蔣琳，武媛，黃文泉，郭建徠，邵益森，王偉

（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院口腔創(chuàng)傷整形科，南昌 330006）

舌鱗癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)患病率呈升高趨勢(shì)，但目前臨床上缺乏行之有效的靶向治療手段，同時(shí)該病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制未能深入闡述。

miRNA是一種長(zhǎng)度在17-25 nt的單鏈非編碼RNA，它們廣泛存在于真核細(xì)胞中，能通過(guò)降解靶mRNA或抑制其翻譯等手段，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化與凋亡，參與個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過(guò)程[1]。研究顯示miRNA既可作為原癌基因參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，又可作為抑癌基因參與惡性腫瘤的形成，其在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和機(jī)體發(fā)育、代謝等基本生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2-3]，并可以作為腫瘤早期診斷和治療的生物標(biāo)志物。

miR-492在多種腫瘤中均被發(fā)現(xiàn)表達(dá)異常，如宮頸癌、肝癌等。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)miR-492同腫瘤的化療耐藥有關(guān)。目前關(guān)于miR-492與舌鱗癌的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬探索miR-492在舌鱗癌組織中的表達(dá)及其同舌鱗癌患者臨床病理之間的關(guān)系，探討miR-492調(diào)控舌鱗癌增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，以期為舌鱗癌的治療提供新的思路，尋找新的治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 臨床標(biāo)本收集52例舌癌組織和24例癌旁組織（2 cm外舌體組織）標(biāo)本均來(lái)自江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科，患者手術(shù)時(shí)間2014年7月-2020年7月?；颊邽槌醢l(fā)舌癌且全身檢查未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，術(shù)前未行放化療及其他治療，手術(shù)方式均為舌頜頸聯(lián)合根治術(shù)。所有入選病例術(shù)后均得到組織病理確認(rèn)。手術(shù)切除的標(biāo)本立即放入液氮，在液氮中長(zhǎng)期保存。

1.2 組織總RNA提取 組織樣本的提取采用RecoverAll總核酸提取試劑盒（Ambion，USA）提取腫瘤組織及正常組織總RNA，SmartSpec Plus分光光度計(jì)（Bio-Rad，USA）對(duì)總RNA進(jìn)行定量。

1.3 cDNA合成與qRT-PCR取100 ng總RNA按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)程序：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min。按Taqman MicroRNA Assays（Applied Biosystems，USA）說(shuō)明檢測(cè)成熟的miRNA，以miR-492和U6作模板，miR-492和U6熒光探針作引物擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃45 s，95℃15 s，60℃15 s，45個(gè)循環(huán)，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 構(gòu)建過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)舌鱗癌細(xì)胞系 該實(shí)驗(yàn)選用舌鱗癌細(xì)胞株UM1，UM2細(xì)胞株，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)UM1和UM2，置于37°C恒溫、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)80%鏡下視野時(shí)用0.25%含EDTA胰酶消化傳代。所有細(xì)胞復(fù)蘇后常規(guī)傳代兩次，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。miR-492 mimics及LNA購(gòu)買(mǎi)于上海吉瑪公司，按照siPORT TM NeoFX TM轉(zhuǎn)染試劑（Ambion USA）說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染物進(jìn)入舌鱗癌細(xì)胞系，miR-492 mimics和control mimics分別加入U(xiǎn)M2細(xì)胞系，至終濃度45 nmol/L，24 h后，qRT-PCR檢測(cè)mi R-492的表達(dá)水平；miR-492 LNA和miR-492 LNA negative control組分別加入U(xiǎn)M1細(xì)胞系，至終濃度45 nmol/L，24 h后，qRTPCR檢測(cè)miR-492的表達(dá)水平。

1.5 細(xì)胞增殖檢測(cè) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對(duì)照舌鱗癌細(xì)胞鋪于96孔板，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至3×104/每孔加MTT溶液（5 mg/mL）20μL。繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，選擇570 nm波長(zhǎng)，MTT法實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞遷移檢測(cè) 待轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對(duì)照舌鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，消化離心后用無(wú)血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將含有1×105個(gè)細(xì)胞懸液加入不含基質(zhì)膠的小室，小室下層置5%血清培養(yǎng)基，孵育24小時(shí)后，棉簽輕輕擦去小室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，DAPI染色10 min，單蒸水洗滌后風(fēng)干，于倒置顯微鏡下觀察，拍照，每組細(xì)胞重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。

1.7 細(xì)胞侵襲檢測(cè) 基質(zhì)膠孵育Transwell小室24小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞轉(zhuǎn)移檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用單因素方差分析比較多項(xiàng)指標(biāo)。計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 mi R-492在癌旁正常組織及舌鱗癌組織中的表達(dá)情況qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-492在舌鱗癌組織中表達(dá)高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 癌旁正常組織及舌鱗癌組織中miR-492的表達(dá)情況（N:正常舌體組織，TSCC：舌鱗癌組織）

2.2 mi R-492的表達(dá)與舌鱗癌患者的臨床病理特征的關(guān)系miR-492的表達(dá)與T分期、臨床分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度均有相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

2.3 miR-492在不同舌鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá) 結(jié)果顯示：miR-492在舌鱗癌細(xì)胞（UM1，UM2）中表達(dá)高于正常細(xì)胞（HaCat），miR-492在UM1中表達(dá)較高，在UM2中表達(dá)較低。

圖2 miR-492的表達(dá)與舌鱗癌患者的臨床病理特征的關(guān)系（A）舌鱗狀細(xì)胞癌患者組織標(biāo)本中T3+4的miR-492表達(dá)顯著高于T1+2；（B）舌鱗狀細(xì)胞癌患者組織標(biāo)本中臨床分期CIII+IV的miR-492表達(dá)顯著高于臨床分期CI+II；（C）頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性舌鱗狀細(xì)胞癌患者的miR-492表達(dá)顯著高于頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者；（D）舌鱗狀細(xì)胞癌患者組織標(biāo)本中病理分級(jí)為中低分化的miR-492表達(dá)顯著高于高分化病理分級(jí)。＊＊P＜0.05。

圖3 miR-492在不同舌鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況

2.4 沉默miR-492對(duì)舌鱗癌細(xì)胞體外增殖侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響 為探討舌鱗癌細(xì)胞沉默miR-492后對(duì)增殖，侵襲遷移能力的影響，我們采用mi R-492 LNA抑制UM1細(xì)胞mi R-492的表達(dá)，結(jié)果顯示：UM1經(jīng)miR-492 LNA處理后細(xì)胞的OD值較對(duì)照組明顯降低，說(shuō)明細(xì)胞增殖能力減弱（P<0.05）（圖4A）；遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-492 LNA組穿膜細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組顯著下降，說(shuō)明其遷移能力明顯受到抑制（P<0.05）（圖4B）；侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-492 LNA組穿膜細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組顯著下降，說(shuō)明其侵襲能力亦明顯受抑制（P<0.05）（圖4C）。

2.5 過(guò)表達(dá)mi R-492對(duì)舌鱗癌細(xì)胞體外增殖侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響 為進(jìn)一步探討舌鱗癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-492后對(duì)增殖，侵襲遷移能力的影響，我們采用miR-492 mimics使UM2細(xì)胞中mi R-492的表達(dá)上調(diào)，結(jié)果顯示：UM2經(jīng)miR-492 mimics處理后細(xì)胞的OD值較對(duì)照組明顯升高，說(shuō)明細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（P<0.05）（圖5A）；遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：mi R-492 mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組顯著升高，說(shuō)明其遷移能力明顯增強(qiáng)（P<0.05）（圖5B）；侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-492 mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組顯著升高，說(shuō)明其侵襲能力亦明顯增強(qiáng)（P<0.05）（圖5C）。

圖4 沉默miR-492對(duì)舌鱗癌細(xì)胞體外增殖侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響（A）舌鱗狀細(xì)胞株UM1經(jīng)miR-492 LNA處理后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞的OD值下降，增殖能力減弱；（B）UM1細(xì)胞的遷移能力（C）和侵襲能力（D）明顯受到抑制。＊＊P＜0.05。

圖5 過(guò)表達(dá)miR-492對(duì)舌鱗癌細(xì)胞體外增殖侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響（A）舌鱗狀細(xì)胞株UM2經(jīng)miR-492 mimi cs處理后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞的OD值升高，增殖能力增強(qiáng)；（B）UM1細(xì)胞的遷移能力（C）和侵襲能力（D）明顯增強(qiáng)。＊＊P＜0.05。

3 討論

miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度為17-25nt的單鏈非編碼RNA，通過(guò)與靶基因mRNA互補(bǔ)位點(diǎn)的結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)[4]。除了被人們所熟知的細(xì)胞質(zhì)miRNA之外，miRNA也存在于細(xì)胞的膜結(jié)合區(qū)如分泌性小泡[5-6]和線(xiàn)粒體[7-8]中。人類(lèi)細(xì)胞中約1/3的蛋白編碼基因受到miRNA的調(diào)控。因此miRNA與它們的標(biāo)靶分子組成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，控制機(jī)體的重要生命活動(dòng)。越來(lái)越多的研究表明，miRNA具有原癌基因或者抑癌基因的作用，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)水平的異常與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

miR-492已經(jīng)在多種惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)同腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)。有國(guó)外學(xué)者研究表明肝細(xì)胞癌中miR-492的表達(dá)在肝癌組織中表達(dá)升高，在正常組織中表達(dá)降低，而且通過(guò)mi R-492-PTEN-AKT途徑調(diào)控肝癌的進(jìn)展[9]。段永恒等采用Affymetrix miRNA 4.0芯片篩查宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于未轉(zhuǎn)移患者，轉(zhuǎn)移患者中miR-658和miR-492上調(diào)最為顯著[10]。亦有學(xué)者報(bào)道，在一些腫瘤中miR-492的表達(dá)降低。在腎透明細(xì)胞癌中，miR-492的表達(dá)較正常組織低[11]。有研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌復(fù)發(fā)患者中miR-492的表達(dá)較原發(fā)前列腺癌患者的表達(dá)降低[12]。劉長(zhǎng)征等學(xué)者指出，在肝內(nèi)及肝外膽管癌中，miR-492同其他5個(gè)miRNA的表達(dá)均降低[13]。與此同時(shí)，有學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)肝癌、肝臟良性腫瘤患者以及正常人血清中的miR-492的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13]。

盡管對(duì)于miR-492在不同腫瘤中的表達(dá)的研究結(jié)果各異，在機(jī)制方面仍然需進(jìn)一步的研究。目前已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了miRNA與腫瘤化療耐藥的相關(guān)性。有學(xué)者探討了miR-492在結(jié)腸癌細(xì)胞LS174T奧沙利鉑耐藥中的作用，結(jié)果顯示：與LS174T細(xì)胞相比較，耐藥細(xì)胞中mi R-492表達(dá)減少，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)CD147的表達(dá)調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的奧沙利鉑耐藥[14-15]。

舌鱗癌是頭頸鱗狀細(xì)胞癌中最常見(jiàn)的種類(lèi)，因其具有較強(qiáng)的侵襲性且死亡率較高，因而從分子層面出發(fā)的治療手段相關(guān)的研究具有重要的臨床意義[16]。目前miR-492與舌鱗癌的相關(guān)行研究未見(jiàn)報(bào)道。本課題組的前期研究顯示miR-492在舌鱗癌組織中高表達(dá)，在正常舌體組織中低表達(dá)。

miRNA在腫瘤中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜，本課題組的研究顯示miR-492的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，而miR-492表達(dá)的抑制可以導(dǎo)致舌鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力的降低，提示miR-492參與到舌鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的調(diào)控。但是其中具體的機(jī)制尚且不明。

綜上所述，本研究顯示，miR-492具有促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的作用，下調(diào)表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，反之，上調(diào)其表達(dá)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)行為。miR-492是參與舌鱗癌生物學(xué)行為的靶點(diǎn)。