唐總德 周琦人 李冰杰 劉健康 賀福元 朱志飛 周晉

〔摘要〕 目的 對身痛逐瘀湯的具體制備工藝展開研究，為其物質基準進一步研究提供科學性的基礎。方法 對身痛逐瘀湯煎煮、過濾、濃縮及干燥等一系列制備工藝過程進行單因素考察，對進行單因素考察后的樣品進行出膏率、浸出物以及指紋圖譜特征圖譜的含量測定，并作為關鍵指標參數(shù)，確定最佳制備工藝。結果 身痛逐瘀湯物質基準的制備工藝參照《醫(yī)林改錯》中身痛逐瘀湯處方，一錢為3.73 g，精密稱定全方共93.25 g，加入10倍量水，浸泡30 min，武火煮沸后加熱回流提取1 h，趁熱用200目紗布過濾，加入一定體積95%乙醇至含醇量為80%，放置24 h以上，抽濾，回收上清液，冷凍干燥，得凍干粉。工藝驗證結果表明該制備工藝穩(wěn)定。結論 本實驗得出的身痛逐瘀湯的制備工藝穩(wěn)定可行，將對身痛逐瘀湯物質基礎的研究提供依據(jù)，并為古代經典名方復方研究奠定基礎。

〔關鍵詞〕 經典名方;身痛逐瘀湯;物質基準;制備工藝;醫(yī)林改錯

〔中圖分類號〕R285? ? ? 〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.02.012

Study on the preparation process of substance standard of classic prescription

Shentong Zhuyu Decoction

TANG Zongde1， ZHOU Qiren1， LI Bingjie1， LIU Jiankang1， HE Fuyuan1，2，3， ZHU Zhifei1，2，3*， ZHOU Jin1，2，3*

（1. College of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Key

Laboratory of Druggability and Preparation Modification of TCM， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Laboratory of Supramolecular Mechanism and Mathematic-Physics Characterization for Chinese Materia Medica， Hunan University of

Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To study the specific preparation technology of Shentong Zhuyu Decoction and provide scientific basis for further study of its substance standard. Methods A series of preparation process of Shentong Zhuyu Decoction， such as decocting， filtering， concentrating and drying， were investigated by single factor， and the extraction rate， extract and fingerprint characteristics of the sample were determined after single factor investigation as the key index parameters to determine the best preparation process. Results The preparation process of the substance standard of Shentong Zhuyu Decoction was according to the prescription of Shentong Zhuyu Decoction in Correction of Errors in Medical Classics， Yiqian is 3.73 g， 93.25 g of Shentong Zhuyu Decoction was precisely weighed， 10 times of water was added， soaked for 30 min， boiled by high heat， refluxed for 1 h， filtered with 200 mesh gauze while hot， and added a certain volume of 95% ethanol by volume to 80% alcohol content， after 24 h， the supernatant was collected and lyophilized. Process validation results indicated that the preparation process was stable. Conclusion The preparation process of Shentong Zhuyu Decoction is stable and feasible， which will provide the basis for the study of substance standard of Shentong Zhuyu Decoction and lay the foundation for the study of ancient classic prescription.

〔Keywords〕 classic prescription; Shentong Zhuyu Decoction; substance standard; preparation process; Correction of Errors in Medical Classics

身痛逐瘀湯出自《醫(yī)林改錯》卷下，由秦艽、川芎、桃仁、紅花、甘草、羌活、沒藥、當歸、五靈脂、香附、牛膝、地龍12味藥物組成，具有活血行氣、袪瘀通絡、通痹止痛的功效，臨床常用于氣血阻滯經絡所致的肩痛、痹痛、腰痛、腿痛，或者周身疼痛、經久不愈者?，F(xiàn)代的醫(yī)學中，身痛逐瘀湯常用于治療肩周炎、頸椎病、腰椎間盤突出以及坐骨神經痛，還可以用來治療強直性脊柱炎等頑固性的疼痛性疾病，另外還用來治療由于筋膜炎導致的周身疼痛。古代經典名方復方制劑的質量研究比以前的6類新藥的要求更加嚴格，不僅強調制劑學工藝條件選擇，還強調制劑質量的均一性、穩(wěn)定性和傳遞性[1-2]。

《古代經典名方中藥復方制劑簡化注冊審批管理規(guī)定》[3]中指出經典名方的物質基準的制備工藝應遵循古法記載的制備方法，物質基準制備用飲片需按古法炮制才能使用，然古法炮制方法粗放，大多原理不明，前期研究已對身痛逐瘀湯中藥材對身痛逐瘀湯中各藥材的炮制方法進行古今文獻考察，確定了12味藥材的基原、道地性以及炮制方法，并采用單因素實驗與正交實驗法相結合確定身痛逐瘀湯各藥材最佳炮制工藝，以道地藥材為原料，測定各藥材《中華人民共和國藥典》[4]中指標成分含量以及浸出物含量，并作為單因素考察指標，從噴水量、噴淋次數(shù)、悶潤時間、切制規(guī)格、干燥溫度、炒制時間和炒制溫度等多方面進行考察，取最相關因素進行方差分析，建立單成分炮制火候模型，最終確定最佳炮制工藝[5]，為身痛逐瘀湯物質基準的制備工藝研究提供實驗基礎。

身痛逐瘀湯于《醫(yī)林改錯》中制備方法的記載僅有水煎服，顯然不足以制備出安全、規(guī)范的物質基準?！吨兴幗浀涿綇头街苿藴始逡旱纳陥筚Y料要求（征求意見稿）》[6]以水煎服的湯劑為例，給出了身痛逐瘀湯煎煮的具體步驟。經典名方制劑物質基準的制備為，將處方藥味經炮制得飲片，按原方處方劑量，浸泡煎煮后，以物理方法固液分離（過濾）、濃縮、干燥成型等工藝制得。所以，本實驗通過出膏率、浸出物以及特征指紋圖譜的含量測定為關鍵指標參數(shù)，對身痛逐瘀湯煎煮、過濾、濃縮及干燥等一系列制備工藝過程進行單因素考察，初步確定其最佳制備工藝，為身痛逐瘀湯物質基準進一步研究提供科學性的基礎。

1 實驗材料

1.1? 儀器

超高效液相色譜儀（美國Waters公司，型號：ACQUITY UPLC H-Class）;真空冷凍干燥機（美國GOLD-SIM公司，型號：FD5-3）;真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司，型號：DZF-6050）;實驗室低溫噴霧干燥機（上海雅程儀器設備有限公司，型號：YC-1800）;電子天平（上海良平儀器儀表有限公司，型號：MA110）;循環(huán)水式真空泵[鞏義市予華儀器有限責任公司，型號：SHZ-D（III）];超聲波清洗器（上?？茖こ晝x器有限公司，型號：SK3300H）。

1.2? 試劑與試藥

乙腈（批號：20075279）、甲醇（批號：20075141）均為色譜純，均購于美國天地試劑公司;磷酸為分析純（重慶川東化工有限公司，批號：20190629）;甲酸（批號：20190528）、乙酸（批號：20190603）、甲醇（批號：20200105）均為分析純，均購于太倉滬試試劑有限公司;水為怡寶純凈水（華潤怡寶飲料有限公司，批號：14310Z10J）;0.22 μm微孔濾膜（天津津騰實驗設備有限公司，批號：160531014）。對照品均購自上海源葉生物科技有限公司，包括龍膽苦苷（批號：Y30J9Q66926）、阿魏酸（批號：H27J7L16718）、苦杏仁苷（批號：Z28A6L2815）、羥基紅花黃素A（批號：R31A9F69105）、β-蛻皮甾酮（批號：T02A9F57640）、甘草苷（批號：Z13J11X108109）、肌苷（批號：TJ0623XA13）、紫花柴胡苷（批號：W07A10Z94862）、麝香草酚（批號：TN1112CB14）、α-香附酮（批號：Z08A10L94945）、原兒茶酸（批號：H21J9Z64031），純度均≥98%;飲片為經基原、道地性考證后的秦艽、川芎、當歸、沒藥、紅花、羌活、五靈脂、地龍、甘草、牛膝、香附原藥材，由湖南中醫(yī)藥大學藥學院石繼連教授按《中華人民共和國藥典》[4]有關項下進行鑒定，并由本課題組前期進行炮制工藝研究后精確炮制的12味飲片。

2 方法與結果

2.1? 關鍵指標參數(shù)的確定

2.1.1? 浸出物? 秦艽中的主要成分為環(huán)烯醚萜類、三萜類、甾體類、黃酮類等;川芎的主要成分為苯酞類、生物堿類以及有機酚酸類等;桃仁中多為苷類、脂質和糖類等成分;紅花中主要為黃酮類、木脂素類以及多炔類等成分以及一些微量元素;甘草中大多為三萜類、黃酮類、生物堿類及多糖類;羌活的主要成分為香豆素類、揮發(fā)油和糖類以及有機酸等;沒藥中的主要成分為揮發(fā)油、樹脂和樹膠等;當歸中多為揮發(fā)油、有機酸、黃酮類、多糖類及一些氨基酸;此外，五靈脂中主要有尿嘧啶、尿酸、原兒茶酸等有機成分，以及銅、鐵、硒等無機成分;香附中主要是揮發(fā)油類以及生物堿、黃酮類等多種化學成分;牛膝中主要成分為甾酮類、皂苷類等;地龍中主要為氨基酸類、核苷類和二肽類等成分[7-18]。中藥復方制劑為多成分指標，所以整體綜合考慮，選用乙醇作為浸出物提取溶劑，含量測定按照《中華人民共和國藥典》[4]醇溶性浸出物熱浸法測定。取供試品約2～4 g，精密稱定，置100～250 mL的錐形瓶中，精密加無水乙醇50～100 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量[4]。除另有規(guī)定外，以干燥品計算供試品中水溶性浸出物的含量。

浸出物=×100%

2.1.2? 指紋圖譜特征成分的含量? 以身痛逐瘀湯中具有代表性藥理作用的化學成分作為測定指標，按照《中華人民共和國藥典》[4]以及查閱相關文獻確定身痛逐瘀湯12味飲片含量測定的特征指標成分，前期預試驗測定了秦艽（龍膽苦苷、馬錢苷酸）、川芎（阿魏酸、綠原酸）、桃仁（苦杏仁苷）、紅花（羥基紅花黃色素A、山柰素）、甘草（甘草酸、甘草苷）、羌活（羌活醇、異歐前胡素、紫花前胡苷）、當歸（阿魏酸、阿魏酸苯乙醇酯）、牛膝（β-蛻皮甾酮）、五靈脂（原兒茶酸、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮等）、沒藥（麝香草酚）、香附（α-香附酮）、地龍（肌苷）的UPLC圖譜，因其他成分在指紋圖譜中響應低且分離度不佳，所以指認出龍膽苦苷（秦艽）、阿魏酸（川芎和當歸）、苦杏仁苷（桃仁）、羥基紅花黃色素A（紅花）、甘草苷（甘草）、紫花前胡苷（羌活）、麝香草酚（沒藥）、原兒茶酸（五靈脂）、β-蛻皮甾酮（牛膝）、α-香附酮（香附）、肌苷（地龍）12種成分。因此，選用這12味成分作為身痛逐瘀湯特征成分并測定含量優(yōu)選身痛逐瘀湯的制備工藝。色譜條件則按照《中華人民共和國藥典》[4]以及相關文獻中秦艽、川芎、桃仁、紅花、甘草、羌活、沒藥、當歸、五靈脂、香附、牛膝、地龍項下色譜條件進行測定[7-18]。

2.2? 樣品的制備

2.2.1? 對照品溶液的制備? 分別精密稱取龍膽苦苷、羥基紅花黃色素A、阿魏酸、β-蛻皮甾酮、甘草苷、苦杏仁苷、肌苷、紫花柴胡苷、麝香草酚、α-香附酮、原兒茶酸0.004 54、0.005 00、0.014 68、0.006 30、0.008 06、0.006 49、0.005 31、0.006 97、0.004 86、0.011 56 g，依此加入5 mL甲醇定容，即得各成分對照品溶液。

2.2.2? 供試品溶液的制備? 按《醫(yī)林改錯》卷下身痛逐瘀湯處方，一錢為3.73 g，精密稱定秦艽3.73 g、川芎7.46 g、桃仁11.19 g、紅花11.19 g、甘草7.46 g、羌活3.73 g、沒藥7.46 g、當歸11.19 g、五靈脂7.46 g（炒）、香附3.73 g、牛膝11.19 g、地龍7.46 g（去土），全方共93.25 g，加入水（6倍、8倍、10倍量），浸泡30 min，武火煮沸后加熱回流提取1 h，趁熱過濾，加入一定體積95%乙醇至含醇量為80%，放置24 h以上，抽濾，回收上清液，得生藥質量濃度為1 g/mL的全方樣品溶液，干燥（真空干燥、減壓干燥、冷凍干燥），取1 mL凍干粉，加入甲醇復溶，定容至5 mL，超聲5 min，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.3? 煎煮工藝

中藥復方制劑的煎煮工藝包括加水量、浸泡時間、煎煮時間、煎煮次數(shù)，依據(jù)中藥藥性和質地，浸泡時間一般為20～60 min，關于煎煮時間，解表類中藥煎煮時間宜短，煮沸后文火3～5 min即可;補益類中藥煎煮時間宜長，煮沸后文火慢煎30～60 min;貴重補益類中藥為了更好煎出有效成分可另煎2～3 h;除特殊煎藥次數(shù)的中藥（比如大黃一煎瀉下、二煎止瀉）外，每劑藥一般煎煮兩次，合并兩次藥液。考慮到身痛逐瘀湯作為復方的綜合性，所以要對煎煮工藝進行單因素考察，以提高其物質基準制備的精準性。

2.3.1? 加水量考察? 將“2.2.2”項下制備的不同加水量的5份身痛逐瘀湯樣品，按照“2.1.1”“2.1.2”項下條件分別測定出膏率、浸出物以及指紋圖譜特征含量，平行測定5次。結果得知，身痛逐瘀湯全方加10倍水下的出膏率、浸出物及指紋圖譜下特征含量相對較高，所以加水倍數(shù)選用10倍量。見表1、圖1。

2.3.2? 浸泡時間考察? 選取浸泡時間分別為20、30、60 min，按“2.2.2”項下分別煎煮，照“2.1.1”“2.1.2”項下條件分別測定出膏率、浸出物以及指紋圖譜特征含量，平行測定5次。結果的得知，浸泡30 min時出膏率、浸出物及特征指紋圖譜的含量較高，即身痛逐瘀湯加10倍水煎煮30 min最佳。見表2、圖2。

2.3.3? 煎煮時間考察? 按“2.2.2”項下分別煎煮全方0.5、1.0、1.5 h，按照“2.1.1”“2.1.2”項下條件分別測定出膏率、浸出物以及特征指紋圖譜含量，平行測定5次。結果得知，身痛逐瘀湯煎煮時間為1 h時出膏率、浸出物及特征指紋圖譜含量高，故選用煎煮時間1 h。見表3、圖3。

2.3.4? 煎煮次數(shù)考察? 按“2.2.2”項下分別進行一次煎煮和二次煎煮，照“2.1.1”“21.2”項下條件分別測定出膏率、浸出物以及指紋圖譜特征含量，平行測定5次。結果表明，二次煎煮的出膏率、浸出物含量較少，且指紋圖譜特征含量較少，為一次煎煮的一半及以下;飲片到物質基準的轉移率較低，一次煎煮中藥材中大部分的有效成分已溶出。即身痛逐瘀湯全方進行一次煎煮較為合理且經濟方便。見表4、圖4。

2.4? 干燥工藝

煎煮身痛逐瘀湯全方所使用的藥材是精致炮制后的飲片，該飲片無過多雜質。預實驗結果表明，用200目紗布過濾煎煮液后，紗布上無明顯附著物，濾液澄清無雜質，所以本實驗濾布使用200目紗布。身痛逐瘀湯處方中的當歸、川芎、羌活、紅花、沒藥、香附和桃仁都含有揮發(fā)性成分，其中大多數(shù)成分可作為指紋圖譜的特征成分。由于在濃縮過程中，揮發(fā)性成分遇熱易揮發(fā)，使飲片的傳遞性、穩(wěn)定性受到影響。其次，由于甘草、羌活、當歸等藥材中含有較多糖類，一旦濃縮會影響干燥時間和效果，干燥后粉末會極易吸濕，故本方不進行濃縮。這與經典名方復方制劑標準煎液申報資料的要求（即通過加強“濃縮、干燥方法對物料關鍵質量屬性的影響”從而保證物質基礎的穩(wěn)定）是一致的。

即按“2.2.2”項下煎煮后，將提取液分別進行真空干燥法、減壓干燥法、冷凍干燥法照“2.1.1”“2.1.2”項下公式條件分別測定出粉率、浸出物以及指紋圖譜特征含量，平行測定5次。結果得知，全方用真空干燥方法時出粉率較低，損失較大，減壓干燥法和冷凍干燥法的出膏率、浸出率相差不大，但冷凍干燥后的粉末中指紋圖譜特征含量較高，減壓干燥中溫度為105 ℃，冷凍干燥為-55 ℃，溫度高會使熱穩(wěn)定性差的成分損失，所以干燥用冷凍干燥較為適合。見表5、圖5。

2.5? 工藝總結及驗證

綜上，身痛逐瘀湯物質基準的制備工藝為按《醫(yī)林改錯》中身痛逐瘀湯處方，一錢為3.73 g，精密稱定全方共93.25 g，加入10倍量水，浸泡30 min，武火煮沸后加熱回流提取1 h，趁熱用200目紗布過濾，加入一定體積95%乙醇至含醇量為80%，放置24 h以上，抽濾，回收上清液，冷凍干燥，得凍干粉，即為身痛逐瘀湯物質基礎。此外，為驗證工藝的準確性及重現(xiàn)性，即取5批身痛逐瘀湯飲片，按上述最佳工藝煎煮、過濾、干燥，于“2.1.2”項下進樣測定，計算出膏率、浸出物及指紋圖譜特征含量的均值，得5批結果較穩(wěn)定，見表6-7。表明該制備工藝穩(wěn)定，可行。

3 討論

物質基準作為經典名方研究成功的關鍵所在，主要受藥材質量、炮制與制劑制備方法、評價方法要準、質量屬性傳遞等關鍵因素影響，前期研究[5]已經對身痛逐瘀湯中各藥材的炮制方法進行古今文獻考察，確定12味藥材的基原、道地性以及炮制方法，以及采用單因素實驗與正交實驗法相結合確定身痛逐瘀湯各藥材最佳炮制工藝，實現(xiàn)藥材質量穩(wěn)定和明確炮制工藝。本實驗通過出膏率、浸出物以及特征指紋圖譜的含量測定為關鍵指標參數(shù)，對身痛逐瘀湯煎煮、過濾、濃縮及干燥等一系列制備工藝過程進行單因素考察，初步確定了其最佳制備工藝。實現(xiàn)經典名方制備工藝穩(wěn)定后，還需實現(xiàn)經典名方的生產工藝與傳統(tǒng)工藝基本一致。如何實現(xiàn)“基本一致”是古代經典名方生產工藝研究的關鍵和核心問題。古代經典名方生產工藝“基本一致”，包括投料用飲片質量一致和生產工藝條件一致[19]。只有兩個一致性規(guī)律都得到闡明，才能全面闡明物質基準的質量屬性傳遞規(guī)律，以便控制質量一致。由于中藥材具生物多樣性，質量屬性處于動態(tài)變化之中，需建立適宜配投料方法以了解整體物質基準質量屬性量變傳遞規(guī)律來制訂標準的上下限。當遇到多基原或大處方物質基準的制備，面對天文般數(shù)目的搭配投料方式時，如何采用科學的小樣本搭配投料方式使其質量屬性具有代表性也是制劑學關鍵問題[20-24]。所以，需對身痛逐瘀湯這種基原較多、成分復雜的藥材，根據(jù)大均勻設計表解決配投料量方式，以尋得適應物質基準質量屬性穩(wěn)定和傳遞規(guī)律研究要求的制劑學方法，從而制訂出通用的物質基準的質量標準，實現(xiàn)均一、穩(wěn)定的目標。

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