度20～26℃，濕度40%～70%，光照12 h、黑暗12 h光暗循環(huán)，大鼠自由飲水、進食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后將其隨機分為對照組（正常大鼠）、腦卒中模型組、低劑量隱丹參酮組（5 mg/kg）、中劑量隱丹參酮組（15 mg/kg）、高劑量隱丹參酮組（45 mg/kg）及陽性對照組（LY294002），不同劑量隱丹參酮組灌胃給予不同濃度的隱丹參酮。本研究所有動物研究方案均通過動物保護和使用委員會（IACUC-20130315-01）批準(zhǔn)。

1.2 動物模型的建立

在灌胃隱丹參酮24 h后采用線栓法建立大鼠腦卒中模型，建立模型前12 h內(nèi)給予大鼠自由飲水、禁食。于大鼠腹膜內(nèi)注射10%水合氯醛（0.35 ml/100 g），成功麻醉后將大鼠以仰臥位固定在平板上，并用碘消毒，在大鼠頸部正中作一切口分離皮下組織與右側(cè)腺體，并于頸總動脈近端部分及外頸動脈遠端部分結(jié)扎，用血管鉗將頸內(nèi)動脈近端部分閉塞，隨后將閉塞線沿著頸總動脈插入頸內(nèi)動脈約18 mm處，直至感覺到阻力即可，結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈的分叉部位，固定閉塞線，縫合頸切口。

1.3 生化分析

采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測大鼠大腦皮質(zhì)和外周血中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde ，MDA）及一氧化氮（nitric Oxide，NO）水平。100 mmol/L Tris-HCl緩沖液處理勻漿組織樣品，4℃以下10 000×g 離心20 min，分離上清液，測定和計算SOD、MDA及NO的含量。試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒上說明操作。

1.4 Western blot檢測

將20 mg大腦皮質(zhì)樣品切成小片，并與250 μl含有0.01%蛋白酶抑制劑混合物的組織細胞裂解緩沖液混合，完全裂解后，4℃下2000×g離心15 min，分離上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)含量。使用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離15 μg組織樣品，并電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，室溫下用5%脫脂乳封閉1 h，隨后與抗磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）（Abcam），磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶（p-PI3K）（Abcam），蛋白激酶B （protein kinase B，AKT）（CST），磷酸化蛋白激酶B p-AKT（CST），一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）（CST），磷酸化一氧化氮合成酶（p-eNOS）（Abcam），B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），（Santa），Bcl-2-Associated X蛋白質(zhì)（Bcl-2-Associated X，Bax）（Santa），血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）（Abcam）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）（CST）等抗體一起孵育，然后室溫下與山羊抗鼠二抗或山羊抗兔二抗孵育1 h，使用增強的化學(xué)發(fā)光儀器拍照檢測蛋白印跡。

1.5 實時熒光定量PCR分析

取適量組織樣品，使用Trizol試劑盒定量提取總RNA，并按試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增，以GAPDH作為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)條件為：95℃下預(yù)變性10 min，95℃下變性15 s，60℃退火/延伸45 s，進行40個循環(huán)。擴增引物見表1。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隱丹參酮對PI3K/AKT信號通路的影響

與對照組相比，腦卒中模型組PI3K磷酸化水平顯著增加，腦卒中可誘導(dǎo)PI3K下游效應(yīng)蛋白明顯磷酸化（P<0.001），且隱丹參酮組PI3K膜易位與AKT磷酸化水平顯著減弱。高劑量隱丹參酮組PI3K膜易位與LY294002組結(jié)果類似，但AKT磷酸化存在顯著差異（P<0.001），且隱丹參酮與劑量呈負相關(guān)。見圖1。

2.2 隱丹參酮對下游效應(yīng)蛋白的影響

如圖2所示，與對照組相比，腦卒中模型組VEGF表達水平顯著增加，隱丹參酮組VEGF表達顯著降低，且與劑量呈負相關(guān)（圖2A、B）;與對照組相比，腦卒中模型組Bcl-2表達水平顯著降低（P<0.001），隱丹參酮組Bcl-2表達水平明顯升高，且與劑量呈正相關(guān);與對照組相比，腦卒中模型組Bax表達水平顯著增加（P<0.001），隱丹參酮組Bax表達水平明顯降低，且與劑量呈負相關(guān)。高劑量隱丹參酮組Bcl-2、Bax表達水平與LY294002組結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 隱丹參酮對NO調(diào)節(jié)的影響

如圖3A所示，與對照組相比，腦卒中模型組大腦皮層與外周血中NO水平均顯著下降，隱丹參酮組NO水平明顯升高，且與劑量呈正相關(guān)，與LY294002組相比無明顯差異;與對照組相比，腦卒中模型組eNOS表達增強，隱丹參酮組eNOS表達減弱。見圖1。

2.4 隱丹參酮對脂質(zhì)過氧化的影響

如圖3B、C所示，與對照組相比，腦卒中模型組大腦皮層與外周血中SOD水平均顯著下降，隱丹參酮組SOD水平明顯升高，且與劑量呈正相關(guān);與對照組相比，腦卒中模型組大腦皮層與外周血中MDA水平均顯著升高，隱丹參酮組MDA水平明顯降低，且與劑量呈負相關(guān)。對照組與LY294002組SOD、MDA水平表達結(jié)果類似。

3 討論

腦卒中是臨床上常見的多發(fā)腦血管疾病，其中以缺血性腦卒中最為常見，約為全部腦卒中的60%～70%，其致殘率、致死率非常高[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實，腦卒中的發(fā)病機制主要包括血管閉塞造成缺血中心區(qū)與半暗區(qū)細胞功能衰竭、興奮性氨基酸毒性、腦組織能量代謝、自由基損傷及神經(jīng)細胞凋亡等多個環(huán)節(jié)[8]。因此，明確其發(fā)病機制及病理生理過程，對腦卒中的治療有著積極的作用。

隱丹參酮是從丹參中提取出來的主要活性成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎及抗菌等多種生理活性[9]。研究證實，隱丹參酮可通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡及抗凋亡細胞信號途徑起到保護神經(jīng)的作用，可降低心肌缺血再灌注損傷，還能夠通過抑制或清除谷氨酸誘導(dǎo)的細胞內(nèi)活性氧生成對皮層神經(jīng)元凋亡有顯著的保護作用[10]。這些均證明隱丹參酮對腦組織具有一定的保護作用，但其在腦卒中的研究較少，為此本研究建立了大鼠腦卒中模型，試圖從作用機制方面解釋其腦卒中腦組織的保護作用。

磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）是一種由趨化因子受體激活的信號傳導(dǎo)酶。先前的一項研究顯示，激動劑與C5a受體結(jié)合可以激活包括PI3K在內(nèi)的多種信號傳導(dǎo)蛋白，PI3K的激活在很大程度上與細胞內(nèi)的底物有關(guān)，如纖維細胞生長因子（FGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、人生長因子（HGF）及血管生成素I（AngI）等均可通過激活受體酪氨酸激酶導(dǎo)致PI3K磷酸化[11]。PI3K激活的結(jié)果在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，其與細胞內(nèi)的信號蛋白AKT及磷酸肌醇依賴性激酶-1（PDK1）結(jié)合，促使PDK1中誘導(dǎo)AKT的Ser308磷酸化，從而導(dǎo)致AKT活化。AKT，也稱之為蛋白激酶B（PKB），是PI3K下游的主要效應(yīng)物，活化的AKT可通過磷酸化多種酶、激酶及轉(zhuǎn)錄因子等下游因子調(diào)節(jié)細胞功能，如AKT可通過激活NF-κB抑制劑IκB激酶降解，導(dǎo)致NF-κB活化，進而提高細胞的存活率[12]。此外，AKT還能抑制Caspase-9，從而阻止凋亡級聯(lián)反應(yīng)的啟動[13]。本研究顯示，隱丹參酮組PI3K膜易位與AKT磷酸化水平顯著減弱。高劑量隱丹參酮組PI3K膜易位與LY294002組結(jié)果類似，這與上述討論一致，提示PI3K/AKT信號通路被抑制。本次研究結(jié)果表明隱丹參酮可能通過抑制PI3K的激活導(dǎo)致AKT磷酸化下降。

研究證明，PI3K在白細胞趨化和超氧化物生成等功能的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[14]。氧自由基通過攻擊多不飽和脂肪酸（PUFA）引起脂質(zhì)過氧化，進而造成細胞代謝及功能紊亂。MDA是氧活性氧簇（ROS）介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的敏感指標(biāo)，能夠反映自由基對組織和細胞損傷程度，SOD是一種內(nèi)源性抗氧化酶，可抑制ROS的生成，能夠反映除去氧自由基的能力，臨床上常見二者結(jié)合檢測[15]。研究表明ROS的發(fā)展在腦卒中引起的組織損傷中起重要作用，在缺血再灌注的過程中，其可趨化前列腺素及白三烯，進而控制血管內(nèi)皮細胞功能[16]。本研究顯示，隱丹參酮組SOD水平明顯升高，MDA水平明顯降低，說明隱丹參酮可顯著降低腦卒中大鼠腦組織MDA水平及升高SOD水平，表明隱丹參酮對腦組織的脂質(zhì)過氧化損傷有一定的保護作用。

NO是由一氧化氮合酶（NOS）通過L-精氨酸（L-Arg）及氧催化的產(chǎn)物，其與心血管、神經(jīng)、胃、腎、肝臟等疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，其是一種新的免疫分子及炎癥介質(zhì)，可介導(dǎo)多種細胞因子病理活性，如內(nèi)毒素，腫瘤壞死因子（TNF-α）及白細胞介素-6（IL-6）等[17]。eNOS在血管功能調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，一方面其通過產(chǎn)生NO來擴張血管，另一方面可通過產(chǎn)生超氧化物造成血管收縮[18]。有研究顯示，蛋白質(zhì)谷胱甘肽化參與eNOS的氧化還原開關(guān)，其水平的增加與受損的、依賴于內(nèi)皮的血管擴張相關(guān)，因此能夠復(fù)位這一氧化還原開關(guān)對恢復(fù)正常NO合成酶功能尤為重要[19-20]。本研究顯示，腦卒中大鼠經(jīng)過不同濃度的隱丹參酮治療后，NO水平顯著升高，提示隱丹參酮可通過調(diào)節(jié)NO水平來擴張血管達到腦保護的作用。

綜上所述，隱丹參酮通過抑制脂質(zhì)過氧化、抗凋亡及保護血管等作用來抑制腦卒中大鼠PI3K/AKT-eNOS信號通路，從而起到腦保護作用，研究結(jié)果表明隱丹參酮是治療腦卒中潛在的藥物。

[參考文獻]

[1] 周紅霞，王興元，范利娟，等.阿托伐他汀在急性缺血性腦卒中患者中的臨床研究[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2016，32（1）：72-74.

[2] Wang W，Jiang B，Sun H，et al. Prevalence，incidence，and mortality of stroke in China：Results from a nationwide population-based survey of 480 687 adults[J]. Circulation，2017，135（8）：759-771.

[3] 趙楊，陸茵，鄭仕中，等.隱丹參酮的藥理作用研究進展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2010，37（11）：1839-1841.

[4] 錢倩宇，應(yīng)娜，楊貞.丹參酮ⅡA通過激活PPARα減輕4-HNE誘導(dǎo)的肝細胞損傷的機制研究[J].中國中藥雜志，2019（9）：1862-1868.

[5] Chen A，Zhao W，Lu Q，et al.Cryptotanshinone，a novel tumor angiogenesis inhibitor，destabilizes tumor necrosis factor-α mRNA via decreasing nuclear-cytoplasmic translocation of RNA-binding protein HuR[J]. Mol Carcinogen，2016，55（10）：1399-1410.

[6] Chen Z，Zhu R，Zheng J，et al. Cryptotanshinone inhibits proliferation yet induces apoptosis by suppressing STAT3 signals in renal cell carcinoma[J].Oncotarget，2017，8（30）：50 023-50 033.

[7] 江濱.現(xiàn)階段我國腦卒中流行特征及防治現(xiàn)狀對全科醫(yī)療服務(wù)的啟示和建議[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2019（30）：3653-3661.

[8] Morovatdar N，Thrift AG，Kapral MK，et al. Long-term outcomes of ischemic stroke of undetermined mechanism：A population-based prospective cohort[J]. Neuroepidemiology，2017，49（3-4）：160-164.

[9] 曾金，張志榮，繆萍，等.隱丹參酮的藥理作用研究進展[J].中成藥，2015，37（6）：1309-1313.

[10] 鄒偉，錢程，張婷婷，等.隱丹參酮對小鼠下肢缺血的保護作用研究[J].中藥藥理與臨床，2019，9（2）：40-45.

[11] 彭金麗，喻娟，段曉鵬，等.隱丹參酮PEG-PE納米膠束的制備、細胞攝取及誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的研究[J].中南藥學(xué)，2019，8（6）：47-49.

[12] 崔麗，寧忠平，劉穎.隱丹參酮抑制JNK/p38 MAPK信號通路對大鼠心肌細胞氧糖剝奪/復(fù)氧糖損傷的保護作用[J]. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2019，16（2）：164-169，174.

[13] Haicui Wu，Jianwei Zhang，Zhengao Sun，et al. Effects of electroacupuncture on expression of PI3K/Akt/Foxo3a in granulosa cells from women with shen （kidney）deficiency syndrome undergoing in vitro fertilization-embryo transfer[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine，2019， 25（4）：252-258.

[14] 張艷玲，譚娟，王顏剛，等.四味姜黃湯散對糖尿病腎病大鼠PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)作用[J].國際中醫(yī)中藥雜志，2019，41（4）：387-389.

[15] Dajun L，Huiping S，Ying L.Stanniocalcin-1 protects a mouse model from renal ischemia-reperfusion injury by affecting ROS-mediated multiple signaling pathways[J]. Int J Mol Sci，2016，17（7）：1051-1069.

[16] 魏薇，賴世超，謝勇，等.目標(biāo)溫度控制聯(lián)合PGE_1對心肺復(fù)蘇后大鼠腦微血管內(nèi)皮缺血再灌注損傷的保護[J].四川大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2016，47（3）：310-315.

[17] 湯銀娟，王建鈞，關(guān)瑩露.阿托伐他汀對高膽固醇血癥大鼠側(cè)支血管中LOX-1和eNOS表達的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2019（11）：1265-1272.

[18] 施思，雷少青，劉慧敏，等.酪醇對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及SIRT1/AMPK/eNOS信號通路在其中的作用[J].中華麻醉學(xué)雜志，2019，39（5）：552-555.

[19] 房裕鈔，王黎洲，黃學(xué)卿，等.微小RNA-155通過Notch信號通路對腦缺血-再灌注損傷的影響[J].介入放射學(xué)雜志，2019，8（7）：661-668.

[20] 梁小娜.復(fù)方丹參片及其成方對血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用和機制探討[J].中草藥，2019， 50（12）：2884-2890.

（收稿日期：2021-01-29）